Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon

Bu prosedürün genel amacı, konakçı bağışıklık hücreleri ile etkileşimin canlı görüntülenmesi için zebra balığı embriyolarına floresan bakteriler ile mikro enjekte etmektir. Bu, önce enjeksiyon iğnesinin bakteri süspansiyonları ile hazırlanması ve yüklenmesi ile gerçekleştirilir. Daha sonra, embriyolar bir enjeksiyon plakası üzerinde sahnelenir ve hizalanır.

Daha sonra bakteriyel aşı, lokal veya sistemik bir bakteriyel enfeksiyon elde etmek için bir yol kullanılarak enjekte edilir. Son olarak embriyolar monte edilir ve embriyolar görüntülenir. Sonuç olarak, floresan ve konfokal mikroskopi yoluyla şeffaf zebra balığı embriyonik konağının floresan fagositleri içindeki bakteriyel patojenlerin hücre içi lokalizasyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem, immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, çünkü zebra balığı embriyo modeli, konakçı patojen etkileşimlerinin yaşam görüntülemesi için çok güçlüdür, Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, çok fazla pratik gerektirdiğinden mücadele edeceklerdir Sistemik enfeksiyon için zebra balığı embriyolarının kan dolaşımına veya lokal enfeksiyonları elde etmek için belirli bölmelere bakteri ürkütücü bir şekilde mikro enjekte etmek. Cam mikro kılcal iğneleri çektikten ve uçları 45 derecelik bir açıyla eğimlendirdikten sonra, zebra balığı embriyolarını döllenmeden 28 saat sonra tutarlı kan dolaşımını kontrol ederek evrelendirin. Gözde pigmentasyonun başlaması, düz bir kuyruk ve kalbin göze tam ventral olarak konumlandırılması.

Embriyolar uyuşturulduktan sonra, iğneyi önceden hazırlanmış bir bakteri aşısı ile yüklemek için bir mikro yükleyici ucu kullanın. Yüklenen iğneyi bir standa bağlı bir mikro manipülatöre monte edin ve stereo mikroskop altında konumlandırın. Enjeksiyon süresini 0,2 saniyeye ve dengeleme basıncını 15 Hektor Paskal'a ayarlayın.

Kullanılan iğne için doğru enjeksiyon hacmini elde etmek için enjeksiyon basıncını 700 ile 900 Hektor Paskal arasında ayarlayın. Enjeksiyondan önce mikro manipülatörü yüklü iğne ile doğru konuma getirin. Anestezi uygulanmış embriyoları düz% 1 agaroz enjeksiyon plakasına yerleştirin ve fazla yumurta suyunu alın.

Ardından, her enjeksiyon için embriyoları hizalamak için bir saç halkası aleti kullanın. Embriyoları kuyrukları iğne ucuna bakacak şekilde yönlendirmek için enjeksiyonlar sırasında plakayı elinizle hareket ettirin. İğne ucunu doğrudan ürogenital açıklığa yakın bir coddle veninin üzerine yerleştirin.

Peridermi iğne ucuyla delin ve istenen dozda floresan etiketli bakteri enjekte edin. Yaklaşık 250 koloni oluşturan birim veya CFU'su salmonella typhimurium ve yaklaşık 120 CFU'su mycobacterium marum kullanıyoruz. Enjekte edilen bakteri süspansiyonu, nabızdan hemen sonra vasküler sistemin genişleyen bir hacmini kontrol ederek enjeksiyonun doğru bir şekilde yapılması durumunda, coddle veninden kalp monitörüne doğru kan akışını takip edecektir.

Deney sırasında enjeksiyon hacminin aynı kaldığını sık sık kontrol edin. Deney boyunca enjeksiyonların tutarlılığı için bir kontrol sağlamak için, bir damla bakteriyi doğrudan bakteri üreme ortamındaki bir damla steril PBS'ye enjekte edin. Yaklaşık her 30. embriyo enjeksiyonundan sonra, bu damlayı kapatın ve inkübasyondan sonra bakteri kolonilerini sayın.

Enjeksiyon hacmindeki CFU'yu belirlemek için, enjeksiyondan hemen sonra kan dolaşımında dolaşan tek tek floresan stiria hücrelerini gözlemlemek için bir floresan stereo mikroskop kullanın ve uygun şekilde enjekte edilmeyen embriyoları atın. M marum bakterilerinin floresan agregatları, enfeksiyondan iki gün sonra görünür olmalı ve zamanla daha da büyümelidir. Cuvier kanalına enjekte etmek için, döllenmeden iki ila üç gün sonra embriyoları uyuşturun.

Embriyonun dorsal tarafından 45 derecelik bir açıyla coddle ven enjeksiyonuna gelince, iğneyi cuvier kanalının başlangıç noktasına yerleştirin. Arka beyin ventrikül enjeksiyon pozisyonu için kanalın yumurta sarısı kesesi üzerinde genişlemeye başladığı yere sadece dorsal. Döllenmeden 32 saat sonra embriyoları sırt tarafları iğne ucuna doğru olacak şekilde uyuşturun.

