Name: Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Öğrenin, mikroenjeksiyon ve canlı görüntüleme teknikleriyle Danio rerio embriyolarında bakteriyel patojenler ile konak bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemeyi. Bu yöntem, bağışıklık yanıtlarını anlamak için güçlü bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar balık bakımı için Şekil 4, Ulrike Nehrdich ve Davy de Witt görüntüleri ve yararlı tartışmalar için diğer laboratuvar üyeleri için, Chao Cui teşekkür Kat de Kort, Esther Stoop ve Ralph Carvalho istiyorum. Bu çalışma Ekonomik İlişkiler Hollanda Bakanlığı Smart Mix Programı ve Eğitim, Kültür ve Bilim, Avrupa Komisyonu 7. Çerçeve projesi ZF-SAĞLIK (SAĞLIK-F4-2010-242048), Avrupa Marie-Curie Bakanlığı tarafından desteklenmektedir İlk Eğitim Ağı FishForPharma (PITN-GA-2011-289209) ve Avustralya NHMRC (637.394) tarafından. Avustralya Rejeneratif Tıp Enstitüsü Victoria ve Avustralya Hükümeti Eyalet Hükümeti hibe ile desteklenmektedir.

<ol><li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Curr. Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).</li>
<li>Davis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17, 693-702 (2002).</li>
<li>vander Sar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+as+a+model+host+for+the+real+time+analysis+of+Salmonella+typhimurium+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections.</a> Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).</li>
<li>Zakrzewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-specific+gene+functions+in+Spi1-directed+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Macrophage-specific gene functions in Spi1-directed innate immunity.</a> Blood. 116, 1-11 (2010).</li>
<li>Le Guyader, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111, 132-141 (2008).</li>
<li>Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+behaviour+of+early+macrophages+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo.</a> Development. 126, 3735-3745 (1999).</li>
<li>Alibaud, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mycobacterium+marinum+TesA+mutant+defective+for+major+cell+wall-associated+lipids+is+highly+attenuated+in+Dictyostelium+discoideum+and+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos.</a> Mol. Microbiol. 80, 919-934 (2011).</li>
<li>Carvalho, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, 16779-16779 (2011).</li>
<li>van der Sar, A. M., Spaink, H. P., Zakrzewska, A., Bitter, W., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+the+zebrafish+host+transcriptome+response+to+acute+and+chronic+mycobacterial+infection+and+the+role+of+innate+and+adaptive+immune+components%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Specificity of the zebrafish host transcriptome response to acute and chronic mycobacterial infection and the role of innate and adaptive immune components.</a> Mol. Immunol. 46, 2317-2332 (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115-e1115 (2009).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Westerfield, M. The Zebrafish Book. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29%22">A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio)</a>. , The University of Oregon Press. Eugene. (1993).</li>
<li>Gutzman, J. H., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Brain+Ventricle+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Brain Ventricle Injection.</a> J. Vis. Exp. (26), e1218-e1218 (2009).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117, 49-56 (2011).</li>
<li>Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., Hegedus, Z., Spaink, H. P., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+and+functional+analyses+of+the+zebrafish+embryonic+innate+immune+response+to+Salmonella+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling and functional analyses of the zebrafish embryonic innate immune response to Salmonella infection.</a> J. Immunol. 182, 5641-5653 (2009).</li>
<li>Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li>
<li>Stoop, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryo+screen+for+mycobacterial+genes+involved+in+the+initiation+of+granuloma+formation+reveals+a+newly+identified+ESX-1+component%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component.</a> Dis. Model Mech. 4, 526-536 (2011).</li>
<li>Levraud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+zebrafish+IFN+receptor%3A+implications+for+the+origin+of+the+vertebrate+IFN+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of the zebrafish IFN receptor: implications for the origin of the vertebrate IFN system.</a> Journal of Immunology. 178, 4385-4394 (2007).</li>
