Name: Kromatin Etkileşimler haritalama ve Transkripsiyon Yönetmelik anlamak için paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: Öğrenin ChIA-PET ile kromatin etkileşimlerini haritalama ve transkripsiyonel düzenlemeyi anlama yöntemini. Bu protokol, kromatin immünopresipitasyonu ve kütüphane yapımı adımlarını içerir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Singapur A * STAR tarafından desteklenmektedir. Buna ek olarak, MJF Bilim Bursu ve Lee Kuan Yew Doktora Sonrası Araştırma Bursu kadınlar için bir A * STAR Ulusal Bilim Bursu, bir L&#39;Oreal tarafından desteklenmektedir. YR NIH KODLAMASI hibe (R01 HG004456-01 ve R01 HG003521-01) tarafından desteklenmektedir. Yazarlar ayrıca video düzenleme ve için Bayan Michelle Teo için Bayan Siti Rahim sahneleri filme özellikle Sayın Kelvin Issey, Bay Chang Kai Xiang ve Sayın Sherwin Gan 8 Piksel Productions, Singapur, videografisi ekibi kabul voice-over.

<ol><li>Cai, S., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SATB1+packages+densely+looped%2C+transcriptionally+active+chromatin+for+coordinated+expression+of+cytokine+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">SATB1 packages densely looped, transcriptionally active chromatin for coordinated expression of cytokine genes.</a> Nat. Genet. 38, 1278-1288 (2006).</li>
<li>Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+of+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The organization of replication and transcription.</a> Science. 284, 1790-1795 (1999).</li>
<li>Das, P. M., Ramachandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37, 961-969 (2004).</li>
<li>Deng, W., Blobel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+chromatin+loops+provide+epigenetic+gene+expression+states%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Do chromatin loops provide epigenetic gene expression states.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 548-554 (2010).</li>
<li>Fullwood, M. J., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 21, 21-25 (2010).</li>
<li>Fullwood, M. J., Liu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462, 58-64 (2009).</li>
<li>Jackson, D. A., Hassan, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+focal+sites+of+transcription+within+human+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Visualization of focal sites of transcription within human nuclei.</a> EMBO J. 12, 1059-1065 (1993).</li>
<li>Li, G., Fullwood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIA-PET+tool+for+comprehensive+chromatin+interaction+analysis+with+paired-end+tag+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">ChIA-PET tool for comprehensive chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing.</a> Genome Biol. 11, R22(2010).</li>
<li>Li, G., Ruan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Promoter-Centered+Chromatin+Interactions+Provide+a+Topological+Basis+for+Transcription+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive Promoter-Centered Chromatin Interactions Provide a Topological Basis for Transcription Regulation.</a> Cell. 148, 84-98 (2012).</li>
<li>Ng, P., Wei, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired-end+diTagging+for+transcriptome+and+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Paired-end diTagging for transcriptome and genome analysis.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. Chapter 21, 12(2007).</li>
<li>Nowak, D. E., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39, 715-725 (2005).</li>
<li>Osborne, C. S., Chakalova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li>
<li>Rippe, K., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+at+a+distance%3A+DNA-looping+and+initiation+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Action at a distance: DNA-looping and initiation of transcription.</a> Trends Biochem. Sci. 20, 500-506 (1995).</li>
<li>Schoenfelder, S., Sexton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat. Genet. 42, 53-61 (2010).</li>
