Normal İnsan Beyin Çözünür ve çözünmez PrP Oligomerleri İzolasyonu

Bu prosedürün amacı, normal insan beynindeki tüm ligamentlerde çözünür ve çözünmez prion proteini veya PRP'yi izole etmektir. Bu işlem, öncelikle insan beyin dokusunun homojenize edilmesi ve fraksiyonların izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, sükroz basamak gradyanlarında hız sedimentasyonu uygulanır.

Ardından boyut dışlama kromatografisi uygulanır. Son olarak, PRP, gene five protein veya G five P ile yakalanır. Nihayetinde; sükroz basamak gradyanlarında ultrasantrifüjleme, boyut dışlama kromatografisi ve G five P ile PRP yakalama işlemleri aracılığıyla, normal insan beyninden çözünür ve çözünmez PRP veya agregaların izolasyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, Creutzfeldt-Jakob hastalığı, Bovine spongiform encephalopathy ve klinik wasting hastalıkları dahil olmak üzere prion hastalıkları araştırmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ayrıca, sadece prion hastalıkları için değil, aynı zamanda Alzheimer hastalığı ve Parkinson hastalığı gibi diğer hastalıklar için de çözünür ve çözünmez protein agregalarının izolasyonuna dair öngörüler sağlayabilirler.

Genellikle, bu yöntemlerde yeni olan kişiler, tüm deneysel basamakların önemli olması ve ekstra özen gerektirmesi nedeniyle zorluk yaşayacaklardır. SEC Fi'nin derinlik hassasiyeti ve G beş P ile PRP yakalama gibi basamakların tanımlanmasının zor olması ve daha hassas bir işlem olmadan başarısız olabilme ihtimali nedeniyle, bu mesajın video ile gösterimi kritik öneme sahiptir. Beyin homojenatı hazırlamak için, motorlu bir havan eli kullanarak 100 mg dondurulmuş beyin dokusuna 100 µL lizis tamponu ekleyerek başlayın, dokuyu buz üzerinde homojenize edin, kuru buz üzerinde beş dakika dondurun ve tekrar homojenize edin.

Sırasıyla 300 veya 800 µL lizis tamponu ekleyerek %20 veya %10'luk toplam beyin homojenatı hazırlayın. Tezgah üstü santrifüj kullanarak homojenatı 4 °C'de 10 dakika boyunca 1000 G'de santrifüjleyin. SNA'yı bir SW 55 rotor santrifüjünde 4 °C'de bir saat boyunca 35.000 RPM'de santrifüjleyerek S1 fraksiyonunu toplayın.

Süpernatantı temiz bir tüpe aktarın. Western blot örneklerini hazırlamak için deterjanla çözünmeyen peleti lizis tamponu içinde süspande edin. S2 ve P2 fraksiyonlarını, mililitre başına 50 mikrogram proteinaz K ile 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.

Beş milimolar PMSF ve SDS örnek tamponu ekleyerek sindirimi sonlandırın. Örnekleri 10 dakika boyunca kaynatın ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında soğumaya bırakın. Hız sedimantasyonu gerçekleştirmek için, 20%S bir fraksiyonun 450 mikrolitresini, eşit hacimdeki %2'lik Sarco X suyu ile birlikte beş mililitrelik santrifüj tüplerinde 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe ederek başlayın. %60, %30, %25, %20, %15 ve %10'luk sükrozdan 0,5'er mililitre ekleyin; inkübe edilen S bir'den 0,4 mililitreyi %10 ila %60'lık sükrozun üzerine yükleyin.

Basamaklı gradyanları, bir SW 55 rotorunda, tüpün üzerinden başlayarak dört santigrat derecede, 48.000 RPM hızında bir saat boyunca santrifüjleyin. Her biri 283 µL olan 12 eşit fraksiyon toplayın. Her fraksiyondan 20 µL ve eşit hacimde SDS örnek tamponu kullanın.

SDS-PAGE jel örneklerini hazırlamak için örnekleri 10 dakika boyunca kaynatın, ardından dört dakika boyunca soğutun. Örnekleri 1000 G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, hazır döküm jel boyut dışlama üzerine yüklemeden önce bunları vorteksleyin. PRP moleküllerinin oligomerik durumunu belirlemek için kromatografi kullanılır. SUEx 200 HR boncuklarından oluşan 1x30'luk bir kolona, yedi farklı moleküler kütle belirtecinin 200 µL'lik örnek hacimlerini yükleyerek başlayın.

Mavi dekstranın elüsyon hacmini boşluk hacmi olarak kullanın. Kromatogramdan ve fraksiyonel tutulmalardan VE'nin pik elüsyon hacimlerini hesaplayın. KAV bölüşüm katsayısını, KAV eşittir V eksi V zero bölü VT eksi V zero denklemini kullanarak hesaplayın.

Bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için, protein standartlarının KAV değerlerini standartların log moleküler ağırlıklarına karşı grafiğe aktarın. Ardından, 0,25 milliliters per minute akış hızında kolona 200 µL S one uygulayın.

Kolonu %1 cile lizis tamponu ile yıkayın ve bir fraksiyon toplayıcı kullanarak 0.25 mililitrelik fraksiyonlar elüe edin. Her fraksiyondan 125 mikrolitreyi, önceden soğutulmuş 500 mikrolitre metanol ile -20 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Örnekleri 4 °C'de 30 dakika boyunca 13.000 G'de santrifüjleyin.