<li>Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+zebrafish+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of zebrafish innate immunity.</a> Methods Mol. Biol. 415, 337-363 (2008).</li>
<li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+disseminated+candidiasis+in+zebrafish+reveals+role+of+phagocyte+oxidase+in+limiting+filamentous+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth.</a> Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).</li>
<li>Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+of+professional+phagocytes+in+vivo%3A+unlike+macrophages%2C+neutrophils+engulf+only+surface-associated+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes.</a> J. Cell Sci. 124, 3053-3059 (2011).</li>
<li>van Soest, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+static+immersion+and+intravenous+injection+systems+for+exposure+of+zebrafish+embryos+to+the+natural+pathogen+Edwardsiella+tarda%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda.</a> BMC Immunology. 12, 58-58 (2011).</li>
<li>Adams, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+tolerance+in+replicating+mycobacteria+mediated+by+a+macrophage-induced+efflux+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism.</a> Cell. 145, 39-53 (2011).</li>
<li>Ellett, F. L., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+quantification+of+fluorescent+leukocyte+numbers+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Computational quantification of fluorescent leukocyte numbers in zebrafish embryos.</a> Methods in Enzymology. , (2011).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113-e1113 (2009).</li>
<li>Mathias, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+inflammation+by+retrograde+chemotaxis+of+neutrophils+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42-42 (2007).</li>
<li>Gray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+intravital+imaging+of+macrophage+and+neutrophil+behaviour+during+inflammation+using+a+novel+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish.</a> Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yazıda tarif enfeksiyonu yöntemler genellikle bilgisayar doğuştan gelen bağışıklık genlerinin ya da bakteriyel virülans genler 1 işlevini incelemek için kullanılır. Intravenöz mikro-enjeksiyon yöntemleri (protokolleri 5 ve 6.1) bu tür çalışmalar için en sık kullanılan. Posterior kan adada kaudal ven 1-günlük embriyoların intravenöz enjeksiyon için en uygun yerdir. Kaudal ven sonraki aşamalarında nüfuz için daha zor hale geldikçe, biz 2-3 dpf&#39;e az embriyo için intravenöz enjeksiyon bölgesi olarak Cuvier ve Kanal tercih. Her durumda kob sayımı için kaplama enjeksiyon inokulum tarafından kontrol edilmelidir bakteri tutarlı numaraları ile embriyo enjekte etmek önemlidir. Aşağıdaki hususların enjeksiyonlar tekrarlanabilir ulaşmak için dikkate alınmalıdır. İlk olarak, yüksek kaliteli cam microcapillary enjeksiyon iğneleri olması şarttır. Iğne ucu kadar büyükse, enjeksiyon meydana kanama için yeterince büyük bir deliği oluşturur veenjekte edilen bakterilerin kan dolaşımını dışarı akacaktır. İkinci olarak, bakteri kan dolaşımı içine doğrudan enjekte edilmesi gerekir. Iğne ucu yolk sac uzatma enjeksiyon sıvısı yayılır damar içine veya eğer değilse, embriyo deneyden atılmalıdır. Üçüncü olarak, M. enjekte etmek için bir taşıyıcı olarak PVP40 kullanılarak marinum cam iğne batıyor gelen bakteri önlemede yardımcı olacaktır. PVP40 enjeksiyon süresi boyunca daha tekrarlanabilir inokulum sonuçlanan, süspansiyon homojen olmasını sağlar. PVP40 da S. için kullanılabilir büyük boyut ve bakterilerin parlak floresan deneyler sırasında enjeksiyon inokulum üzerinde görsel kontrolü sağlar çünkü typhimurium enjeksiyonları, ama burada daha az önemlidir. Enjeksiyonlar uygulama için biz fenol kırmızı boya (% 1 v / v) veya 1 mikron farklı renkler (Invitrogen) mevcut floresan kürelerin kullanılması tavsiye edilir. Teknik hakim edildikten sonra, bu yaklaşık olarak 30 minut alıres agaroz plakalar üzerinde embriyo hizalayarak ve bakteriyel enjeksiyon ses ayarlamak için gereken zaman dahil, 50-100 embriyo enjekte etmek. Kan ada (protokol 5) veya Cuvier (protokol 6.1) kanal içine intravenöz enjeksiyon en sık kullanılan edilirken, bu video makalede açıklanan enfeksiyon alternatif güzergahlar (protokolleri 6.2, 6.3 makrofaj ve nötrofil kemotaksisini çalışmak için yararlı olan ve 6.4), zayıflatılmış bakteri suşları (protokol 6.5) büyüme incelemek ve yüksek hacimli uygulamalar (protokol 6.6) 4-8 zebrabalıkları enfeksiyon modelinde uyarlamak. Açıklandığı mikro-enjeksiyon yöntemleri de virüsler 18, 19, mantar sporları 14, 20 veya protozoon paraziti (Maria Forlenza, kişisel iletişim) enjeksiyonu için uygulanabilir. Bu video