<li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694-698 (2006).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Chia-PET transkripsiyon regülasyonu uzun menzilli etkileşimleri tanımlamak için geliştirilmiş bir yöntemdir. Bir Chia-PET kütüphane kalitesini belirleyen önemli faktörlerden biri ChIP malzeme kalitesidir. Video gösterilen protokol hücre çapraz-bağlamak için EGS ve formaldehit kullanımını içerir. Uzun ayırıcı kolu taşıyan ikinci bir çapraz bağlama reaktifi ile birlikte formaldehit tek başına kullanımı 3,11,15 formaldehit bağlı olamazdı proteinlerin bağlanmasında yardımcı olabilir. Biz sağlam bağlayıcı siteleri ve uzun menzilli etkileşimleri 9 göstermiştir bu yöntem ile kütüphaneler inşa ettik. Ancak, çapraz bağlama ve ChIP koşulları ilgi her faktör için optimize edilmeli ve çapraz bağlama çok sonication tarafından parçalanma zorluklara neden olacak gibi değil aşırı kroslink önemlidir ve muhtemelen sahte kromatin etkileşimleri neden olabilir . Kromatin etkileşimleriChia-PET tarafından tanımlanan tür floresan in-situ hibridizasyon 4 gibi farklı bir yöntem ile valide edilmelidir. Biz kromatin malzeme 100 ng asgari öneririz. Biz kromatin malzeme 50 ng kaliteli kütüphaneler inşa ederken, biz başlangıç ​​materyali büyük miktarlarda izin verdiğini gözlemledim az 16 PCR döngüleri, böylece minimize amplikonlarının ve her kütüphane artıklık ile Chia-PET kütüphanelerinin yapımı. Bu düşük artıklık böylece sıralama daha az şeritli daha kapsamlı bir kromatin etkileşim haritası sağlayan, yüksek benzersiz eşlenen etiketleri ve ayrıca kullanılabilir veri oranı yüksek korelasyon. Her bir tüp içinde boncuk nihai paketlenmiş hacim sırasıyla manyetik ve Sepharose boncuklar için 50 ul ve 100 ul olmalıdır. Dolu boncuk hacmi belirtilenden daha az ise, DNA taşıyan boncuk kaybını en aza indirmek için benzer önceden temizlenmiş boş manyetik ya Sepharose boncuklar ile minimum dolu ses getirmeksonraki adımlarda s. Sawed-off ipucu ya da çok-çekirdekli kriteri Sepharose boncuklar pipetleme için kullanılmalıdır. Aşağıdaki değişiklikler önceden yayınlanmış Chia-PET protokolü 5 takiben dahil edildi. Öncelikle, manyetik G boncuk yıkama sırasında numune kaybını minimize etmek için kullanılmıştır. Ayrıca, kendi kendine bağlanan yarım bağlayıcılar ve / veya adaptörler amplikonlarının olacak 100 bp ve 138 bp yaklaşık boyutları ile non-spesifik bantları belirlendi. Bu yüzden, PCR amplifikasyon sırasında spesifik olmayan şeritler en aza indirmek için biyotinile yarı-bağlayıcılara ve 454 GS20 adaptörleri konsantrasyonu azalır. Yakınlığı ligasyonu hacmi sonraki saflaştırma adımları sırasında numune kaybını en aza indirmek ve aynı zamanda reaktif maliyetlerinde tasarruf için 50 ml 10 ml düşürülmüştür. Biz de streptavidin boncuklar üzerinde Chia-PET DNA maksimal yakalama sağlamak için boncuk Chia-PET DNA sabitlemek için inkübasyon süresi arttı. Yakınlığı ligasyonu adım sırasında, kimerik ligasyonu that kaçınılmaz bir spesifik olmayan ve rasgele bir şekilde üretilir vivo kromatin etkileşimleri gerçek temsil etmemektedir. Bu nedenle, herhangi bir Chia-PET deneme veri kalitesini değerlendirmek için, kimerizm oranı belirli nükleotid barkod TAAG ve ATGT 5 ile iki farklı yarı linkers kullanımı tahmin edilmektedir. Yüksek verimli sekanslama sonra, Chia-PET dizileri ilk 8 ayırt edilebilen belirli Ligasyon ürünleri ve non-spesifik ürünlerden elde edilen ligasyon bağlayıcının barkod kompozisyon ve sekansları için analiz edilir. Bilinen kimeralar yüzdesi (yani heterodimerler AB linkers) bizim in-house MCF-7 RNA Polimeraz II Chia-PET kütüphaneler az% 15 sunuyoruz. Chia-PET dizileri sonradan olmak üzere iki kategoride, kendinden ligasyonu PET ve inter-ligasyon PET ayrılır. Arası ligasyon PET ı elde edilir kendinden-ligasyon PET kromatin fragmanlarının kendi Sirkülasyon ligasyon elde edilmiştiriki farklı DNA parçaları arasında nter-ligasyonu. İkincisi daha sonra aynı kromozom (intrachromosomal arası ligasyonu PET) veya iki etiketi iki farklı kromozom (interchromosomal arası ligasyonu PET) eşlenen her etiketi genomik mesafeye göre üç farklı kategoride alt grupları oluşturmaktadır. Biz farklı kategorilerde 8 dışarı sıralamak için bir Chia-PET aracı yazılım paketi geliştirdik. Bu kütüphane olan DNA fragmanları üzerinde bağlı olacaktır. Genellikle, küçük ChIP parçaları daha yüksek bir çözünürlüğe vermek ve 4 kb hakkında bu RNA Polimeraz II Chia-PET kütüphaneler için kesecek. Buna ek olarak, gerçek kromatin etkileşimleri bir etkileşim kümedeki arası ligasyonu PET sayısını sayarak rastgele gürültü ayırt edilebilir, diğer bir deyişle, yüksek PET sayısı bir küme gerçek kromatin etkileşimi 8 olma ihtimali daha yüksek olduğu söyleniyor . Bir yalancı pozitif filtrelemek içinrastgele tesadüflerle arası ligasyonu PET oluşabilir zenginleştirilmiş çapa yükselecek, bir istatistiksel analiz çerçevesi de iki ankraj 8 arasındaki inter-ligasyon PET rasgele oluşumu için hesap için formüle edilmiştir. Sonuç olarak, Chia-PET tekniği küresel ölçekte kromatin etkileşim ağları haritalama sağlar. Chia-PET ChIP uygulanması kütüphanesi karmaşıklığı ve arka plan gürültüsünün azalmasını sağlar. Buna ek olarak, belirli ChIP transkripsiyon faktörleri 5 ile bağlantılı spesifik kromatin etkileşimlerin inceleme sağlayan, kromatin etkileşimleri için özgüllüğü ekler.