Name: Normal İnsan Beyin Çözünür ve çözünmez PrP Oligomerleri İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Öğrenin, normal insan beyninden çözünür ve çözünmez prion proteinlerini izole etme yöntemini. Homojenizasyon, ultrasantrifüjasyon ve boyut dışlama kromatografisi teknikleriyle nörodejeneratif hastalık araştırmalarına katkı sağlayın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

yazarlar normal beyin numuneleri sağlamak için İnsan Beyin ve Omurilik Sıvısı Kaynak Merkezi (Los Angeles, CA) müteşekkiriz. Bu çalışma McGregor Vakfı&#39;nın desteği ve Cumhurbaşkanı İhtiyari Fonu (Case Western Reserve Üniversitesi) ile Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01NS062787, CJD Vakfı, İttifak BioSecure yanı sıra Üniversite Yaşlanma Merkezi ve Sağlık tarafından desteklenen .

1. Beyin Homojenat ve Deterjan-Çözünür (S2) ve çözünemeyen (P2), fraksiyonlar hazırlanması <ol><li> 100 mg insan dondurulmuş beyin dokusu almak ve (10 mM Tris, 150 mM NaCl,% 0.5 Nonidet P-40 (NP-40),% 0.5 EDTA, pH 7.4) 100 ul lizis tamponu ilave edin. </li><li> Bir akülü motor tarafından tahrik havaneli kullanarak buz üzerinde homojenize, bu da 20 olan 5 dk için kuru buz içinde dondurmak ve motor tarafından ilk ve sonra eller tarafından tahrik havaneli kullanarak tekrar homojenize ve 300 ul veya 800 ul lizis tamponu (ekleyin % veya 10% toplam beyin homojenat, sırasıyla). </li><li> 4. 10 dakika ° C benchtop santrifüj kullanarak süpernatant (S1) toplamak için 1000 xg&#39;de% 20 veya% 10 toplam beyin homojenat santrifüjleyin. </li><li> 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca bir SW55 rotor içinde 35,000 rpm (100,000 xg) (Beckman Coulter, Fullerton, CA)% 10 S1 Ultrasantrifüj Temiz bir tüp içine deterjan çözünebilen fraksiyonu içeren süpernatan (S2) aktarın. Çözünmeyen deterjan içeren granül süspanseya da 5-kat konsantre hazırlama - 100 ul ya da 10 yapmak için 200 ul lizis tamponu içinde fraksiyonu (P2). </li><li> PK-sindirim, S2 ve P2 fraksiyonların her ikisi için de, 1 saat boyunca 37 ° C &#39;de 50 ug / ml&#39; de PK aynı miktarda örnek inkübe edilir. 5 mM ve PK sindirim sonlandırmak için SDS numune tamponu (% 3 SDS, 2 mM EDTA,% 4 β-merkaptoetanol,% 10 gliserol, 50 mM Tris, pH 6,8) ve eşit hacimde son konsantrasyon phenylmethylsulfonyl fluorür ekleyin. 10 dakika için kaynatılır ve numuneler 5 dakika için oda sıcaklığında soğumasına onları. Onlar Western blot için hazırız. </li></ol> 2. Sukroz Adım Degradeler Hız ve Sedimantasyon <ol><li> Buz üzerinde 30 dakika için H2O içinde% 2 sarkosyl eşit bir hacim ile 450 ul% 20 S1 inkübe edin. </li><li> 0.5 ml% 60 her biri,% 30,% 25,% 20,% 15, ve en fazla 5 ml kapasiteli bir Beckman tüp içine% 10 sakaroz ekleyin. </li><li> 10-60% sakaroz adım degradelerin üstüne S1 0.4 ml yükleyin. </li><li> 4 santrifüjleyin4, 1 saat boyunca 8000 rpm (200,000 xg, SW55 rotor), ° C. </li><li> Her tüpün üst 283 ul fraksiyonu toplayın ve toplam 12 fraksiyon elde. </li><li> Yeni bir Eppendorf tüpüne her bir fraksiyon 20 ul al, 10 dakika boyunca 20 ul örnek bir tampon, ve kaynatılır. </li><li> Kaputu 4 dakika Serin örnekleri, 1 dk ve vorteks onlar için 1.000 xg santrifüj. Bir