makalesinde tarif enjeksiyon prosedürler yararlı bir ek zebr bakterilerin subkutan enjeksiyon için kısa bir süre önce anlatılan prosedürüafish embriyoların 21. Bu prosedür, yüzeyler üzerinde etkili bir doku engulf bakteri olduğu tespit edilmiştir, ancak nötrofiller, bakterilerin fagositozunu incelemek için uygulanmış, makrofajlar aksine, kan içinde ya da sıvı dolu bir kavite içine enjeksiyon gövdesi üzerine bakteriler fagosite neredeyse olamamıştır. Subkutan enjeksiyonlar embriyolar için bu video makalede açıklanan kuyruk kas enjeksiyon için benzer yerleştirilmiş, ancak iğne bir hücre gruplarının üzerinde bakteri enjekte derinin hemen altında eklenir. Bu mikro-enjeksiyon esas enfeksiyon yapay bir yol olduğunu dikkate almak önemlidir. Ancak, erken embriyo bakteriyel patojenler dış maruz karşı oldukça dirençlidir. Aslında, embriyolar bakteriyel süspansiyon içinde kalmış olan batırma testleri, bizim elimizde 22 tekrarlanabilir değildir. Bazı embriyolar daldırma üzerine bulaşabilir ederken, ölüm oranları ve ekspres büyük bir değişim gözlemledikBu tür testler bireysel embriyoları arasında inflamatuvar belirteç genlerin iyon. Bu makalede açıklanan mikro-enjeksiyon yöntemleri tekrarlanabilir enfeksiyonları ulaşmak ve host doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ile bakteriyel etkileşimleri çalışmak için özellikle faydalıdır. Bireysel embriyolarında bakteriyel enfeksiyon ölçmek için etkin bir yaklaşım ısmarlama, özel piksel ölçümü yazılımı 17, 23 ile enfekte embriyoların floresan görüntüleri analiz etmektir. Bu yaklaşım enfekte embriyoların sonra kaplama kob sayımı sonuçları ile iyi bir korelasyon olduğu gösterilmiştir. Benzer şekilde, embriyo başına lökosit sayısında göreceli değişiklikler transgenik lökosit fluorofor muhabiri hatlarında dijital görüntü analizi ile ölçülebilir edilmiştir; bu yaklaşım enfeksiyon 24 konak leukopoietic yanıt miktarının için geçerli olacaktır. Konak doğuştan gelen bağışıklık genlerin işlevine tarif enfeksiyonu modelleri birleştirerek in vivo olarak etkili bir şekilde araştırılmıştır edilebilirmorfolino devirme ile. Morpholinos belirli bir hedef RNA ve bu Journal 10, 25 in diğer video makaleler gösterildiği gibi, 1-hücre aşaması zebrafish embriyosu içine enjekte edildiğinde gen ürünleri ifadesi azaltmak sentetik antisens oligonükleotidler şunlardır. Morfolino Knockdown çalışmalarda, karşılaştırılmak üzere tüm embriyo gruplar bakteriyel enjeksiyonları öncesinde doğru sahnelenir büyük önem taşımaktadır. Embriyo zaman içinde giderek yetkin hale gelişmekte olan bir bağışıklık sistemine sahip, çünkü bu özellikle önemlidir. Zebra balığı embriyolarının en önemli doğal immün alt, makrofaj ve nötrofiller, ayırt etmek için şu anda birçok transgenik muhabiri hatları vardır. Mpx ve lyz arttırıcılar nötrofil raportör çizgileri 16, 26, 27 üretmek için kullanılmış olan ve csf1r (FMS) ve mpeg1 arttırıcılar makrofaj gazetecilere 14, 28 üretmek için kullanıldı. Iken csf1r (FMS) ayrıca xanthophores ifade edilir, MPEG1 ifade makrofajlarda münhasıran. Bu video madde de gösterildiği üzere, yeni geliştirilen mpeg1 raportör hatları makrofajların görüntüleme bakteriyel fagositozunu için son derece yararlıdır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Satıcı </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Fenol Red </td><td> Sigma </td><td> P0290 </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 228210 </td></tr><tr><td> Difco Middlebrook 7H10 agar </td><td> Becton, Dickenson ve Şirket </td><td> 262710 </td></tr><tr><td> BBL Middlebrook OADC Zenginleştirme </td><td> Becton, Dickenson ve Şirket </td><td> 211886 </td></tr><tr><td> Difco Middlebrook 7H9 Broth </td><td> Becton, Dickenson ve Şirket </td><td> 271310 </td></tr><tr><td> BBL Middlebrook ADC Zenginleştirme </td><td> Becton, Dickenson ve Şirket </td><td> 211887 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> Polivinilpirrolidon (PVP40) </td><td> Calbiochem, Merck KGaA </td><td> 529504 </td></tr><tr><td> N &lt;/ Em&gt;-Phenylthiourea (PTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7629 </td></tr><tr><td> Etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu (Tricaine) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td></tr><tr><td> Metil selüloz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0387 </td></tr><tr><td> SeaPlaque Agaroz (düşük erime noktası agaroz) </td><td> Lonza A.Ş. </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1.0 mikron, kırmızı floresan (580/605)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8821 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1.0 mikron, (505/515) sarı-yeşil flüoresan) </td><td> Invitrogen </td><td> F8823 </td></tr></tbody></table>

