Alerjen Bağlı Astım murin Modeli

Aşağıdaki deneyin genel amacı, astımın bir murn modelini üretmektir. İlk fareler, ikinci adım olarak intraperitoneal enjeksiyon ile voline duyarlı hale getirilir. Fareler, intratrakeal veya nebulizasyon yoluyla volin ile zorlanır.

Bu, insan astımlı alevlenmesine benzer bir alerjik hava yolu reaksiyonuna neden olur ve metilkolin zorluğu ile ölçülebilir. Ek olarak, bu tipik astım özelliklerinin şiddetini değerlendirmek için hava yollarındaki hücresel infiltrasyon ve serum IgE E seviyeleri ölçülebilir. Sonuç olarak, fareler, şiddeti daha fazla deneysel manipülasyondan etkilenebilecek astım benzeri belirtiler geliştirir.

Bu hayvan modeli, belirli araştırma ilaçları ile tedavinin etkileri veya belirli sinyal yollarının modüle edilmesi gibi astım alanındaki önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bugün bu prosedürü laboratuvarımda Irvin ve Somia yüksek lisans öğrencileri gösterecek. Duyarlılaştırma çözeltisini, 200 mikrolitre duyarlılaştırma aşısı veya bu protokol için volin intraperitoneal içermeyen bir kontrol çözeltisi enjekte edilerek, mililitre başına 10 miligram alüminyum hidroksit duyarlı fareler içeren steril PBS'de mililitre başına bir miligram volin emülsifiye ederek hazırlayın.

Fareleri sıfırıncı ve yedinci günde tarif edildiği gibi hassaslaştırın. Ardından, intratrakeal meydan okuma için 14 ila 22. günlerden başlayarak alternatif günlerde meydan okuma yapın. Anestezi uygulanmış fareyi eğimli bir yüzeye yerleştirin.

Farenin ön kesici dişlerinin altına bir iplik geçirin ve başınızı geride tutun. Ardından trakeayı düzeltmek için pençeyi düzleştirin ve arka ayakları çalışma yüzeyine bantlayın. Pozisyonu sabitlemek için, farenin boynunu ve göğüs bölgesini %70 etanol ile ıslatın ve forseps kullanarak cerrahi bölgeyi dezenfekte etmek için klorheksidin ile çubukla temizleyin, boğazdaki cildi kıstırın ve steril cerrahi makasla nazikçe öne doğru çekin.

Küçük bir dikey kesi yapın. PBS'de 50 mikrolitre% 0.1 Volin içeren bir mililitrelik bir şırınga yükleyin. 27 gauge bir iğne ile takın ve tek elinizle tekrarlayan bir pipete yerleştirin.

Diğer elinizle trakeayı ortaya çıkarmak için steril forseps kullanın. Pipeti soluk borusuna paralel tutun. İğneyi dikkatlice yerleştirin ve çözeltiyi enjekte edin.

Yarayı nazikçe kapatın ve bir dikişle kapatın. Steriliteyi korumaya özen göstermek. Fareyi bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin ve nebulizasyon yoluyla meydan okuma için iyileşmesine izin verin.

Sıfırıncı ve 14. günde fareleri hassaslaştırmak için daha önce açıklanan yöntemi kullanın. Daha sonra farelere 21. günden 25. güne kadar günlük olarak meydan okuyun. Meydan okumayı gerçekleştirmek için, fareleri tüm vücut pletismografi sisteminin ana odasına yerleştirin ve en az 10 dakika boyunca iklimlendirmelerine izin verin.

Daha sonra nebulizatör kabına steril PBS'ye bir mililitre% 0.1 albümin koyun ve 30 dakika boyunca nebulize edin. Non-invaziv hava yolu aşırı duyarlılık ölçümleri yapmak için, fareleri daha önce gösterildiği gibi odaya alıştırın. Ardından, üç dakika boyunca temel okumaları kaydedin.