ön döküm jel üzerine örnekleri yerleştirin. </li></ol> 3. Boyut Dışlama Kromatografisi <ol><li> PrP moleküllerin oligomerik durumunu belirlemek için bir 1 x 30 cm sütun Superdex 200 HR boncukları (Pharmacia, Uppsala, İsveç) kullanın. </li><li> Albümin Dekstran mavi (2.000 kDa), tiroglobulin (669 kDa), apoferritin (443 kDa), β-amilaz (200 kDa), alkol dehidrogenaz (150 kDa), dahil olmak üzere yedi moleküler kütle belirteçleri (Sigma, St Louis, MI) ( 66 kDa), karbonik anhidraz (29 kDa) 200 ul numune hacimlerindeki Sigma tarafından tavsiye edilen konsantrasyonlarda bağımsız olarak yüklenir. </li><li> Mavi Dext elusyon hacminderan ürün komutu tarafından sağlanan boşluk hacmi (V 0 = 8.45 ml) ve toplam hacmi (V t = 24 ml) belirlemek için kullanılır. Pik elüsyon hacmi (V e) ve kromatogram fraksiyonel kestiği hesaplanır. - / (V t - V 0) K av = (V 0 V e): K av, dağılım katsayısı (örnek davranışını tanımlayan), denklem kullanılarak hesaplanır. Kalibrasyon eğrisi standartları 8 günlük MW karşı protein standartlarının K av çizerek belirlenir. </li><li> Farklı FPLC fraksiyonları ele çeşitli PrP türlerin molekül ağırlığı (MW) çeşitli standartları jel filtrasyon ile oluşturulan bir kalibrasyon eğrisine göre değerlendirilir. </li><li> Her çalışma için sütuna 1% sarkosyl içeren lizis tamponu 200 ul S1 enjekte. </li><li> Kromatografi 0.25 ml / dk ve fraksiyonunun bir akış hızında, bir FPLC sistemi (GE Healthcare) içinde gerçekleştirilirin 0.25 ml &#39;lik her bir fraksiyon toplayıcısı (Amersham Biosciences, RediFrac) kullanılarak toplanmıştır. </li><li> 2 saat boyunca -20 ° C&#39;de 0.5 ml önceden soğutulmuş metanol ile 0.125 mL, her fraksiyonda inkübe edin. </li><li> 4. 30 dakika ° C benchtop mikrosantrifüj en çok 13.000 xg&#39;de santrifüjleyin. Süpernatant atılır, oda sıcaklığına kadar soğutulur 10 dakika için kaynar, yukarıda da belirtildiği gibi 20 ul SDS numune tamponu içinde tekrar süspansiyon pelet, bir ön-dökme jel üzerine yerleştirin. </li></ol> 4. G5p tarafından PrP Capture <ol><li> G5p molekülü (100 mikrogram) (nazik Portsmouth, UK Üniversitesi&#39;nden Dr. Geoff Kneale ve John McGeehan tarafından sağlanan) 7 konjuge x 10 8 tosil 1 ml 100 mikrogram G5p ve 350 ul G5p boncuk inkübe ederek manyetik boncuk aktive 20 saat süre ile 37 ° C &#39;de bir fosfat-tamponlu salin (PBS). Dış manyetik kuvvet tarafından Eppendorf tüpleri yan duvarına G5p-boncuk çekin ve sonra tüm çözüm çıkarın. 1 ml PBS içeren boncuklar ile yıkayın% 0.1 sığır üç defa için albümin (BSA) serum. </li><li> Spesifik olmayan bağlanma engellemek için 5 saat için 0.2 M Tris-HCI, 37% 0.1 BSA ihtiva eden pH 7.4 &#39;° C&#39;de 1 ml G5p boncuk ile konjuge inkübe ve sonra PBS içinde 1 ml% 0.1 BSA ihtiva eden boncuk ile yıkayın üç kez yukarıda da belirtildiği gibi. Çözüm çıkarın ve boncuklar içine PBS 1 ml ekleyin. Hazırlanan G5p boncuklar 4 ° C &#39;de en azından 3 ay boyunca stabil </li><li> G5p ile PrP yakalama bağlayıcı tampon, 1 ml 60 ul G5p konjuge boncuklar (10 ug protein / 6 x 10 7 boncuk) (% 3 Tween 20,% 3 NP-S1 ile 100 ul fraksiyon ya da P2 inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir PBS, pH 7.5 &#39;te 40). </li><li> Oda