hücre içi bakteriyel patojenler ile zebra balığı embryolarının enfeksiyon

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebra balığı (Danio rerio) embriyo giderek-konak ilişkilerinin 1 omurgalı doğuştan gelen bağışıklık sisteminin fonksiyonunu incelemek için bir model olarak kullanılmaktadır. Doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli hücre tipleri, makrofaj ve nötrofiller, önce adaptif immün yanıtları için gerekli olan lenfositlerin olgunlaşması için embriyogenezisin ilk günlerinde gelişir. Embriyoların sayıda elde kolaylığı, dış gelişme, embriyonik ve larva aşamalarını optik şeffaflık nedeniyle erişilebilirlik, genetik araçları, transgenik muhabiri hatları geniş mutant kaynakları ve koleksiyonları, geniş bir yelpazede tüm zebrabalıkları çok yönlülüğünü eklemek modeli. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) ve Mycobacterium marinum makrofaj hücre içinde bulunabilir ve sık Zebra balığı embriyolarının-konak ilişkilerinin incelemek için kullanılır. Bu iki enfeksiyonu süreçlerbakteriyel patojenler karşılaştırmak ilginç çünkü S. typhimurium enfeksiyonu M. ise, akut ve bir gün içinde ölümcüldür marinum enfeksiyonu kronik ve larva dönemi 2, 3 kadar görüntülenebilir. Embriyo (Şekil 1) bakterilerin mikro-enjeksiyon sitesi enfeksiyon hızla sistemik olacak veya başlangıçta lokalize kalır belirler. Hızlı bir sistemik enfeksiyon ile kurulabilir mikro-enjeksiyon doğrudan posterior kan adada kaudal ven yoluyla kan dolaşımı içine veya Cuvier, gövde damar kalbe bağlayan yolk kesesi üzerinde geniş bir sirkülasyon kanalı Kanal yoluyla bakteri. 1 dpf&#39;e anda, bu aşamada embriyo phagocytically aktif makrofajlar var ama nötrofiller henüz kan adaya enjekte, olgun olmadığı zaman tercih edilir. Embriyolar da fonksiyonel (miyeloperoksidaz üretmeyen) nötrofil, geliştirdik 2-3 dpf&#39;e, az enjeksiyon için Cuvier ve Kanal t olarak tercih edilmektedirdiye enjeksiyon yerinde. Lokal enfeksiyonlar doğru miyeloid hücrelerin yönettiği göç çalışmak için, bakteri kuyruk kas, otik vezikül veya arka beyin ventrikül 4-6 enjekte edilebilir. Buna ek olarak, notokord miyeloid hücrelere normal erişilmez gibi görünen bir yapı, lokal enfeksiyon 7 son derece duyarlı. Yüksek hacimli uygulamalar için kullanışlı bir alternatif gübreleme 8 sonraki ilk saat içinde embriyo sarısı içine bakteri enjekte edilmesidir. Floresan makrofaj veya nötrofil ile floresan bakteri ve transgenik zebrabalıkları çizgileri birleştirerek-konak ilişkilerinin çok-renkli görüntüleme için ideal şartlar oluşturur. Bu video makalede S. ile Zebra balığı embriyolarının damardan ve lokal enfeksiyon için ayrıntılı protokoller açıklayacağız typhimurium veya M. marinum bakteri ve doğuştan gelen bağışıklık sistemi hücreleri ile etkileşim sonraki floresans görüntüleme için.

Şeffaf zebrabalıkları embriyolar gibi görselleştirmek için faydalı model bilgisayarlar ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ve hücre içi bakteriyel patojenler arasında işlevsel çalışma etkileşimleri, kanıtladık<em&gt; Salmonella typhimurium</em&gt; Ve<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt;. Bakteri ve çok-renkli floresans görüntüleme mikro-enjeksiyon zebrafish embriyo enfeksiyonu modellerinin uygulaması ile ilgili önemli tekniklerdir.

Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon

Zebrafish (Danio rerio) embriyoları, konak-patojen etkileşimlerinde omurgalı doğuştan gelen bağışıklık sisteminin işlevini incelemek için giderek daha fazla bir model olarak kullanılmaktadır...

Bu prosedürün genel amacı, konak bağışıklık hücreleriyle olan etkileşimin canlı görüntülemesi için zebrafish embriyolarına floresan işaretli bakterilerin mikroenjeksiyonunu gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle enjeksiyon iğnesinin hazırlanması ve bakteri süspansiyonları ile doldurulmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, embriyolar evrelendirilir ve bir enjeksiyon plakası üzerinde hizalanır.Ardından, lokal veya sistemik bir bakteriyel enfeksiyon oluşturmak amacıyla bakteriyel inokülum uygun bir yolla enjekte edilir. Son olarak, embriyolar monte edilir ve görüntülenir. Nihayetinde, floresans ve konfokal mikroskopi aracılığıyla, şeffaf zebrafish embriyo konakçısının floresan fagositleri içindeki bakteriyel patojenlerin hücre içi lokalizasyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.Zebrafish embriyo modeli, konakçı-patojen etkileşimlerinin canlı görüntülemesi için oldukça güçlü olduğundan, bu yöntem immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, sistemik enfeksiyon için bakterilerin zebrafish embriyolarının kan dolaşımına veya lokal enfeksiyonlar oluşturmak için belirli bölmelere tekrarlanabilir şekilde mikroenjeksiyonu yapılması çok fazla pratik gerektirdiğinden zorluk yaşayacaklardır. Cam mikrokapiler iğneler çekilip uçları 45 derecelik açıyla eğimlendirildikten sonra, tutarlı kan dolaşımı kontrol edilerek döllenmeden sonraki 28. saatteki zebrafish embriyoları hazır hale getirilir. Gözde pigmentasyonun başlaması, kuyruğun düz olması ve kalbin gözün hemen ventralinde konumlanmış olması kontrol edilir.Embriyolar anesteziye alındıktan sonra, iğneyi önceden hazırlanmış bakteriyel inokulum ile doldurmak için bir mikro yükleyici uç kullanın. Dolu iğneyi bir standa bağlı mikro manipülatöre monte edin ve stereo mikroskop altına yerleştirin. Enjeksiyon süresini 0.2 saniye ve kompanzasyon basıncını 15 Hector Pascal olarak ayarlayın.Kullanılan iğne için doğru enjeksiyon hacmini elde etmek amacıyla enjeksiyon basıncını 700 ve 900 Hector Pascal arasında ayarlayın. Enjeksiyondan önce, yüklü iğneye sahip mikro manipülatörü doğru konuma getirin. Anestezili embriyoları düz bir %1 agaroz enjeksiyon plakasına yerleştirin ve fazla yumurta suyunu uzaklaştırın.Ardından, her bir enjeksiyon için embriyoları hizalamak amacıyla bir saç döngü aracı (hair loop tool) kullanın. Enjeksiyonlar sırasında embriyoların kuyrukları iğne ucuna bakacak şekilde konumlandırmak için plakayı elle hareket ettirin. İğne ucunu, ürogenital açıklığın yakınındaki koddle veninin doğrudan üzerine yerleştirin.İğne ucuyla peridermi delin ve istenilen dozda floresan işaretli bakteri enjekte edin. Yaklaşık 250 koloni oluşturan birim veya CFU salmonella typhimurium ve yaklaşık 120 CFU mycobacterium marum kullanıyoruz. Enjeksiyon sonrası nabzın hemen ardından vasküler sistemde genişleyen bir hacim olup olmadığı kontrol edilerek, enjeksiyonun doğru yapılıp yapılmadığı belirlendiğinde, enjekte edilen bakteriyel süspansiyon koddle veni üzerinden kan akışını takip ederek kalbe doğru ilerleyecektir.Deney boyunca enjeksiyon hacminin aynı kaldığını sık sık kontrol edin. Enjeksiyonların deney süresince tutarlılığını kontrol etmek için, bakteri büyüme ortamı üzerindeki bir damla steril PBS'ye doğrudan bir damla bakteri enjekte edin. Yaklaşık her 30 embriyo enjeksiyonundan sonra, bu damlayı plaklayın ve inkübasyon sonrası bakteri kolonilerini sayın.Enjeksiyon hacmindeki CFU'yu belirlemek için, enjeksiyondan hemen sonra kan akışında dolaşan tekil floresan styria hücrelerini gözlemlemek üzere floresan stereo mikroskop kullanın ve düzgün şekilde enjekte edilmemiş embriyoları ayıklayın. M marum bakterilerinin floresan agregaları, enfeksiyondan iki gün sonrasına kadar görünür olmalı ve zamanla büyümelidir. Cuvier kanalına enjeksiyon yapmak için, döllenmeden iki ila üç gün sonrası aşamasındaki anestezi uygulanmış embriyoları hizalayın.Embriyonun dorsal tarafından 45 derecelik açıyla yapılan ductus cuvier enjeksiyonu için iğneyi, ductus cuvier'in başlangıç noktasına yerleştirin. Arka beyin ventrikülü enjeksiyon pozisyonu için, kanalın vitellüs kesesi üzerinde genişlemeye başladığı yerin hemen dorsal kısmını seçin. Döllenmeden 32 saat sonraki embriyoları, dorsal