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> % 4-20 gradyanı TBE jel </td><td> Invitrogen </td><td> EC6225BOX </td><td> B, 6.3 Adım </td></tr><tr><td> PEG ile 5 x T4 DNA Ligaz Tamponu </td><td> Invitrogen </td><td> 46300018 </td><td> B aşaması, 2.2 </td></tr><tr><td> % 6 TBE jeli </td><td> Invitrogen </td><td> EC6263BOX </td><td> B, 6.8 Adım </td></tr><tr><td> Agilent DNA 100 Testi </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-1504 </td><td rowspan="3"> B aşaması, 7.1 </td></tr><tr><td> Agilent Yüksek Hassasiyet DNA Testi </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td> Agilent Bioanalyzer 2100 </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2940CA </td></tr><tr><td> (Spin-X) Tüp Filtreler santrifüjleyin </td><td> Corning &lt;/ Td&gt; <td> CLS8160 </td><td> Adım B, 3.7 ve 6.9 </td></tr><tr><td> Koyu Okuyucu transilluminator </td><td> Clare Kimya Araştırma </td><td> DR46B </td><td> B, 6.8 Adım </td></tr><tr><td> Dijital Sonifier Hücre bölücü </td><td> Branson </td><td> 450D-0101063591 </td><td> A, 4.3 Adım </td></tr><tr><td> DynaMag-2 mıknatıs (Manyetik Parçacık Yoğunlaştırıcı) </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td> Adımları yıkama tüm manyetik boncuk, A, 7.5.1 Adım Adım B </td></tr><tr><td> DynaMag-15 Mıknatıs (Manyetik Parçacık Yoğunlaştırıcı) </td><td> Invitrogen </td><td> 123.01D </td><td> A, 5 ve 6 Adım </td></tr><tr><td> DynaMag-PCR (Manyetik Parçacık Yoğunlaştırıcı) </td><td> Invitrogen </td><td> 49-2025 </td><td> B, 6.5 Adım </td></tr><tr><td> Escherichia coli DNA polimeraz I </td><td> NEB </td><td> M0209 </td><td> B, 5.6 Adım </td></tr><tr><td> GlycoBlue </td><td> Ambion </td><td> AM9516 </td&gt; <td> A, 7.5.1 Adım B, 4.3 ve 6.5 Adım </td></tr><tr><td> Illumina CBOT Küme Üretim Sistemi </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td> B aşaması, 7.4 </td></tr><tr><td> Illumina Genom Analyzer IIx </td><td> Illumina </td><td> SY-301-1301 </td><td> B aşaması, 7.5 </td></tr><tr><td> Illumina PE astar </td><td> Illumina </td><td> PE-102-1004 </td><td> Adım B, 5.4 (gerekli ise) </td></tr><tr><td> Intelli-Mikser </td><td> Palico Biyoteknoloji </td><td> RM-2L </td><td> , Rotasyon ile herhangi inkübasyonlar B Adım </td></tr><tr><td> LightCycler 480 Real-Time PCR Sistemi </td><td> Roche </td><td> 04 640 268 001 </td><td> A, Adım B 7.5.3, 7.3 Adım </td></tr><tr><td> LightCycler480 DNA SYBR Green I MasterMix </td><td> Roche </td><td> 03 752 186 001 </td><td> Adım B, 7.5.3 </td></tr><tr><td> M-280 Streptavidin Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 11206D </td><td> B, 5.2 Adım </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Manyetik (Dynabeads) Protein G </td><td> Invitrogen </td><td> 100.03D </td><td> A, 5.1.1 ve 5.2.1 Adım </td></tr><tr><td> Yüksek Yoğunluk (2ml) MaXtract </td><td> Qiagen </td><td> 129056 </td><td> A, Adım 7.5.1 </td></tr><tr><td> Yüksek yoğunluklu (50ml) MaXtract </td><td> Qiagen </td><td> 129073 </td><td> B aşaması, 4.2 </td></tr><tr><td> MmeI </td><td> NEB </td><td> R0637 </td><td> R0637 </td></tr><tr><td> RNaz ONE Ribonükleaz </td><td> Promega </td><td> M426C </td><td> B aşaması, 4.8 </td></tr><tr><td> RNA polimeraz II (8WG16) monoklonal antikor </td><td> Covance </td><td> MMS-126R </td><td> A, Adım 5.2.4 </td></tr><tr><td> Oak Ridge Santrifüj Tüpleri (Polipropilen) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td> A, 3.1 Adım </td></tr><tr><td> Oak Ridge Santrifüj Tüpleri (Teflon FEP) </td><td> Nalgene </td><td> 3114-0050 </td><td> B aşaması, 4.3 </td></tr><tr><td> Phusiyon High Fidelity Master Mix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td> B, 6 Adım </td></tr><tr><td> PicoGreen (Quant-iT) dsDNA Reaktif </td><td> Invitrogen </td><td> P11495 </td><td> A, 7.5.2 Adım </td></tr><tr><td> Polistiren Yuvarlak Dip Tüp </td><td> BD Biosciences </td><td> 352057 </td><td> A, 4.1 Adım </td></tr><tr><td> Proteaz İnhibitör Kokteyl tabletler (tam, EDTA-ücretsiz) </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> A, 1.6 yılından Adım </td></tr><tr><td> Proteinaz K Çözüm (20mg/ml) </td><td> Fermentas </td><td> E00491 </td><td> 7.5.1, 4.4 Adım A B aşaması, 4.1 </td></tr><tr><td> T4 DNA Ligaz </td><td> Fermentas </td><td> EL0013 </td><td> Adım B, 2.2, 3.9 ve 5.4 </td></tr><tr><td> T4 DNA Ligaz Tamponu (NEB) </td><td> NEB </td><td> B0202S </td><td> Adım B, 3.3 ve 3.9 </td></tr><tr><td> T4 DNA polimeraz </td><td> Promega </td><td> M4215 </td><td>B aşaması, 1.2 </td></tr><tr><td> T4 DNA polinükleotid kinaz </td><td> NEB </td><td> M0201 </td><td> B, 3.3 Adım </td></tr><tr><td> TruSeq SBS Takımı v5-GA </td><td> Illumina </td><td> FC-104-5001 </td><td> Illumina Genom Analyzer IIx sistemi için Regents </td></tr><tr><td> TruSeq PE Küme Takımı v2-CBOT-GA </td><td> Illumina </td><td> PE-300-2001 </td><td> Illumina CBOT Küme Üretim Sistemi ile kullanım olmak </td></tr><tr><td> SYBR Green I </td><td> Invitrogen </td><td> S-7585 </td><td> Adım B, 6.3 ve 6.8 </td></tr><tr><td> XCell SureLock Mini Hücre Elektroforez Sistemi </td><td> Invitrogen </td><td> EI0001 </td><td> Adım B, 6.3 ve 6.8 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td colspan="2"> Sıra </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td rowspan="2"> Biyotinile yarı-bağlayıcı A (200ng/μl) </td><td> Üst </td><td> 5 &#39;GG CCG CGA / iBiodT / ATC TTA TTK AAC 3&#39; </td><td> 250 nmole ölçekte HPLC Saflaştırılmış İç Biotin dT (9) </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;GTT GGA TAA GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmole ölçekte HPLC Saflaştırılmış </td></tr><tr><td rowspan="2"> Biotinlenmiş yarım linkers B (200ng/μl) </td><td> Üst </td><td> 5 &#39;GGC CGC GA / iBiodT / ATA CAT TTK AAC 3&#39; </td><td> 250 nmole ölçekte HPLC Saflaştırılmış İç Biotin dT (9) </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;GTT GGA ATG TAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmole ölçekte HPLC Saflaştırılmış </td></tr><tr><td rowspan="2"> Sigara biotinlenmiş yarım linkers (200ng/μl) </td><td> Üst </td><td> 5 &#39;GGC CGC GAT ATC GGA TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmole ölçekli PCR Sınıf </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;GTT GGA TCC GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmole ölçekli PCR Sınıf </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 Adaptör A (200ng/μl) </td><td> Üst </td><td> 5 &#39;CCA TCT CAT CCC TGC GTG TTK CATCTG TTC SKK CCC TGT CTC AGN N 3 &#39; </td><td> 250 nmole ölçekli PCR Sınıf </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5&#39;CTG AGA CAG GGA GGG AAC AGA TGG GAC ACG CAG GGA TGA GAT GG 3 &#39; </td><td> 250 nmole ölçekli PCR Sınıf </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 Adaptör B (200ng/μl) </td><td> Üst </td><td> 5 &#39;CTG AGA CAC GKRY ACA GGG GAT AGG CAA GGC ACA CAG GGG ATA GG 3&#39; </td><td> 250 nmole ölçekli PCR Sınıf </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;CCT ATC CCC TGT GTG SKK TGC CTA TTK SKK GTT GCG TGT CTC AGN N 3&#39; </td><td> 250 nmole ölçekli PCR Sınıf </td></tr><tr><td rowspan="2"> Illumina-NN adaptörleri </td><td> Üst </td><td> 5 &#39;ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TC 3&#39; </td><td> 250 nmole ölçekte HPLC saflaştırılmış Adım B, 5.4 &#39;e bakınız </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;fosfat - GAT CGG AAG AGC GGT TCA GKRY GGA ATG CCG AG 3&#39; </td><td> 250 nmole ölçekte HPLC saflaştırılmış 5 &#39;ucu Adım B, 5.4&#39; e bakınız fosforile </td></tr><tr><td> Illumina 1-454 (ileri) astar (10 uM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACC CTA TTK SKK GTG TGC CTT G 3&#39; </td><td> 250 nmole ölçekli PCR Sınıf </td></tr><tr><td> Illumina 2-454 (ters) astar (10 uM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GKRY GAA GAC GGC ATA CGA GAT CGG TCC ATC TCA TCC CTG CGT GTC 3&#39; </td><td> 250 nmole ölçekli PCR Sınıf </td></tr><tr><td> qPCR Primer 1,1 (10 uM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;3 saat AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG&#39; </td><td> 10nmole ölçekli PCR Sınıf </td></tr><tr><td> qPCR Primer 2,1 (10 uM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GKRY GAA GAC GGC ATA CGA 3&#39; </td><td> 10nmole ölçekli PCR Sınıf </td></tr><tr><td> Illumina 3-454 dizileme astar (100 uM) </td><td colspan="2"> 5&#39;TGC GTG TTK CAT CTG TTC SKK CCC TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmole ölçekte HPLC Saflaştırılmış </td></tr><tr><td> Illumina 4-454 dizileme astar (100 uM) </td><td colspan="2"> 5&#39;GTG SKK TGC CTA TTK SKK GTT GCG TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmole ölçekliHPLC Saflaştırılmış </td></tr></tbody></table> Entegre DNA Technologies (IDT) ve aynı şekilde bağlayıcı ve adaptörleri hazırlamak gelen Oligolar ve adaptörler Tablo. Sipariş Oligolar önce 10 nitelendirdi. Yarı-bağlayıcı ve adaptörler -20 ° C&#39;de birkaç ay önceden hazırlanmalı ve saklanabilir