sıcaklığında 3 saat boyunca sabit dönüş ile inkübasyondan sonra, PrP-içeren G5p boncuk çözeltisi içinde çözülmüş bütün moleküller kolayca çıkarılmasına izin veren, harici bir manyetik kuvvet ile Eppendorf tüpleri yan duvarına karşı çekilir. </li><li> Yıkama tamponu ile üç yıkama (% 2 Tween-20 ve PBS içinde% 2 NP-40, pH 7 takiben.5), G5p boncuklar 95 toplanır ve ısıtılır SDS numune tamponu içinde 5 dakika (% 3 SDS, 2 mM EDTA,% 10 gliserol, 50 mM Tris-HCl, pH 6,8) için ° C. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika için örnekler soğutulduktan sonra, numuneler, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüj edilir. Süpernatantlar Western blot için hazırız. </li></ol> 5. Western Blotting <ol><li> Yük örnekleri ~ 80 dakika için 150 V az% 15 mM Tris-HCl, Ölçütleri önceden dökme için jeller (Bio-Rad) üzerine SDS numune tamponu içinde kaynatılır. </li><li> Jelleri üzerinde proteinleri 70V az 2 saat süreyle PVDF transfer edilir. </li><li> % 5 süt içinde bloke sonra zarlar Tris-tamponlu salin% 0.01 Tween-20 ihtiva eden (TBS-T), membranlar 1E4 (1, birincil monoklonal ya da poliklonal antikor 3F4 (1/40.000) ile oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edilmektedir : 1000), anti-N 8 (1:6,000), ya da anti-C PrP molekül tarama için 8 (1:6,000). </li><li> HRP-konjüge at koyun anti-fare IgG ile inkübasyon sonrasında1:3000, ya da eşek anti-tavşan IgG 1:3,000 da PrP bantları, imalatçının protokolüne göre, ECL Plus kullanılarak Kodak film üzerinde görüntülenmiştir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar PrP C çoğu S2 fraksiyonu (Şekil 1) elde edildi rağmen Sporadik CJD&#39;li numuneleri ile karşılaştırıldığında, iPrP C sinin küçük bir miktarı normal beyin içinde P2 fraksiyonunda saptanmıştır. Tam uzunlukta ve N-terminal olarak kısaltılır türler de dahil olmak üzere toplam PrP yaklaşık olarak% 5-25 için önceden 8, iPrP hesaplar belirtildiği gibi. Sukroz adım gradyanı sedimentasyon kullanarak Analizleri olmayan CJD beyninden PrP C çoğunu 1-3 üst kesirler ele iken, PrP küçük miktarlarda da normalde büyük agrega 8 (Şekil içeren alt fraksiyonları 9-11 saptandığını ortaya koydu 2). PrP Sc türlerin çeşitli çaldımonomerlerden ing, daha büyük agregalar küçük oligomerler, Creutzfeldt-Jakob hastalığı (Şekil 3A) ile beyindeki jel filtrasyon ile izole edildi. Bununla birlikte, 2,000 kDa molekül ağırlığı daha yüksek olan büyük agrega küçük bir miktar, aynı zamanda, normal beyin çözünmeyen fraksiyon (Şekil 3C) olarak tespit edildi. Ayrıca, dimerleri ve PrP C tetramers yalnızca çözünmeyen fraksiyonlar hem de çözünebilir fraksiyon (Şekil 3B ve 3C) tespit edilememiştir. PK ve PNGase tedaviden sonra, G5p tarafından yakalanan PrP PrP97-105 8 karşı 1E4 antikoru ile tespit edildi. Üç PK dayanıklı çekirdek parçası olarak adlandırdığı PrP * 20, PrP * 19 ve PrP * 7 sırasıyla ~ 20 kDa, ~ 19 kDa ve ~ 7 kDa (Şekil 4, sol panel) de göç, tespit edildi. 1E4 antikor bir sekans tanım olan bir sentetik peptid ile önceden inkübe edildi, ancak, herhangi bir PrP tespit1E4 ile tespit bantlar PrP parçası bulunmaktadır gösteren 1E4 epitopu (Şekil 4, orta panel) ile ical. Ayrıca, anti-C antikor ~ 18 kDa az iki farklı geçiş PrP fragmanları tespit (PrP * 18) ve PrP ek olarak ~ 12-13 kDa (PrP-CTF12/13), * 20 (Şekil 4, sağ panel). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig1.jpg" /> Şekil 1. IPrP C ve iPrP Sc Algılama. 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de toplam reaksiyon hacmi 1/10 PNGase F ile tedaviden sonra protein, tam uzunluklu ya da N-terminal olarak (S2 ve P2) çözünür ve çözünür olmayan fraksiyonlarının PrP tür kesilmiş izole dan glukanlardır kaldırmak için normal kontrol (CTL) ve sporadik CJD (sCJD) beyin örneklerinde ultrasantrifiij ile PrP23-40 (orta panel) karşı PrP106-112 (sol panel), anti-N karşı 3F4 ile tespit edildi ve PrP karşı anti-C220-231 (sağ panel). Büyük miktarda S2 içinde mevcut iken, CTL örneklerde, PrP küçük bir miktar, P2 olarak tespit edilir. Buna karşılık, daha PrP sCJD örnekleri S2 daha P2 tespit edilir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/3788/3788fig2.jpg" /> Şekil 2. Sükroz adım Degradelerde PrP sedimantasyon. 1 olmayan CJD beyin numunesini S1 11 bireysel kesirler PrP Batı 3F4 ile blot tespit edildi. PrP C çoğu 1-3 üst kesirler tespit edilmesine karşın, PrP küçük miktarlarda da dip kesirler 9-11 gözlendi. Ayrıca, üst ve alttan PrP bant deseni farklıdır: alt fraksiyonları ele PrP baskın alt band varken iyi kesirler ele PrP baskın bir üst bant vardır. A PK-tedavi PrP Sc leke sağ tarafında bir kontrol olarak yüklendi. <img alt = &quot;Şekil 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3788/3788fig3.jpg&quot; /&gt; Şekil 3. Çözünür ve çözünmez PrP C oligomerlerinin Algılama. Normal insan beyninden çözünür ve çözünmez PrP C ultra-santrifüj ile ayrılır ve daha sonra, sırasıyla, jel filtrasyon tabi tutuldu. Bireysel fraksiyonların molekül boyutları moleküler ağırlığı bilinen bir grup çalışan ile ölçüldü. SCJD beyin numuneleri (A) PrP Sc türler. PrP türlerin iki nüfus tespit edilmiştir: jel filtrasyon fraksiyonu 49 - kesirler 27-33 büyük agrega içerir oysa 65, monomerler ve küçük oligomerler içerir. Normal kontrol çözünebilir fraksiyon (S2), (B) ve çözünmeyen bölüm (P2), (C) PrP C tür tespit edildi. PrP 3F4 antikoru ile sondajlanan edildi. Dimerleri (fraksiyon 55) ve PrP tetramerleri (fraksiyon 51), P2, aynı zamanda, normal beyin sampl S2 olarak değil, sadece tespit edildiES (B ve C). Büyük agregalar sadece normal örnekleri (C) P2 saptandı. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/3788/3788fig4.jpg" /> Şekil 4. Normal insan beyninden G5p zenginleştirilmiş hazırlıkları çeşitli PK dirençli iPrP fragmanlarının tespiti. G5p ile zenginleştirilmiş örnekleri Western (sol panel), 1E4 1E4 epitopu (orta panel) için özdeş bir sekans vardı bir sentetik peptid ile 1E4 önceden inkübe ile problama kurutma öncesinde PK ve PNGase F ile muamele edilmiş ve anti-C (edildi sağ panel). 1E4 üç PK dayanıklı PrP fragmanları adlandırdığı tespit PrP * 20, PrP * 19 ve PrP * 7 (sol panel). Peptit ile 1E4 engelleme sonra, hiç PrP res 1E4 ile tespit bantları PrP parçaları olduğunu belirten, (orta panel) saptandı. Anti-C, iki yanı PK dayanıklı PrP fragmanları adlandırdığı ortaya PrP * 18 ve PrP-CTF12 /13, PrP * 20 ek olarak.