Kuyruk kaslarına enjekte etmek için nöro helyuma dokunmadan iğneyi ön konumdan arka beyin ventrikülüne sokun. Döllenmeden bir ila iki gün sonra anestezi uygulanan embriyoları kuyrukları iğne ucuna bakacak şekilde ve iğne yaklaşık 65 derecelik bir açıyla yerleştirin, otik vezikül enjeksiyonu için ürogenital açıklığın üzerindeki kas içine enjekte edin. Döllenmeden iki ila üç gün sonra, embriyoları kuyrukları iğneye doğru bakacak şekilde uyuşturun.

Bir ila iki gün kullanarak düğüm kordonuna enjekte etmek için 65 derecelik bir açıyla ve düşük basınçta enjekte edin. Kuyruğu iğneden uzağa bakacak şekilde döllenme sonrası embriyolar. İğneyi kuyruk kas dokusundan kordonun içine sokun.

16 ila 1000 hücre aşamasının yumurta sarısı enjeksiyonu için, embriyolar, enfeksiyonu görüntülemek için iğneyi corion'dan yumurta sarısının ortasına delin. Enfekte embriyoları, trica içeren yumurta suyu ile kaplı% 1 burgulu katmanlı bir Petri kabında uyuşturun. Bir saç halkası aleti kullanarak, embriyoları floresan stereo mikroskop altında görüntüleme için doğru pozisyonda hizaladı.

Enjeksiyondan hemen sonra kan dolaşımında dolaşan bireysel floresan s tym hücreleri görülebilir. Yanal görünümden farklı bir pozisyon gerekiyorsa. Embriyoları% 1.5 metil selüloza monte edin ve ters konfokal bir mikroskop kullanarak enfeksiyonu görüntülemek için embriyoyu gerekli konuma manipüle etmek için bir saç halkası aleti kullanın.

Cam tabanlı bir tabağa bir damla düşük erime noktalı aeros koyun. Anestezi uygulanmış embriyoyu sınırlı miktarda yumurta suyu ile aero damlaya yerleştirin ve embriyoyu pozisyonuna getirmek için bir saç halkası aleti kullanın. Aero'nun katılaşmasına izin verin ve aero damlasını trica içeren yumurta suyuna batırın.

Numune artık konfokal görüntüleme için hazırdır: salmonella typhimurium veya mycobacterium marum bakterilerinin bir günde embriyoların kan adasına enjeksiyonu. Döllenme sonrası, makrofajların nispeten büyük ve parlak floresan DS'nin yayılmasıyla hızlı fagositoz ile sonuçlanır. Kırmızı etiketli Steiermark bakterileri stereo floresan ve konfokal görüntüleme ile iki saatte doğrudan görüntülenebilir. Enfeksiyon sonrası, birçok bakterinin floresan makrofajlar tarafından fagositoz olduğunu gösterir.

250 CFU vahşi tip styria enjeksiyon dozu, güçlü bir pro-enflamatuar tepkiye neden olur ve bir gün içinde öldürücüdür. Buna karşılık, intravenöz erum enjeksiyonu, enfekte makrofajların, tüberkülozun ayırt edici özelliği olan granülomların ilk aşamaları olarak kabul edilen sıkı agregalar oluşturduğu kalıcı bir enfeksiyona yol açar. Enfeksiyondan beş gün sonra transgenik EG bir EGFP hattındaki agrega gibi bir granülomun konfokal görüntülemesi, M num bakteri etiketli m kirazının hücre içi büyümesini gösterir.

Yeşil floresan makrofajların içinde, bakteriler döllenmeden 32 saat sonra makrofajlardan yoksun bir bölme olan arka beyin ventrikülüne enjekte edilebilir, bu bölmeye 20 ila 100 M kiraz etiketli M marum bakterisinin enjeksiyonu, burada gösterildiği gibi bakterileri fagositoz eden makrofajların hızlı bir şekilde sızmasına yol açar. Transgenik M-P-X-E-G-F-P kullanılarak, otik veziküle yaklaşık 20 CFU Styria enjeksiyonu, enfeksiyondan üç saat sonra nötrofillerin çekilmesine yol açar. PBS kontrol enjeksiyonlarında bu yanıt gözlenmese de, lökositler tarafından infiltrasyona dirençli gibi görünen notokord, diğer dokulara enjekte edildiğinde güçlü bir şekilde zayıflayan erum mutantlarının büyümesi için izin verilen bir bölmedir.

Bir doz 2240 CFU erum bakterisinin boyunduruk enjeksiyonunu takiben, birkaç gün içinde embriyonik dokulara yayılır ve granülom benzeri agregatlar oluşturur. Konvansiyonel intravenöz enjeksiyon yönteminde gözlemlenenlere benzer. Bu prosedürü denerken, zebra balığı embriyolarının uygun şekilde evrelendirilmesinin kritik öneme sahip olduğunu hatırlamak önemlidir, çünkü embriyonik bağışıklık sistemi gelişim sırasında giderek daha yetkin hale gelir.

Bu prosedürü takiben, embriyonik doğuştan gelen bağışıklık sisteminin patojenik enfeksiyonlara nasıl yanıt verdiği gibi ek soruları yanıtlamak için transkriptom profillemesi ve immünohistokimya gibi diğer yöntemler uygulanabilir.