Kromatin Etkileşimler haritalama ve Transkripsiyon Yönetmelik anlamak için paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi

Toz ve etiket sekanslama kullanılarak yapılan COMIN etkileşim analizi, genom çapında uzun menzilli COMIN etkileşim analizine yönelik bir yöntemdir. Kısaca, buna magic share pad diyoruz. Bu yöntem birçok moleküler biyoloji adımı içerir ve karmaşık olabilir.

Bu nedenle, takip eden videoda, kromatin immünopresipitasyonun ve ChIA-PET analizi için kütüphane kurulumunun temel adımlarından bazılarını size göstereceğiz. Chip olarak bilinen kromatin immünopresipitasyonu, bir ChIA-PET kütüphanesi oluşturmanın ilk kritik adımıdır. Burada, hücre kültürlerinden alınan kromatin örnekleri çapraz bağlanır, sonikasyona tabi tutulur ve immünopresipite edilir.

Ardından, çip DNA'sının ayrı alikotları barkodlu yarı bağlayıcılara (half linkers) bağlanır ve yakınlık ligasyonu gerçekleştirilir. Pet'ler restriksiyon sindirimi ile serbest bırakılır, kaplamalı manyetik boncuklar üzerinde saflaştırılır ve yeni nesil dizileme için adaptörlere bağlanır. Kimera sandalye pet'leri, AB bağlayıcı kompozisyonu ve etiket yan dizilimleri aracılığıyla tanımlanır.

Merkezi bağlayıcı dizi okunur ve genomla eşleştirilir. Bu videoda, laboratuvarımızda MCF 7 meme kanseri hücre hattı üzerinde rutin olarak kullandığımız standart ChIP protokolünü göstereceğiz. Verilerimize göre, spesifik antikorlarla elde edilen daha yüksek ChIP zenginleştirmesi, daha iyi ChIP-seq verisi sağlar. Bu nedenle, ChIP protokolünün optimizasyonunu ve zenginleştirmenin qPCR ile doğrulanmasını şiddetle öneriyoruz.

ChIP-pet kütüphanesi kurulumuna geçmeden önce, çapraz bağlama öncesinde yaklaşık 20 milyon hücre içeren 500 cm²'lik bir doku kültürü kabında CF7 hücreleri yaklaşık %75 konfluense ulaşana kadar kültüre edilir. Büyütme ortamı dökülür ve hücreler ılık PBS ile iki kez yıkanır. Hücreler, oda sıcaklığındaki bir rotatör üzerinde, taze hazırlanmış 1,5 mM EGS ile 45 dakika boyunca fikse edilir. Final konsantrasyonu %1 olacak şekilde %37'lik formaldehit eklenir ve 20 dakika boyunca inkübe edilir.

Çapraz bağlama verimliliği kritiktir ve hücre hatlarına ve ilgilenilen proteine göre değişiklik gösterir. Çapraz bağlayıcı konsantrasyonu, inkübasyon süresi ve sıcaklığı optimize edilmelidir. Çapraz bağlayıcılar, 200 millimolar glisin nihai konsantrasyonu ile 10 dakika boyunca sönümlendirilmelidir.

Söndürülmüş çapraz bağlayıcılar atılır ve hücreler soğuk PBS ile iki kez yıkanır. Soğutmalı bir masaüstü santrifüj yardımıyla pellet hücreler kazınır; pellet artık hücre lizisi için hazırdır. Alternatif olarak, pellet -80 °C'de dondurulabilir. Eğer hücre pelletle dondurulmuşsa, hücre lizisine geçmeden önce buz üzerinde çözdürün ve pellet'i %0,1 SDS lizis tamponu ile yeniden süspande edin.

Tüpü soğutmalı bir santrifüj ile 4 °C'de döndürün, süpernatantı atın ve hücre lizisini tekrarlayın. Kromatin fragmantasyonundan önce, çapraz bağlı kromatini serbest bırakmak için nükleer lizis gerçekleştirilir. Nükleer membranın yokluğu, çapraz bağlı kromatinin daha hafif koşullar altında sonikasyonla parçalanmasına olanak tanır.

%1 SDS lizis Tamponu içinde Reus Band nükleer paleti hazırlayın. Süspansiyonu yüksek hızlı bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü dört santigrat derecede döndürün.

Santrifüjleme yoluyla nükleer kalıntıları uzaklaştırın. Kromatik palet bu şekilde görünmelidir. Paleti parçalara ayırmak için bir P 1000 pipet ucu kullanın ve %0.1 SDS lizis tamponu ile iki kez yıkayın.

Tüpü, soğutmalı bir santrifüj ile 4 °C'de döndürün. Nükleer pellet artık sonikasyona hazırdır. Alternatif olarak, pellet -80 °C'de dondurulabilir.

Paleti şeffaf bir tüpe aktarın. Palete %0,1 SDS lizis tamponu ekleyin ve tüm hava kabarcıklarını giderin. Aşırı ısınmayı önlemek için sonikasyon boyunca örnekleri soğuk tutun. Tampon hacmi, prob derinliği, sonikasyon gücü, döngü sayısı ve çapraz bağlanma derecesi gibi farklı koşullar sonikasyon verimliliğini etkileyebilir.