tarafları iğne ucuna bakacak şekilde anesteziye tabi tutun.Kuyruk kaslarına enjeksiyon yapmak için iğneyi, nörohelium'a dokunmadan anterior bir pozisyondan hindbrain ventrikülüne yerleştirin. Anestezilenmiş, fertilizasyon sonrası bir ila iki günlük embriyoları, kuyrukları iğne ucuna bakacak şekilde konumlandırın ve iğne yaklaşık 65 derecelik bir açıyla, otik vezikül enjeksiyonu için ürogenital açıklığın üzerindeki kasa enjekte edin. Anestezilenmiş, fertilizasyon sonrası iki ila üç günlük embriyoları, kuyrukları iğneye doğru bakacak şekilde yönlendirin.Bir ila iki günlük döllenme sonrası embriyolarda, kuyruğu iğneden uzağa bakacak şekilde konumlandırın. İğneyi 65 derecelik bir açıyla ve düşük basınçla, kuyruk kas dokusu üzerinden nod korduna enjekte edecek şekilde yerleştirin.16 ila 1000 hücre evresindeki embriyoların vitellus enjeksiyonu için, enfeksiyonu görüntülemek amacıyla iğneyi koriondan geçirerek vitellusun merkezine batırın. Enfekte embriyoları, trica içeren yumurta suyu ile kaplanmış %1'lik augurous katmanlı bir Petri kabında anesteziye alın. Floresan stereo mikroskop altında görüntüleme için embriyoları, bir kıl halka (hair loop) aracı kullanarak doğru konuma hizalayın.Enjeksiyondan hemen sonra, kan dolaşımındaki bireysel floresan işaretli T hücreleri gözlemlenebilir. Yan görünümden farklı bir konum gerekiyorsa, embriyolar %1,5 metil selüloz içerisine yerleştirilmeli ve enfeksiyonun ters konfokal mikroskop kullanılarak görüntülenmesi için embriyoyu istenen konuma getirmek amacıyla bir kıl loop aracı kullanılmalıdır.Cam tabanlı bir kaba düşük erime noktalı aeros damlatın. Anestezize edilmiş embriyoyu, sınırlı miktarda yumurta suyu ile birlikte aeros damlasının içine yerleştirin ve embriyoyu uygun konuma getirmek için bir saç teli halka (hair loop) aleti kullanın. Aerosun katılaşmasını bekleyin ve ardından aeros damlasını trica içeren yumurta suyuna batırın.Numune artık konfokal görüntüleme için hazırdır; fertilizasyondan bir gün sonraki embriyoların kan adacıklarına salmonella typhimurium veya mycobacterium marum bakterileri enjekte edilir. Bu işlem, makrofajlar tarafından hızlı fagositozla sonuçlanır; nispeten büyük ve parlak floresan DS.Red etiketli styrian bakterilerinin yayılımı, enfeksiyondan iki saat sonra stereo floresan ve konfokal görüntüleme ile doğrudan görüntülenebilir. Enfeksiyon sonrası görüntüleme, birçok bakterinin floresan makrofajlar tarafından fagositoz edildiğini göstermektedir.Yabani tip styria'nın 250 CFU'luk bir enjeksiyon dozu, güçlü bir pro-inflamatuar yanıt oluşturur ve bir gün içinde ölümcüldür. Buna karşılık, erum'un intravenöz enjeksiyonu, enfekte makrofajların tüberkülozun ayırt edici özelliği olan granülomların başlangıç aşamaları olarak kabul edilen sık agregatlar oluşturduğu kalıcı bir enfeksiyona yol açar. Transgenik EG one EGFP hattında, enfeksiyondan beş gün sonra böyle bir granülom benzeri agregatın konfokal görüntülemesi, m cherry ile işaretlenmiş M num bakterilerinin hücre içi büyümesini göstermektedir.Yeşil floresanla işaretlenmiş makrofajların içinde, bakteriler, döllenmeden 32 saat sonra makrofajlardan yoksun bir bölme olan arka beyin ventrikülüne enjekte edilebilir; bu bölmeye 20 ila 100 M cherry işaretli M marum bakterilerinin enjekte edilmesi, burada gösterildiği gibi, bakterileri fagosite eden makrofajların hızlı infiltrasyonuna yol açar. Transgenik M-P-X-E-G-F-P kullanılarak, otik veziküle yaklaşık 20 CFU Styria enjeksiyonu, enfeksiyondan üç saat sonra nötrofillerin çekilmesine neden olur. Bu yanıt PBS kontrol enjeksiyonlarında gözlemlenmezken, lökosit infiltrasyonuna dirençli olduğu görülen notokord, diğer dokulara enjekte edildiklerinde güçlü şekilde atenüye olan erum mutantlarının büyümesi için uygun bir bölmedir.2240 CFU dozundaki bakterilerin sarı keseye enjekte edilmesini takiben, bakteriler birkaç gün boyunca embriyonik dokulara yayılır ve granülom benzeri agregatlar oluşturur. Bunlar, geleneksel intravenöz enjeksiyon yöntemiyle gözlemlenenlere benzerdir. Bu prosedür uygulanırken, embriyonik bağışıklık sisteminin gelişim sırasında giderek daha yetkin hale gelmesi nedeniyle, zebrafish embriyolarının uygun şekilde evrelendirilmesinin kritik olduğunu unutmamak önemlidir.Bu prosedürün ardından, embriyonik doğuştan gelen bağışıklık sisteminin patojenik enfeksiyonlara nasıl yanıt verdiği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla transkriptom profilleme ve immünohistokimya gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