<ol><li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions.+Proc%5BTitle%5D)+AND+%22Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Prions. Proc.</a> Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).</li>
<li>Oesch, B., Westaway, D., Wälchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+gene+encodes+scrapie+PrP+27-30+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein.</a> Cell. 40, 735-746 (1985).</li>
<li>Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218, 1309-1311 (1982).</li>
<li>Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrapie+prions+aggregate+to+form+amyloid-like+birefringent+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods.</a> Cell. 35, 349-358 (1983).</li>
<li>Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+polypeptide+of+scrapie-associated+fibrils+%28SAF%29+has+the+same+size%2C+charge+distribution+and+N-terminal+protein+sequence+as+predicted+for+the+normal+brain+protein+%28PrP%29%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP).</a> EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).</li>
<li>Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+structural+studies+of+a+major+scrapie+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification and structural studies of a major scrapie prion protein.</a> Cell. 38, 127-134 (1984).</li>
<li>Hall, D., Edskes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+prions+lying+in+wait%3A+a+two-hit+model+of+prion%2Famyloid+formation+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection.</a> J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).</li>
<li>Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insoluble+aggregates+and+protease-resistant+conformers+of+prion+protein+in+uninfected+human+brains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains.</a> J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).</li>
<li>Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessibility+of+a+critical+prion+protein+region+involved+in+strain+recognition+and+its+implications+for+the+early+detection+of+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).</li>
<li>Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+to+DNA+detects+scrapie+but+not+normal+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).</li>
<li>Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+disease+with+abnormal+prion+protein+sensitive+to+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease.</a> Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).</li>
<li>Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variably+protease-sensitive+prionopathy%3A+A+new+sporadic+disease+of+the+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein.</a> Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).</li>
<li>Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta42+interacts+mainly+with+insoluble+prion+protein+in+the+Alzheimer+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain.</a> J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).</li>
<li>Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G. Characterization of prion proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZou%2C+WQ+%22Methods+in+Molecular+Biology-Neurogenetics%3A+Methods+and+Protocols%22">Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols</a>. Potter, N. T. , Humana Press Inc. Totowa. 305-314 (2002).</li>
<li>Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-sensitive+scrapie+prion+protein+in+aggregates+of+heterogeneous+sizes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes.</a> Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada bildirilen yaklaşımların birleşimi normal insan beyninin sürekli çözünmez PrP C agrega ve çözünür PrP C oligomerler ayırır. Bir saat boyunca 100,000 x g&#39;da santrifüjü gibi geniş ölçüde çözünür PrP C den 14 çözünmez PrP Sc ayrılması için kullanılmış olan klasik bir yöntemdir. Bu, uyarılar bir etkili olsa da santrifüj sonrasında (S2) süpernatant çekme sırasında kirlenmesini önlemek içindir. IPrP C jel profil PrP C bundan farklı olduğu ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Phenylmethylsulfonyl florür </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td><td> 2-propanol içinde 72 mM </td></tr><tr><td> Proteinaz K </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2308 </td><td> H2O içinde 2 mg / ml </td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> New England Biolabs </td><td> MWGF200 </td><td></td></tr><tr><td> LE-80K, SW55 rotor ultrasantrifüjdeki </td><td> Beckman Coulter </td><td> Parça No 365668, 356860 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR boncuk </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1088-01 </td><td></td></tr><tr><td> AKTA FPLC sistemi </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1900-26 </td><td></td></tr><tr><td> Molekül ağırlığı belirteçler </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MWGF200 </td><td> Çeşitlidir </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 manyetik boncuk </td><td> Invitrogen </td><td> 143-01 </td><td></td></tr><tr><td> 3F4 antikoru </td><td> Covance </td><td> SIG-39600 </td><td></td></tr><tr><td> Antikor 1E4 </td><td> Hücre Bilimleri </td><td> M1840 </td><td></td></tr><tr><td> Hazır jel% 15 mM Tris-HCl, önceden dökme jeller </td><td> Bio-Rad </td><td> 345-0020 </td><td></td></tr></tbody></table>