Proteinaz K kullanarak kromatinin çapraz bağlarını çözün ve alikotlar hazırlayın, ardından bir agaroz jel yürütün. Fragmantasyon verimliliğini doğrulamak için 200 ile 600 baz çifti arasındaki istenen DNA boyut aralığını elde etmek üzere optimizasyon yapılması önerilir. Santrifüj ile hücre artıklarını uzaklaştırın.

Kromatin artık manyetik boncuklarla ön temizleme işlemine hazırdır. Alternatif olarak, yeterli kromatin toplanana kadar işlem eksi 80 °C'de durdurulabilir. Bir ChIP işlemine başlamak için boncukları üç kez boncuk yıkama tamponu ile yıkayın; bu ve gelecekte manyetik protein boncuklarını içeren tüm yıkama işlemleri aşağıdaki adımlardan oluşur.

Sonike edilmiş kromatini önceden yıkanmış boncuklara ekleyin ve ayrı bir tüpte dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Önceden yıkanmış boncukları antikorla kaplayın ve dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Antikor kaplı boncukları boncuk yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.

Proksimite ligasyonu için substratın yüksek karmaşıklığı, kaçınılmaz olarak önemli miktarda spesifik olmayan gürültüye yol açar ve böylece dizileme maliyetini artırır. Karmaşıklık düzeyini ve arka plan gürültüsünü azaltmanın yanı sıra, transkripsiyon regülasyonunda rol oynayan kromatin etkileşimlerini tanımlamak için bir fare RNA polimeraz iki monoklonal antikoru kullandık.

Bu, aktif promoterlerin ve bunlara karşılık gelen düzenleyici bölgelerin incelenmesine olanak tanıyarak, verimli ve muhtemelen kooperatif transkripsiyonun anlaşılmasını sağlar. Antikor kaplı boncuklardaki yıkama tamponunu boşaltın. Ön temizlenmiş kromatini antikor kaplı boncuklarla birleştirin ve dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Gece boyu süren inkübasyonun ardından, bağlanmamış kromatini uzaklaştırmak için boncuklar bir dizi yıkama işlemine tabi tutulur ve ardından boncuklar TE tamponu içinde alikotlara ayrılır. Kantitatif analiz ve zenginleştirme kontrolü için küçük bir miktar ayrılır. Pad ve tag sekanslama kullanan kromatin etkileşim analizi, yüksek dereceli etkileşim halindeki kromatin yapılarının geniş ölçekli de novo analizi için geliştirilmiş bir tekniktir.

Kromatin immünopresipitasyonu ile zenginleştirilen DNA fragmanları, yakınlık ligasyonu ile yakalanır. Pad ve tag stratejisi, yüksek kapasiteli yeni nesil dizileme teknolojileriyle dizilenen CHI-PET kütüphanelerinin oluşturulmasında uygulanır. Bu videoda, CHI-PET kütüphanesi oluşturulmasındaki kritik deneysel aşamaları göstereceğiz.

Kütüphane oluşturmanın ilk yarısı, DNA fragmanlarının bağlandığı protein A veya G boncuklarının, enzimleri ve tampon tuzunu uzaklaştırmak amacıyla işlenmesini içerir. Her enzimatik reaksiyondan sonra, her yıkama adımı için nazik santrifüjleme ve hafifçe vurma (flicking) işlemi uygulayın. Boncuklar manyetik bir parçacık üzerine yerleştirildiğinde, yakalanan boncuk miktarını maksimize etmek için süpernatantı birkaç kez pipetleyin.

Reaksiyon karışımındaki boncukları içeren tüm inkübasyon adımları için konsantratör. Master mix'i önceden hazırlayın ve enzimi, boncuklar homojen bir şekilde yeniden süspanse edildikten sonra en son ekleyin. Boncukların tüm inkübasyon boyunca iyi karıştırıldığından emin olun. Yarı bağlayıcı oligo nükleotidler, dört nükleotidden oluşan dahili bir barkod ve tip 2 S restriksiyon enzimi MME 1 için tanıma bölgesi ile tasarlanmıştır.

C kromatik komplekslerdeki sabitlenmiş DNA fragmanlarına yarım bağlayıcıların ligasyonu sonrası, etkileşim halindeki DNA fragmanları tam bir bağlayıcı dizisi ile birbirine bağlanacaktır. Bu yarım bağlayıcılar, spesifik olmayan ligasyon ürünlerinden türetilen heterodimer ab bağlayıcılı diziler veya spesifik ligasyon ürünlerinden türetilen homodimer AA veya BB bağlayıcılı diziler oluşturur. Bu nedenle, farklı nükleotid barkodlarına sahip iki yarım bağlayıcının kullanımı, farklı deneylerin veya tekrarların belirlenmesine olanak tanıdığı gibi, farklı çip kompleksleri arasındaki spesifik olmayan kimerik ligasyon oranlarının izlenmesini de sağlar.