infection-of-zebrafish-embryos-with-intracellular-bacterial-pathogens

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Zebra balığı hızla gelişmesi, küçük boyutu ve şeffaflık enfeksiyon doğal immün kontrolü çalışması için çok büyük avantajları...

Zebra balığı Larva yılında Dissemine Kandidiyazis non-invaziv Görüntüleme

Bu videoda, Yetişkin Zebra Balığı'nın karın boşluğuna solüsyon iletmek için bir yöntem olan intraperitoneal enjeksiyon tekniği açıklanmaktadır.

İntraperitoneal Enjeksiyon: Yetişkin Bir Zebra Balığının Karın Boşluğuna Çözelti Verme Yöntemi

Kaynak: Zhang, X., ve diğerleri. Biyomateryalle İlişkili Staphylococcus aureus Enfeksiyonunun İn Vivo Görselleştirmesi ve İntravital Analizi için Zebra Balığı Embriyo Modeli. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, Staphylococcus aureus enjekte edilen zebra balığı embriyolarının floresan görüntülemesini göstererek, biyomateryal mikrokürelerin in vivo konakçı-patojen etkileşimleri üzerindeki etkisini değerlendirmek için enfeksiyon ilerlemesinin ve bakteri dağılımının ölçülmesini sağlar.

 Zebra Balığı Embriyolarında Biyomateryalle İlişkili Bakteriyel Enfeksiyonun Floresan Görüntülemesi

Kaynak: Zhang, X. ve diğerleri, Biyomateryalle ilişkili Staphylococcus aureus Enfeksiyonunun İn Vivo Görselleştirmesi ve İntravital Analizi için Bir Zebra Balığı Embriyo Modeli. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, implante edilmiş biyomateryallerle bağlantılı enfeksiyonları incelemek için bir zebra balığı embriyo modelini göstermektedir. Staphylococcus aureus'un polistiren mikrokürelerle enjekte edilmesi, implante edilen materyallerin enfeksiyonu teşvik edici rolünü doğrulayarak bakterilerin hayatta...