normal İnsan beyin Çözünür ve çözünmez prp oligomerleri İzolasyonu

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

Prion hastalıklarının patogenezinde merkezi bir olay, onun patojenik izoformu PrP Sc 1 içine konak-kodlanmış hücresel prion proteini PrP C bir dönüşüm içerir. PrP-Sc deterjan çözünmez agregaları ve PK 2-6 karşı kısmen dirençlidir ise PrP C, deterjan çözünebilen ve proteinaz K (PK)-sindirim duyarlıdır. PrP Sc PrP C dönüştürme protein β-tabaka yapıları α-sarmal bir konformasyon geçiş dahil olduğu bilinmektedir. Ancak, in vivo yolu içinde çok az anlaşılmıştır. Bir geçici endojen PrP Sc, ara PrP * veya &quot;sessiz prion&quot;, bulaşmamış beyin 7 tespit edilmesi henüz. Biyofiziksel ve biyokimyasal yaklaşımların bir arada kullanarak, bulaşmamış memeli beyin ve nöronal kültürlü gelen çözünmez PrP C agrega (belirlenmiş iPrP C) tespithücreler 8, 9. Burada, deterjan tampon, sukroz adım degrade sedimantasyon, boyut dışlama kromatografisi, özellikle yapısal değişmiş PrP formları, 10 ve PK-tedavi bağlamak gen 5 proteini (G5p) tarafından iPrP zenginleşmesine Ultrasantrifügasyon dahil olmak üzere bu yöntemlerin ayrıntılı prosedürleri açıklar. Bu yaklaşımların birleşimi çözünmeyen PrP Sc ve PrP C büyüklükler değil, aynı zamanda normal insan beyninden çözünür PrP C oligomerler sadece ayırır. Protokolleri enfekte beyinleri ve enfekte olmayan beyninden iPrP C PrP Sc hem izole etmek için kullanılan oylandı Burada açıklanan bu yana, fizikokimyasal özellikleri, nörotoksisite ve iki izoformu arasındaki enfektivite farklılıkları karşılaştırmak için bir fırsat verin. Böyle bir çalışmanın büyük ölçüde bulaşıcı proteinli patojenlerin anlayışımızı geliştirecektir. IPrP C fizyolojisi ve patofizyolojisi halen belirsizdir. Özellikle, yeni-idyazısından İnsan prion hastalığı proteaz duyarlı prionopathy değişken olarak adlandırılan, biz iPrP C 11, 12 ile immunoreaktif davranış ve parçalanma paylaşan yeni PrP Sc bulundu. Ayrıca, biz son zamanlarda iPrP C Alzheimer hastalığı 13 amiloid-β proteini ile etkileşime ana tür olduğunu göstermiştir. Aynı çalışmada, bu yöntemlerin diğer nörodejeneratif bozukluklar ile ilgili olmayan prion proteininin agregalar için uygulama düşündüren, Alzheimer hastalığının 13 Abeta agrega ve oligomerler izole etmek için kullanılmıştır.

Hücresel prion proteini yeni bir tür (PrP<sup&gt; C</sup&gt;) Son zamanlarda burada açıklanan yöntemleri kullanarak bulaşmamış insan beyni saptanmıştır. Bunların bazıları, aynı zamanda, insan beyninden diğer katlanan protein büyüklükler izole yararlıdırlar Bu yöntemler, çeşitli PrP tür izole etmek için de kullanılabilir.

Normal İnsan Beyin Çözünür ve çözünmez PrP Oligomerleri İzolasyonu

Prion hastalıklarının patogenezindeki merkezi olay, konakçı tarafından kodlanan hücresel prion proteini PrPC'nin patojenik izoformuna dönüşmesini içerir...

Bu prosedürün amacı, normal insan beynindeki tüm ligamentlerde çözünür ve çözünmez prion proteini veya PRP'yi izole etmektir. Bu işlem, öncelikle insan beyin dokusunun homojenize edilmesi ve fraksiyonların izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, sükroz basamak gradyanlarında hız sedimentasyonu uygulanır.Ardından boyut dışlama kromatografisi uygulanır. Son olarak, PRP, gene five protein veya G five P ile yakalanır. Nihayetinde; sükroz basamak gradyanlarında ultrasantrifüjleme, boyut dışlama kromatografisi ve G five P ile PRP yakalama işlemleri aracılığıyla, normal insan beyninden çözünür ve çözünmez PRP veya agregaların izolasyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, Creutzfeldt-Jakob hastalığı, Bovine spongiform encephalopathy ve klinik wasting hastalıkları dahil olmak üzere prion hastalıkları araştırmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ayrıca, sadece prion hastalıkları için değil, aynı zamanda Alzheimer hastalığı ve Parkinson hastalığı gibi diğer hastalıklar için de çözünür ve çözünmez protein agregalarının izolasyonuna dair öngörüler sağlayabilirler.Genellikle, bu yöntemlerde yeni olan kişiler, tüm deneysel basamakların önemli olması ve e

isolation-soluble-insoluble-prp-oligomers-normal-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu video, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ve amiloid olmayan proteinlerin sindirimi kullanılarak fare beyin dokusu ekstraktından amiloid fibrilleri izole etme protokolünü göstermektedir.