Reese, pelletini 20 µL SDS örnek tamponu içinde çözüp 10 dakika boyunca kaynatın. Oda sıcaklığına soğutun ve %15 poliakrilamid jellerde ayırın. G5P molekülünü manyetik boncuklara konjuge etmek için, geri kazanılan çeşitli PRP türlerinin moleküler ağırlıklarını ekstrapole etmek amacıyla standart eğriyi kullanın.

100 µg G5P'yi, 1 mL PBS içerisinde 350 µL toci aktive edilmiş manyetik boncuklarla 37 °C'de 20 saat boyunca inkübe edin. G5P boncuklarını Eppendorf tüplerinin yan duvarına çekmek için harici bir mıknatıs kullanın ve solüsyonu uzaklaştırın. Spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için boncukları 1 mL %0,1 BSA'lı PBS ile üç kez yıkayın.

G5P konjuge boncukları, 0.1% BSA içeren 0.2 M tris, HCl pH 7.4 içerisinde bir mililitrede 37 °C'de beş saat boyunca inkübe edin. Ardından boncukları üç kez yıkayın. Son yıkama suyunu uzaklaştırın ve PRP izole etmek için bir mililitre PBS ekleyin; 100 µL S1 veya P2'yi, bir mililitre bağlama tamponu içerisinde 60 µL G5B konjuge boncuk ile oda sıcaklığında üç saat boyunca sabit rotasyonda inkübe edin.

Tüpü mıknatısın üzerine yerleştirin. Solüsyonu uzaklaştırın ve boncukları yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Son yıkama sıvısını uzaklaştırın ve SDS örnek tamponu ekleyin.

Boncukları 95 °C'de beş dakika boyunca ısıtın. Örnekleri %15'lik ön dökümlü jellere yükleyin ve yaklaşık 80 dakika boyunca 150 volt ile çalıştırın. Membranları TBST içerisindeki %5'lik süt ile bloke ettikten sonra proteinleri 70 volt ile iki saat boyunca PVDF'ye aktarın.

Bunları oda sıcaklığında PRP antikorları ile iki saat boyunca inkübe edin. Üç F dört bir E dört anti N veya anti C; HRP konjuge ikincil antikorlarla inkübasyonu takiben membranı ve kemilüminesans solüsyonunu üretici talimatlarına göre inkübe edin ve burada görüldüğü gibi filmi pozlayın. Sporadik Creutzfeldt-Jakob hastalığı veya CJD örnekleriyle karşılaştırıldığında, normal beyinlerden alınan P iki fraksiyonunda az miktarda çözünmez hücresel PRP tespit edildi.

Buna rağmen, büyük bir kısmı S iki fraksiyonunda geri kazanılmıştır. Çözünmeyen PRP, tam uzunluktaki ve uç kısımları kısalmış türler dahil olmak üzere, toplam PRP'nin yaklaşık %5 ila %25'ini oluşturur; sükroz basamak gradyan sedimentasyonu kullanılarak yapılan analizler, CJD olmayan beyinlerden elde edilen PRPC'nin çoğunun üst fraksiyonlarda geri kazanıldığını, ancak normalde büyük agregatlar içeren alt fraksiyonlarda (dokuz 11) da az miktarda PRP tespit edildiğini ortaya koymuştur. Monomerlerden başlayan, çeşitli patojenik PRP veya PRP SC türleri.

CRUT valf yakup hastalığı olan beyinde, jel filtrasyonu ile daha küçük ligandlar ve daha büyük agregatlar izole edilmiştir. Şaşırtıcı bir şekilde, normal beyinlerin çözünmeyen fraksiyonlarında 2000 kilodaltondan daha büyük moleküler ağırlığa sahip az miktarda büyük agregat da tespit edilmiştir. Ayrıca, PRPC dimerleri ve tetramerleri sadece çözünmeyen fraksiyonlarda değil, aynı zamanda çözünmeyen fraksiyonlarda da saptanmıştır.

PK ve PNGase tedavisi sonrası. G5P tarafından yakalanan PRP, PRP 97 1 0 5 3'e karşı geliştirilmiş 1E4 antikoru ile tespit edilmiştir. PRP*20, PRP*19 ve PRP*7 olarak adlandırılan PK dirençli çekirdek fragmanlarının sırasıyla 20 kDa, 19 kDa ve 7 kDa'da göç ettiği tespit edilmiştir.

Bununla birlikte, one E four antikoru, one E four epitopu ile aynı diziye sahip sentetik bir peptit ile ön inkübe edildiğinde hiçbir PRP tespit edilmemiştir; bu durum, one E four tarafından tespit edilen bantların PRP fragmanları olduğunu göstermektedir. Anti C antikoru, yaklaşık 18 kilodalton ve yaklaşık 12 ila 13 kilodalton civarında göç eden iki farklı PRP fragmanı tespit etmiştir. PRP ETE 20 yöntemine ek olarak.

Bu teknik, uygun şekilde uygulandığında dört günde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, gelişimi tamamlanmış alt insan beyninde çözünür ve çözünmez PRP polimerlerini nasıl izole edeceğiniz konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu teknik, beyindeki PIP konformasyon bilgilerini keşfetmek amacıyla öncül kaderine yönelik araştırmaların önünü açmıştır.