kromatin etkileşimler haritalama ve transkripsiyon yönetmelik anlamak için paired-end tag dizileme (chia-pet) ile kromatin etkileşim analizi

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomları mikron büyüklüğünde nükleer uzaylar 7 içindeki üst düzey konformasyonları, 2, 12 benimseyerek, üç boyutlu yapıları halinde düzenlenmiştir. Böyle mimarileri rastgele değildir ve gen destekçileri ve düzenleyici unsurları 13 arasındaki etkileşimleri içerir. Belirli düzenleyici dizileri transkripsiyon faktörleri bağlayıcı transkripsiyon regülasyonu ve koordinasyon 1, 14 bir ağ beraberinde getirmektedir. Paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi bu yüksek mertebeli kromatin yapılarına 5,6 tanımlamak için geliştirilmiştir. Hücreler sabit ve etkileşen loci kovalent DNA-protein çapraz bağlantıları tarafından yakalanır. Non-spesifik gürültü en aza indirmek ve karmaşıklığı azaltmak, hem de kromatin etkileşim analizi özgüllüğünü artırmak için, kromatin immünopresipitasyon (çip) yakınlık ligasyon önce ilgi çekici parçaları kromatin zenginleştirmek için spesifik protein faktörlere karşı kullanılır. Yarım linkers içeren Ligasyonu sonradan bireysel kromatin kompleksleri içinde birlikte gergin DNA parçalarının çiftleri arasındaki kovalent bağlantılar oluşturur. Yarım linkers in sınırdaş MmeI restriksiyon enzimi siteleri MmeI sindirim eşleştirilmiş bitiş etiketi-linker-tag yapıları (PET) çıkarımı izin verir. Yarı-linkerler biotinlenmiş olduğu için, bu PET yapıları streptavidin-manyetik boncuklar kullanılarak arıtılır. Arıtılmış PET nesil dizileme adaptörler ve etkileşim parçaları bir katalog gibi Illumina Genom Analyzer gibi yeni nesil sequencer ile oluşturulan ile bağlandı edilir. Haritalama ve biyoinformatik analizi ardından 8 siteleri ChIP-zenginleştirilmiş bağlama ve ChIP zenginleştirilmiş kromatin etkileşimleri belirlemek için yapılır. Biz ChIP kalitesini bir Chia-PET kütüphane sonucu önemli bir rol oynar gibi özellikle Chia-PET protokolü, ChIP hazırlanması kritik yönlerini göstermek için bir video hazırladık. Protokolleri olduğundanÇok uzun, ancak kritik adımlar video gösterilir.

Paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi için kullanılan bir yöntemdir<em&gt; De novo</emTranskripsiyonel kontrolü daha iyi anlaşılması için kromatin etkileşimlerin&gt; algılama.

Kromatin Etkileşimler haritalama ve Transkripsiyon Yönetmelik anlamak için paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi

Genomlar, mikron boyutundaki nükleer alanlar içerisinde yüksek dereceli konformasyonlar benimseyerek üç boyutlu yapılar şeklinde organize olurlar 7, 2, 12. Bu tür...

Toz ve etiket sekanslama kullanılarak yapılan COMIN etkileşim analizi, genom çapında uzun menzilli COMIN etkileşim analizine yönelik bir yöntemdir. Kısaca, buna magic share pad diyoruz. Bu yöntem birçok moleküler biyoloji adımı içerir ve karmaşık olabilir.Bu nedenle, takip eden videoda, kromatin immünopresipitasyonun ve ChIA-PET analizi için kütüphane kurulumunun temel adımlarından bazılarını size göstereceğiz. Chip olarak bilinen kromatin immünopresipitasyonu, bir ChIA-PET kütüphanesi oluşturmanın ilk kritik adımıdır. Burada, hücre kültürlerinden alınan kromatin örnekleri çapraz bağlanır, sonikasyona tabi tutulur ve immünopresipite edilir.Ardından, çip DNA'sının ayrı alikotları barkodlu yarı bağlayıcılara (half linkers) bağlanır ve yakınlık ligasyonu gerçekleştirilir. Pet'ler restriksiyon sindirimi ile serbest bırakılır, kaplamalı manyetik boncuklar üzerinde saflaştırılır ve yeni nesil dizileme için adaptörlere bağlanır. Kimera sandalye pet'leri, AB bağlayıcı kompozisyonu ve etiket yan dizilimleri aracılığıyla tanımlanır.Merkezi bağlayıcı dizi okunur ve genomla eşleştirilir. Bu videoda, laboratuvarımızda MCF 7 meme kanseri hücre hattı üzerinde rutin olarak kullandığımız standart ChIP protokolünü göstereceğiz. Verilerimize göre, spesifik antikorlarla elde edilen daha yüksek ChIP zenginleştirmesi, daha iyi ChIP-seq verisi sağlar. Bu nedenle, ChIP protokolünün optimizasyonunu ve zenginleştirmenin qPCR ile doğrulanmasını şiddetle öneriyoruz.ChIP-pet kütüphanesi kurulumuna geçmeden önce, çapraz bağlama öncesinde yaklaşık 20 milyon hücre içeren 500 cm²'lik bir doku kültürü kabında CF7 hücreleri yaklaşık %75 konfluense ulaşana kadar kültüre edilir. Büyütme ortamı dökülür ve hücreler ılık PBS ile iki kez yıkanır. Hücreler, oda sıcaklığındaki bir rotatör üzerinde, taze hazırlanmış 1,5 mM EGS ile 45 dakika boyunca fikse edilir. Final konsantrasyonu %1 olacak şekilde %37'lik formaldehit eklenir ve 20 dakika boyunca inkübe edilir.Çapraz bağlama verimliliği kritiktir ve hücre hatlarına ve ilgilenilen proteine göre değişiklik gösterir. Çapraz bağlayıcı konsantrasyonu, inkübasyon süresi ve sıcaklığı optimize edilmelidir. Çapraz bağlayıcılar, 200 millimolar glisin nihai konsantrasyonu ile 10 dakika boyunca sönümlendirilmelidir.Söndürülmüş çapraz bağlayıcılar atılır ve hücreler soğuk PBS ile iki kez yıkanır. Soğutmalı bir masaüstü santrifüj yardımıyla pellet hücreler kazınır; pellet artık hücre lizisi için hazırdır. Alternatif olarak, pellet -80 °C'de dondurulabilir. Eğer hücre pelletle dondurulmuşsa, hücre lizisine geçmeden önce buz üzerinde çözdürün ve pellet'i %0,1 SDS lizis tamponu ile yeniden süspande edin.Tüpü soğutmalı bir santrifüj ile 4 °C'de döndürün, süpernatantı atın ve hücre lizisini tekrarlayın. Kromatin fragmantasyonundan önce, çapraz bağlı kromatini serbest bırakmak için nükleer lizis gerçekleştirilir. Nükleer membranın yokluğu, çapraz bağlı kromatinin daha hafif koşullar altında sonikasyonla parçalanmasına olanak tanır.%1 SDS lizis Tamponu içinde Reus Band nükleer paleti hazırlayın. Süspansiyonu yüksek hızlı bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü dört santigrat derecede döndürün.Santrifüjleme yoluyla nükleer kalıntıları uzaklaştırın. Kromatik palet bu şekilde görünmelidir. Paleti parçalara ayırmak için bir P 1000 pipet ucu kullanın ve %0.1 SDS lizis tamponu ile iki kez yıkayın.Tüpü, soğutmalı bir santrifüj ile 4 °C'de döndürün. Nükleer pellet artık sonikasyona hazırdır. Alternatif olarak, pellet -80 °C'de dondurulabilir.Paleti şeffaf bir tüpe aktarın. Palete %0,1 SDS lizis tamponu ekleyin ve tüm hava kabarcıklarını giderin. Aşırı ısınmayı önlemek için sonikasyon boyunca örnekleri soğuk tutun. Tampon hacmi, prob derinliği, sonikasyon gücü, döngü sayısı ve çapraz bağlanma derecesi gibi farklı koşullar sonikasyon verimliliğini etkileyebilir.Proteinaz K kullanarak kromatinin çapraz bağlarını çözün ve alikotlar hazırlayın, ardından bir agaroz jel yürütün. Fragmantasyon verimliliğini doğrulamak için 200 ile 600 baz çifti arasındaki istenen DNA boyut aralığını elde etmek üzere optimizasyon yapılması önerilir. Santrifüj ile hücre artıklarını uzaklaştırın.Kromatin artık manyetik boncuklarla ön temizleme işlemine hazırdır. Alternatif olarak, yeterli kromatin toplanana kadar işlem eksi 80 °C'de durdurulabilir. Bir ChIP işlemine başlamak için boncukları üç kez boncuk yıkama tamponu ile yıkayın; bu ve gelecekte manyetik protein boncuklarını içeren tüm yıkama işlemleri aşağıdaki adımlardan oluşur.Sonike edilmiş kromatini önceden yıkanmış boncuklara ekleyin ve ayrı bir tüpte dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Önceden yıkanmış boncukları antikorla kaplayın ve dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Antikor kaplı boncukları boncuk yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.Proksimite ligasyonu için substratın yüksek karmaşıklığı, kaçınılmaz olarak önemli miktarda spesifik olmayan gürültüye yol açar ve böylece dizileme maliyetini artırır. Karmaşıklık düzeyini ve arka plan gürültüsünü azaltmanın yanı sıra, transkripsiyon regülasyonunda rol oynayan kromatin etkileşimlerini tanımlamak için bir fare RNA polimeraz iki monoklonal antikoru kullandık.Bu, aktif promoterlerin ve bunlara karşılık gelen düzenleyici bölgelerin incelenmesine olanak tanıyarak, verimli ve muhtemelen kooperatif transkripsiyonun anlaşılmasını sağlar. Antikor kaplı boncuklardaki yıkama tamponunu boşaltın. Ön temizlenmiş kromatini antikor kaplı boncuklarla birleştirin ve dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Gece