Daha sonra, nebulizatör kabına bir mililitre PBS koyun, iki dakika nebulize edin ve nebulizasyondan sonra kurutma aşamasında solunum değişkenlerini altı dakika daha izleyin. Bu örnek, invaziv hava yolu aşırı duyarlılık ölçümleri yapmak için ovalbümin ile tedavi edilen fareler tarafından geliştirilen artan hava yolu duyarlılığını göstermektedir. Anestezi uygulanmış fareyi sırt üstü yatırın, boynu etanol ve klorheksidin ile dezenfekte edin ve bu videoda daha önce anlatıldığı gibi trakeayı açığa çıkarın.

Trakea göründüğünde, küçük bir kesi yapmak için ince steril makas kullanın. Trakeayı kesmemeye ve trakeal tüpü nazikçe yerleştirmeye dikkat edin. Hava sızıntısını önlemek için trakeanın etrafına bir dikiş atın.

Fareyi sırt üstü yatırın ve trakeal tüpü ventilatöre bağlayın. 20 gramlık bir fare için mekanik ventilasyonu başlatın. Solunum hızını dakikada 150 vuruşa ve tidal hacmi 200 mikrolitre kordon temel solunum ölçümlerine ayarlayın.

Daha sonra, PBS'nin verilmesinden veya ultrasonik bir nebülizörden artan dozlarda metilkolin verildikten sonra testi tekrarlayın. İnvaziv ölçüm kullanılarak, hem hava yolu direnci hem de akciğer elastini beklendiği gibi ölçülebilir. Volin ile tedavi edilen fareler, zorluğun ardından artan direnç ve elastin geliştirdi.

Ötenaziyi takiben, farenin karın boşluğunu ortaya çıkarın, ardından bunu yaparken diyaframı dikkatlice delmek için makas kullanın. Akciğerleri veya kalbi delmemeye dikkat edin. Göğüs kafesini kesin.

Daha sonra 27 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırınga kullanarak kalbi delin ve kanı yavaşça toplayın, kanı serum ayrımı ve ova spesifik IgE antikorlarının analizi için saklayın. Ardından, trakeayı ortaya çıkarın ve altındaki bir yolu temizlemek için kavisli makas kullanın. Kavisli bir forsepsin ucunu trakeanın altından geçirin ve ardından boğazda düşük bir pozisyonda trakeanın etrafına gevşek bir yarım düğüm halinde bir parça dikiş ipliği bağlayın.

İplik yerine oturduktan sonra, düğümün üzerindeki trakeada küçük bir kesi yapın ve deliğe dikkatlice bir kanül yerleştirin. Ardından, akciğerlerin girişine ulaşana kadar hafifçe ileri doğru bastırın. Düğümü sıkın ve tamamlayın.

Daha sonra PBS içeren bir mililitrelik şırıngayı kanüle bağlayın ve sıvıyı yavaşça akciğerlere enjekte edin. Akciğerlerin şiştiğini gözlemlemek. Akciğerleri aşırı doldurmamaya ve yırtmamaya dikkat edin.

Dirençle karşılaşılırsa lavaj sıvısını geri çekin, kanülü hafifçe döndürün veya hafifçe bastırın. Sıvı toplandıktan sonra, şırıngayı çıkarın, sıvıyı buz üzerindeki bir tüpe aktarın. İşlemi taze PBS ile iki kez tekrarlayın.

Bu işlemden sonra, hava yolu hücreleri burada gösterildiği gibi santrifüjleme ile izole edilebilir. Volin ile hassaslaşan ve zorlanan farelerin hava yolları, kontrol farelerininkinden çok daha fazla toplam hücre içerir. Diferansiyel hızlı boyalar kullanılarak eozinofiller, nötrofiller, alveolar makrofajlar ve lenfositler ayırt edilebilir ve sayılabilir.

Ek olarak, tedavi edilen farelerin, gelişiminden sonra serum ve bronkoalveoler lavaj sıvısında daha yüksek seviyelerde volin spesifik IgE antikorları geliştirdiği görülebilir. Bu hayvan modeli, astım alanındaki araştırmacıların bu önemli hastalığın altında yatan mekanizmaları uygun bir deniz modelinde keşfetmelerinin yolunu açmıştır.