Beyin Dokusu Ekstraktından Amiloid Fibrillerin İzolasyonu

Bu videoda, donmuş ölüm sonrası insan beyni dokusundan deterjanda çözünmeyen protein agregatlarının izole edilmesi ve zenginleştirilmesi süreci açıklanmaktadır. Çözünmeyen agregaları ayırmak ve saflaştırmak için homojenizasyon, deterjan arıtma, sonikasyon ve ultrasantrifüjleme dahil olmak üzere temel adımları gösterir. Son adım, daha fazla analiz için agregaların üre tamponu içinde çözündürülmesini içerir.

İnsan Postmortem Beyin Dokusundan Deterjanda Çözünmeyen Protein Agregatlarının İzolasyonu

İnsan ve fare beyin dokusu için üre / tiyoüre / SDS tamponu kullanılarak ortak bir protein ekstraksiyon protokolü sağlar: 2D-dige ve mini 2DE immunoblotting kendi müteakip özellik tayini ile protein indentification. Bu yöntem, insan biyopsi ve deneysel modellerden gerçekleştirilen daha güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için bir olanak sağlar.

Konsensus Beyin kaynaklı protein, 2D-DIGE ve Mini 2DE İmmünoblotting Hem kullanma İnsan ve Kemirgen Beyin proteomun Çalışmaları Ekstraksiyon Protokolü

Fare beyninin damar bölmesinin saflaştırılmasına izin veren bir protokol tarif ediyoruz. İzole beyin damarları, sıkı bağlantılarla bağlanmış ve sürekli bir bazal lamina, perisitler, vasküler düz kas hücreleri ve ayrıca perivasküler astroglial membranlarla çevrili endotel hücrelerini içerir.

Fare Beyin Gemiler saflaştırılması

Burada, ölüm sonrası insan beyin dokusundan giderek çözünmeyen/kümelenmiş alfa-sinükleinin (α-syn) izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Deterjan mukavemeti arttırılmış tamponların ve yüksek hızlı ultrasantrifüj tekniklerinin kullanılmasıyla, hastalıklı ve hastalıksız dokularda α-syn agregasyonunun değişken özellikleri incelenebilir.

Parkinson Brains gelen Çözünür ve çözünmez alfa-sinüklein Sıralı Ekstraksiyon

Burada, farklı sinaptik bölmelere ait proteinleri izole etmek için sağlam bir prosedürü temsil eden bir beyin zar fraksiyonasyon protokolünü sunuyoruz.

Beyin Membranı Fraksiyonu: Bir<emEx Vivo</em&gt; Subsınaptik Protein Lokalizasyonunu Değerlendirmede Yaklaşım

Deterjan çözünmez protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme için bir kısaltılmış Ayırma Protokolü tanımlanır.

Deterjan çözünmez Protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme

İnsan beyin dokusundan izole beyin kılcal bariyer fonksiyonu fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında çalışmaya preklinik model olarak kullanılabilir. Burada, beynin kılcal taze insan beyin dokusundan izole etmek için en iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralı mevcut.

Yalıtım taze insan beyin dokusundan beyin kapiller

Burada, sıçan beyin yüzdeki yalıtım ve membran örnekleri hazırlanması için bir yöntemi açıklanmıştır. Bu iletişim kuralı örnekleri kabul edilebilir protein ile bireysel hayvanlardan verim zenginleştirilmiş microvessel üreten açık avantajı vardır. Örnekleri daha sonra beyin mikrovasküler endotel, sağlam protein analizleri için kullanılabilir.

Membran örnekleri taze izole sıçan beyin yüzdeki hazırlamak için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem

Kütle spektrometrisine dayalı proteomik analiz ile bu biyokimyasal saflaştırma yöntemi, Alzheimer hastalığını önleme hedeflerinin belirlenmesini hızlandırabilecek amiloid fibril çekirdeklerinin sağlam karakterizasyonunu kolaylaştırır.

Beyinden Amiloid Fibril Çekirdeklerinin Biyokimyasal Saflaştırılması ve Proteomik Karakterizasyonu

Öğrenin, normal insan beyninden çözünür ve çözünmez prion proteinlerini izole etme yöntemini. Homojenizasyon, ultrasantrifüjasyon ve boyut dışlama kromatografisi teknikleriyle nörodejeneratif hastalık araştırmalarına katkı sağlayın.

Normal İnsan Beyin Çözünür ve çözünmez PrP Oligomerleri İzolasyonu

Daha fazla video keşfet