boyu süren inkübasyonun ardından, bağlanmamış kromatini uzaklaştırmak için boncuklar bir dizi yıkama işlemine tabi tutulur ve ardından boncuklar TE tamponu içinde alikotlara ayrılır. Kantitatif analiz ve zenginleştirme kontrolü için küçük bir miktar ayrılır. Pad ve tag sekanslama kullanan kromatin etkileşim analizi, yüksek dereceli etkileşim halindeki kromatin yapılarının geniş ölçekli de novo analizi için geliştirilmiş bir tekniktir.Kromatin immünopresipitasyonu ile zenginleştirilen DNA fragmanları, yakınlık ligasyonu ile yakalanır. Pad ve tag stratejisi, yüksek kapasiteli yeni nesil dizileme teknolojileriyle dizilenen CHI-PET kütüphanelerinin oluşturulmasında uygulanır. Bu videoda, CHI-PET kütüphanesi oluşturulmasındaki kritik deneysel aşamaları göstereceğiz.Kütüphane oluşturmanın ilk yarısı, DNA fragmanlarının bağlandığı protein A veya G boncuklarının, enzimleri ve tampon tuzunu uzaklaştırmak amacıyla işlenmesini içerir. Her enzimatik reaksiyondan sonra, her yıkama adımı için nazik santrifüjleme ve hafifçe vurma (flicking) işlemi uygulayın. Boncuklar manyetik bir parçacık üzerine yerleştirildiğinde, yakalanan boncuk miktarını maksimize etmek için süpernatantı birkaç kez pipetleyin.Reaksiyon karışımındaki boncukları içeren tüm inkübasyon adımları için konsantratör. Master mix'i önceden hazırlayın ve enzimi, boncuklar homojen bir şekilde yeniden süspanse edildikten sonra en son ekleyin. Boncukların tüm inkübasyon boyunca iyi karıştırıldığından emin olun. Yarı bağlayıcı oligo nükleotidler, dört nükleotidden oluşan dahili bir barkod ve tip 2 S restriksiyon enzimi MME 1 için tanıma bölgesi ile tasarlanmıştır.C kromatik komplekslerdeki sabitlenmiş DNA fragmanlarına yarım bağlayıcıların ligasyonu sonrası, etkileşim halindeki DNA fragmanları tam bir bağlayıcı dizisi ile birbirine bağlanacaktır. Bu yarım bağlayıcılar, spesifik olmayan ligasyon ürünlerinden türetilen heterodimer ab bağlayıcılı diziler veya spesifik ligasyon ürünlerinden türetilen homodimer AA veya BB bağlayıcılı diziler oluşturur. Bu nedenle, farklı nükleotid barkodlarına sahip iki yarım bağlayıcının kullanımı, farklı deneylerin veya tekrarların belirlenmesine olanak tanıdığı gibi, farklı çip kompleksleri arasındaki spesifik olmayan kimerik ligasyon oranlarının izlenmesini de sağlar.Reaksiyonun buz üzerinde kurulması ve yarı bağlantıların (half linkers) buz üzerinde yavaşça çözdürülmesi önemlidir. Yarı bağlantıları önce suyla, ardından PEG içeren ligaz tamponuyla iyice karıştırın. Resüsyon işleminden önce master mix'in iyi karıştırıldığından emin olun.Yarım bağlayıcıların ve çip DNA fragmanlarının iyi karıştırıldığından emin olduktan sonra, yarım bağlayıcıların konkatenasyonunu önlemek için çip DNA'sına yalnızca T4 DNA ligaz ekleyin. Tüpü parafilm ile kapatın. Rotasyonla 16 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ardından, bozulmamış kromatin kompleksleri, SDS içeren EB tamponu eklenerek boncuklardan elüe edilir; elüe edilen DNA'daki SDS konsantrasyonunu düşürmek için Triton X-100 eklenir ve tüm SDS etkisizleştirilir. Kromatin komplekslerinin daireselleşmesi, etkileşim birleşiminde tam bir bağlayıcı dizisi oluşturacak şekilde iki yarım bağlayıcının ligasyonu ile kolaylaştırılır. Farklı DNA-protein kompleksleri arasındaki ligasyonları minimize etmek için elüe edilmiş kromatin komplekslerini aşırı seyreltik koşullarda ligasyon işlemine tabi tutun; T4 DNA ligazı, elüe edilmiş kromatin kompleksleri reaksiyon karışımında iyice seyreltildikten sonra ekleyin. Ters çapraz bağlama işleminden sonra, DNA ile ilişkili proteinleri uzaklaştırmak için fenol-kloroform ekstraksiyonu kullanarak daireselleşmiş DNA fragmanlarını saflaştırın. Kolay ayırma işlemi için KaiGen phase lock jel sistemini kullanın.Fenol ekstraksiyonundan sonra, pelletin kütlesini ve görünürlüğünü artırmak için glyco blue A DNA taşıyıcısı kullanın. Yarı bağlayıcı oligo nükleotidler, yanlarda MM E one tanıma bölgeleri içerir. MM E one A Tip iki S restriksiyon enzimi, kromatin fragmanından kısa etiketler oluşturmak için hedef bağlanma bölgelerinin 18 ve 20 baz çifti aşağısından keserek, pets olarak kısaltılan PET etiket bağlayıcı etiket yapılarını üretir.Ayrıca, her bir yarım bağlayıcı, pet konstrüktlarının streptavidin kaplı manyetik boncuklarla saflaştırılmasını sağlamak için biyotin ile modifiye edilir. Etiket Bağlayıcı konstrüktlarını serbest bırakmak için MME tek sindirimi gerçekleştirin. Seçici bağlanma yoluyla strapped Aden boncuklarını kullanarak petleri saflaştırın ve yüksek veri hacimli dizileme için pet konstrüktlarını adaptörlerle ligasyon yapın.CHI PET Kütüphanesi Füzyonunu amplifiye etmek için füzyon DNA polimeraz kullanın. DNA polimeraz, yüksek doğruluk ve verimlilikle şablonlar oluşturmak için kullanılır. PCR reaksiyonunu soğuk ortamda hazırlayın ve füzyon DNA polimerazı en son ekleyin.Enzim, dNTP'lerin yokluğunda primerleri degrade edebilen 3' ila 5' ekzonükleaz aktivitesi sergiler. Eğer CRISPR kütüphanesi başarıyla oluşturulmuşsa, yaklaşık 223 baz çiftinde belirgin ve iyi tanımlanmış bir bant görülmelidir. 223 baz çiftlik bandı jelden keserken spesifik olmayan bantlardan kaçının ve kesilen bandı Jel Saflaştırma Protokolü'nü kullanarak saflaştırın.Yüksek verimli dizileme öncesinde, DNA 1000 kiti ile Agilent 2, 100 bioanalyzer kullanarak bir kalite kontrolü gerçekleştirin. Genom genelindeki kromatin etkileşimlerinin tarafsız tespiti için CHI PET prosedürünü yeni göstermiş bulunmaktayız. CHI PET verilerinin kalitesi, kullanılan çip antikorunun etkinliğine ve dizileme derinliğine bağlıdır.Burada, etkileşim haritalama için 18 ila 20 milyon okuma kullanıyoruz. Bu spesifik protokol, insan genomunda östrojen reseptörü ve RNA polimeraz tarafından bağlanan kromatin etkileşim ağlarını başarıyla karakterize etmek için kullanılmıştır. Bu analizin, tüm genom bağlamında transkripsiyon biyolojisinin üç boyutlu mimarisi üzerine yapılacak gelecek çalışmalar için güçlü bir araç olacağını öngörüyoruz.Bu videonun size faydalı olacağını umuyoruz. İzlediğiniz için teşekkür ederiz.I.