Reaksiyonun buz üzerinde kurulması ve yarı bağlantıların (half linkers) buz üzerinde yavaşça çözdürülmesi önemlidir. Yarı bağlantıları önce suyla, ardından PEG içeren ligaz tamponuyla iyice karıştırın. Resüsyon işleminden önce master mix'in iyi karıştırıldığından emin olun.

Yarım bağlayıcıların ve çip DNA fragmanlarının iyi karıştırıldığından emin olduktan sonra, yarım bağlayıcıların konkatenasyonunu önlemek için çip DNA'sına yalnızca T4 DNA ligaz ekleyin. Tüpü parafilm ile kapatın. Rotasyonla 16 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ardından, bozulmamış kromatin kompleksleri, SDS içeren EB tamponu eklenerek boncuklardan elüe edilir; elüe edilen DNA'daki SDS konsantrasyonunu düşürmek için Triton X-100 eklenir ve tüm SDS etkisizleştirilir. Kromatin komplekslerinin daireselleşmesi, etkileşim birleşiminde tam bir bağlayıcı dizisi oluşturacak şekilde iki yarım bağlayıcının ligasyonu ile kolaylaştırılır. Farklı DNA-protein kompleksleri arasındaki ligasyonları minimize etmek için elüe edilmiş kromatin komplekslerini aşırı seyreltik koşullarda ligasyon işlemine tabi tutun; T4 DNA ligazı, elüe edilmiş kromatin kompleksleri reaksiyon karışımında iyice seyreltildikten sonra ekleyin. Ters çapraz bağlama işleminden sonra, DNA ile ilişkili proteinleri uzaklaştırmak için fenol-kloroform ekstraksiyonu kullanarak daireselleşmiş DNA fragmanlarını saflaştırın. Kolay ayırma işlemi için KaiGen phase lock jel sistemini kullanın.

Fenol ekstraksiyonundan sonra, pelletin kütlesini ve görünürlüğünü artırmak için glyco blue A DNA taşıyıcısı kullanın. Yarı bağlayıcı oligo nükleotidler, yanlarda MM E one tanıma bölgeleri içerir. MM E one A Tip iki S restriksiyon enzimi, kromatin fragmanından kısa etiketler oluşturmak için hedef bağlanma bölgelerinin 18 ve 20 baz çifti aşağısından keserek, pets olarak kısaltılan PET etiket bağlayıcı etiket yapılarını üretir.

Ayrıca, her bir yarım bağlayıcı, pet konstrüktlarının streptavidin kaplı manyetik boncuklarla saflaştırılmasını sağlamak için biyotin ile modifiye edilir. Etiket Bağlayıcı konstrüktlarını serbest bırakmak için MME tek sindirimi gerçekleştirin. Seçici bağlanma yoluyla strapped Aden boncuklarını kullanarak petleri saflaştırın ve yüksek veri hacimli dizileme için pet konstrüktlarını adaptörlerle ligasyon yapın.

CHI PET Kütüphanesi Füzyonunu amplifiye etmek için füzyon DNA polimeraz kullanın. DNA polimeraz, yüksek doğruluk ve verimlilikle şablonlar oluşturmak için kullanılır. PCR reaksiyonunu soğuk ortamda hazırlayın ve füzyon DNA polimerazı en son ekleyin.

Enzim, dNTP'lerin yokluğunda primerleri degrade edebilen 3' ila 5' ekzonükleaz aktivitesi sergiler. Eğer CRISPR kütüphanesi başarıyla oluşturulmuşsa, yaklaşık 223 baz çiftinde belirgin ve iyi tanımlanmış bir bant görülmelidir. 223 baz çiftlik bandı jelden keserken spesifik olmayan bantlardan kaçının ve kesilen bandı Jel Saflaştırma Protokolü'nü kullanarak saflaştırın.

Yüksek verimli dizileme öncesinde, DNA 1000 kiti ile Agilent 2, 100 bioanalyzer kullanarak bir kalite kontrolü gerçekleştirin. Genom genelindeki kromatin etkileşimlerinin tarafsız tespiti için CHI PET prosedürünü yeni göstermiş bulunmaktayız. CHI PET verilerinin kalitesi, kullanılan çip antikorunun etkinliğine ve dizileme derinliğine bağlıdır.

Burada, etkileşim haritalama için 18 ila 20 milyon okuma kullanıyoruz. Bu spesifik protokol, insan genomunda östrojen reseptörü ve RNA polimeraz tarafından bağlanan kromatin etkileşim ağlarını başarıyla karakterize etmek için kullanılmıştır. Bu analizin, tüm genom bağlamında transkripsiyon biyolojisinin üç boyutlu mimarisi üzerine yapılacak gelecek çalışmalar için güçlü bir araç olacağını öngörüyoruz.

Bu videonun size faydalı olacağını umuyoruz. İzlediğiniz için teşekkür ederiz.I.