Zebra Balığı Embriyoları Kullanılarak İmplantla İlişkili Bakteriyel Enfeksiyonların İn Vivo Analizi

Kaynak: Shi, J. ve ark., Bitki patojenlerinin salgılanan efektörlerinden RNA susturucu baskılayıcılarının taraması ve tanımlanması. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, asetosyringon ile virülans gen ifadesi indükleyerek Agrobacterium tumefaciens kültürünün hazırlanması ve ardından antibiyotik çıkarılması ile yıkama ve yeniden süspansiyon ile yapılmasını ve bitki dokularına gen taşınması için dönüşüme hazır bir süspansiyon oluşturulmasını göstermektedir.

Zebrafish embriyolarının kaudal damarına bakterilerin mikroenjeksiyonu

Kaynak: Bernut, A. ve ark., Zebrafish embriyolarında Mycobacterium abscessus'un Patogenezi ve Kordonlanmasının Çözülmesi ve Görüntülemesi. J. Vis. Deneyim (2015).Bu video, enfekte bir zebrafish embriyosundan Mycobacterium abscessus'u izole etmek ve nicelik ölçmek için bir protokolü göstermektedir. Bu işlem, embriyo ötenazisi, doku lizizasyonu ve homojenizasyonu ile bakterilerin serbest bırakılmasını, ardından santrifüj ve yüzeyaktif bir tamponda yeniden süspansiyonu içerir. Son olarak,...

Zebrafish embriyolarından bakterilerin izolasyonu ve yetiştirilişi enfeksiyon yükünü değerlendirmek için

Kaynak: Flores, E. ve diğerleri. Zebrafish larvalarında gıda kaynaklı enfeksiyonlar için protozoan paramecium caudatum aracı olarak kullanılması. J. Vis. Exp. (2019).Bu video, zebrafish larvalarında floresan E. coli enfekte paramecia ile beslenerek gıda kaynaklı bakteriyel bağırsak enfeksiyonu modeli oluşturma yöntemini göstermektedir.

Zebrafish larvalarında Bağırsak Enfeksiyonunun Gıda Kaynaklı Bakterilerle Modellenmesi

Optik olarak şeffaf zebra balığı embriyoları, patojenik mikroorganizmalar ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri gerçek zamanlı olarak incelemek ve görselleştirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Mycobacterium abscessus'un mikro enjeksiyonu, floresan görüntüleme ile birlikte, zebra balığı embriyolarında kordon oluşumu gibi temel patojenik özellikleri incelemek için kullanılır.

Görüntüleme Patogenez ve Cording Deşifre ve<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Zebra balığı Embriyolar

Bu da çalışmanın bir zebra balığı embriyo modeli içinde vivo görselleştirme ve enfeksiyonu floresans mikroskobu göre zaman içinde biomaterial ilgili intravital analizi için açıklar. Bu model içinde vivo biomaterial ilişkili enfeksiyonların çalışmak için fare modelleri gibi memeli hayvan modelleri tamamlayan gelecek vaat eden bir sistemdir.

Bir zebra balığı embriyo Model In Vivo görselleştirme ve Staphylococcus aureus Intravital analiz Biomaterial ilişkili enfeksiyon

Bu protokol, Mycobacterium marinum enfeksiyonu sırasında embriyonik zebra balığında makrofaj davranışını ve ölümü görselleştirmek için bir tekniği açıklamaktadır. Bakterilerin hazırlanması, embriyoların enfeksiyonu ve intravital mikroskopi için adımlar dahildir. Bu teknik, enfeksiyon veya steril inflamasyon içeren benzer senaryolarda hücresel davranış ve ölüm gözlem uygulanabilir.

İntravital Mikroskopi ile Zebrabalığı Embriyolarında Mikobakteriyel Enfeksiyon Sırasında Makrofaj Litik Hücre Ölümünün Görüntülenmesi

Şu anda kronik bakteriyel enfeksiyonlara karşı ilaç taramasına uygun in vivo modellerin eksikliği vardır. Burada, zebra balığı larvalarında kalıcı bir enfeksiyon oluşturmak için bir Pseudomonas aeruginosa klinik izolatı ile yara enfeksiyonu için bir protokol açıklıyoruz.

Yaralı Zebra Balığı Larvalarında Kalıcı Pseudomonas aeruginosa Enfeksiyonunun Modellenmesi

Öğrenin, mikroenjeksiyon ve canlı görüntüleme teknikleriyle Danio rerio embriyolarında bakteriyel patojenler ile konak bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemeyi. Bu yöntem, bağışıklık yanıtlarını anlamak için güçlü bir model sunar.

Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon

Daha fazla video keşfet