chromatin-interaction-analysis-with-paired-end-tag-sequencing-chia

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kromatin immunoprecipitation ve ultra-yüksek verimli sıralama (ChIP-seq) kombinasyonu belirli bir doku ya da hücre hattı protein-DNA etkileşimleri belirlemek ve eşleyebilirsiniz. Boş bir örnek olarak transkripsiyon faktörü TCF7L2 ile deneyim kullanıyorsanız sonraki sıralama için yüksek kaliteli ChIP şablonu oluşturmak için nasıl.

Yüksek verim Sıralama için Yüksek Kalite Kromatin Immunoprecipitation DNA Şablon üretimi (ChIP-seq)

nasıl kromatin düzenleyiciler ve kromatin devletlerin soru in vivo genom hücre kaderi kararları gelişen embriyonun yapılır ne kadar erken anlayışımıza önemli olduğunu etkileyebilir. ChIP-Seq-küresel düzey bir Xenopus embriyolar için burada özetlenen kromotin özelliklerini araştırmak için en popüler yaklaşım.

Kromatin Regülatörleri ve Devletleri&#39;nde genom Anlık<em&gt; Ksenopus</emChIP-Sıra tarafından&gt; Embriyolar

Kromatin immüno-çökeltmesi DNA in vivo olarak Arabidopsis proteinlerin bağlanma yerlerinin tanımlanması için güçlü bir tekniktir. Bu prosedür, kromatin çapraz bağlama ve parçalanma, ilgi konusu proteine ​​karşı seçici antikorlar ile immünopresipitasyon ve bağlı DNA qPCR analizini içermektedir. Biz, Arabidopsis bitkiler için optimize edilmiş basit ChIP tahlili tarif eder.

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Mikrokokal nükleaz (MNase) füzyon proteinleri ile genom çapında protein bağlama bölgelerinin haritalanması için bir kromatin immünopresipitasyon (ChIP) -orthogonal yöntem olan yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) ile birleşince, kromatin endojen bölünmeyi tarif ederiz.

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Burada, bir en iyi duruma getirilmiş yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama Protokolü ve genom çapında Kromatin devlet desenlerini donmuş tümör doku ve hücre hatları belirlenmesi için hesaplama analizleri potansiyel açıklar.

Yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama tümör dokularda kullanarak genom geniş eşleme Kromatin devletler için entegre bir Platform

Burada, biz ChIP-Seq gerçekleştirmek için yöntemleri tarif ve CARIP-yeni nesil sıralama, Kütüphane hazırlık dahil olmak üzere küresel epigenomic ve kromatin ilişkili RNA oluşturmak için Seq, ES hücrelerde eşler.

CARIP-Seq ve ChIP-Seq: kromatin ilişkili RNA ve Protein-DNA etkileşimleri embriyonik kök hücreleri tanımlamak için yöntemleri

Genlerin ve onların düzenleyici elemanlarının arasındaki fiziksel etkileşimleri tanımlaması zordur ama kromozom conformation yakalama yöntemleri tarafından kolaylaştırdı. Bu değişiklik 4C-seq protokolü için PCR önyargı yanında en aza indirgemek PCR şablonları aşırı amplifikasyon azaltır ve bir ek Restriksiyon enzimi Özet adım dahil ederek okur mappability en üst düzeye çıkarır.

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

Biz tandem kromatin için adım adım bir protokol tarif immunoprecipitation sıralama (tChIP-Seq) hücre türüne özgü genom çapında histon değişiklik çözümleme sağlar.

TChIP-Seq: Hücre türüne özgü Epigenome profil oluşturma

Genom genelinde protein bağlayıcı yerlerin kesin olarak belirlenmesi gen düzenlemesini anlamak için önemlidir. Burada kromatin-immünprecipitated DNA'yı exonuclease sindirimi (ChIP-exo) ve ardından yüksek verimli dizilim ile tedavi eden bir genomik haritalama yöntemini açıklıyoruz. Bu yöntem, memeli nöronlarında yakın baz çifti haritalama çözünürlüğü ve yüksek sinyal-gürültü oranı ile protein-DNA etkileşimlerini tespit eder.

Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo) Kullanılarak Fare Kök Hücre Türevi Nöronlarda Protein-DNA Etkileşimlerinin Yüksek Çözünürlüklü Haritalanması

Burada, sadece 30 μL solucan pelleti kullanılarak L4-aşama Caenorhabditis elegans tüm solucanında uygulanacak hızlı ve basit bir ATAC-seq protokolünü sunuyoruz.

Bütün Caenorhabditis elegans L4 larvalarda kromatin erişilebilirlik profili

Burada, RNA ile ilişkili kromatin DNA-DNA etkileşimlerini yakalamak için RNA ile ilişkili üç boyutlu genom organizasyonunu haritalamak için bir protokol sunuyoruz.

RNA ile İlgili Kromatin DNA-DNA Etkileşim Yöntemi

Öğrenin ChIA-PET ile kromatin etkileşimlerini haritalama ve transkripsiyonel düzenlemeyi anlama yöntemini. Bu protokol, kromatin immünopresipitasyonu ve kütüphane yapımı adımlarını içerir.

Kromatin Etkileşimler haritalama ve Transkripsiyon Yönetmelik anlamak için paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi (Video) | JoVE Journal

Kromatin Etkileşimler haritalama ve Transkripsiyon Yönetmelik anlamak için paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi

Daha fazla video keşfet