Test için Yöntemler Drosophila Davranış

Bu prosedürün genel amacı, drosophila motor duyusal ve koordinasyon davranışlarını inceleme yöntemlerini göstermektir. Bu işlem; öncelikle crawling deneyi ile larva motor fonksiyonlarının, ring deneyi ile erişkin motor fonksiyonlarının ve courtship deneyi ile erişkin koordinasyon ve duyusal yeteneklerinin değerlendirilmesiyle gerçekleştirilir. Nihayetinde, bu davranışsal deneyler paneli, genetik faktörlerin ve ilaç uygulamaları gibi dış faktörlerin aktivite ve koordinasyonu nasıl etkileyebileceğini gösterebilir.

Intra sophala. Bu analizin, negatif geo aks gibi mevcut yöntemlere karşı temel avantajı, halka analizinin daha yüksek kapasiteli ve daha hassas olmasıdır. Bu yöntem, lokomotor kusurların erken evre tespiti gibi nörodejeneratif hastalıklar alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu deneyi, laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Dr. Jamie Becknell gerçekleştirecektir. Larval sürünme deneyi, genetik ve çevresel faktörlerin motilite üzerindeki etkisini ölçmek için kullanılır; kuruluma standart bir şişeye 10 ila 15 erkek ve 10 ila 15 bakire dişinin yerleştirilmesiyle başlanır. 24 saat sonra, sağlıklı yetişkinler şişeyi dolduracak kadar yumurta bırakmış olacak ve böylece popülasyonun yaşı 24 saat ile eşitlenmiş olacaktır.

Yetişkinleri temiz bir şişeye aktarın ve işlemi tekrarlayın. Şimdi, şişedeki besin içerisinde üçüncü evre yıldız larvaları gözlemlenene kadar şişeyi inkübe edin. 50 ila 100 mililitre %20 sakaroz ekleyin ve 20 dakika boyunca bekletin.

Larvalar üst kısma çıkacaktır; larvaları ucu kesilmiş 25 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak toplayın ve bir ağ sepetine yerleştirin. Ağ sepetindeki larvaları deiyonize su ile iki kez yıkayın. Artık larvalar üzerinde deneyler yapılabilir.

Larvaları bir ilaçla tedavi etmek için, istenen sayıdaki larvayı bir fırça yardımıyla %5 sükroz ve ilgili ilaç içeren beş mililitrelik bir behere aktarın. İlaçlı şeker çözeltisiyle 15 dakika boyunca beslenmelerini sağlayın, ardından onları tekrar mesh sepetinden dökerek durulayın ve hareketlilik üzerindeki ilaç etkisinin ölçümüne geçin. Tek bir larvayı, %2 agar içeren 15 santimetrelik bir Petri kabına aktarmak için bir fırça kullanın.

Bir kareli kağıt üzerine yerleştirin. Şimdi verileri toplayın. Lavın bir dakika içinde kaç kare çizgisini geçtiğini saymanız yeterlidir.

Ardından, bir diseksiyon mikroskobu altında, seyreltilmiş maya macunu çözeltisi içeren cam bir diseksiyon kabının kuyucuğuna lavrayı aktarmak için fırçayı kullanın ve bir dakikalık süre boyunca Percy'nin kasılmalarını sayın. Tek bir kasılma, tam bir posteriordan anteriora harekete olarak sayılır. İstenen sayıda larva sayılana kadar işlemi tekrarlayın.

Halk protokolü, yetişkin hayvanların lokomotor hızını ölçer; yeni çıkan yetişkin erkek sinekler hafif anestezi altında toplanır ve normal veya ilaçlı yem içeren standart bir flakona aktarılır. Her flakona yaklaşık 25 sinek yerleştirin. Anestezinin tamamen etkisini kaybetmesi ve kararlı durum ilaç seviyelerinin birikmesi için sinekleri oda sıcaklığında iki ila üç gün boyunca tutun.

Ardından, anestezi uygulamadan yaklaşık 25 sineği kalıplanmış tıpalı polistiren tüplere aktarın ve tüpleri bir veya daha fazla halka düzeneği şeklinde birleştirin. Sineklerin 15 ila 20 dakika boyunca dinlenmesini beklerken, tüpleri yandan fotoğraflayacak şekilde bir dijital kamerayı hizalayın, bir zamanlayıcı hazırlayın ve bunu analiz için istenen süreye ayarlayın. Analizi gerçekleştirmek için genellikle üç saniye yeterlidir.

Sinekleri rahatsız etmeden halka düzeneğini bir elinizle tutun ve diğer elinizle kamera zamanlayıcısını hazır bulundurun. Sinekleri düşürmek için düzeneği tezgaha üç kez vurun ve aynı anda kameranın geri sayım zamanlayıcısını başlatın. Beş veya altı deneme gerçekleştirilene kadar deneyi her dakika bir kez tekrarlayın.

İlk veri setleri toplandıktan sonra polistiren test tüplerinin yeniden kullanılmaması kritik önem taşır. Çünkü kullanılmış tüplere yerleştirilen yeni sinekler, taze tüplere yerleştirilen sinekler kadar yüksek tırmanmayacaktır. Verileri toplamak için bir görüntüleyici kullanarak farklı grupların ortalama tırmanma yüksekliğini puanlayın.

Bu analiz, analiz için sinek toplamak amacıyla şişelerde bol miktarda yavru üreten, hazırlanmış genetik çaprazlamalar gerektirir. Hayvanların öznel şafağınale bir iki saat kala, tüm erişkinleri üç ila dört saatlik aralıklarla toplamak için şişeleri temizleyin. Yeni çıkmış, cinsel olarak deneyimsiz erkek ve dişileri toplayın; erkekleri besin içeren tüplere veya viallere tek tek, dişileri ise beş veya altışarlı gruplar halinde yerleştirin.

Benzer kafeslerde, analiz için eşit sayıda erkek ve dişi gereklidir. Toplanan sinekler beş gün boyunca izole edildikten sonra, onları bir çiftleşme çarkına yüklemek için hazırlık yapın ve analizi gerçekleştirin. Ardından, bir diseksiyon mikroskobu altında bir dişiyi ve bir erkeği dikkatlice çiftleşme çarkının haznesine aktarın.

Çifti 10 dakika boyunca veya bu süre zarfında başarıyla çiftleşene kadar gözlemleyin. Birkaç davranıştan her birinin ilk kez ne zaman gözlemlendiğini kaydedin. Erkeğin ilk kez dişiye doğru döndüğü anı kaydedin.

Erkek dişiye bacağıyla ilk dokunduğunda kaydedin, erkek ilk kez kanadını açıp titrettiğinde kaydedin, erkek dişinin genital bölgesini ilk yaladığında kaydedin, erkek karnını ilk kez altına doğru kıvırdığında kaydedin. Erkeğin dişiye çıkmaya ilk çalıştığı anı kaydedin. Son olarak, kopülasyon gerçekleşene kadar kur davranışında geçen toplam süreyi kaydedin.

Yaban tipi hayvanlar için bu süre neredeyse her zaman beş ila 10 dakika arasındadır; veriler üç farklı parametre ile toplanır. Birincisi, bir davranışa kadar geçen süre (latans), davranışın ilk kez gözlemlenmesine kadar geçen zamandır. İkincisi, bir davranışın frekansı, bu davranışın gözlemlenip gözlemlenmediğidir.

Üçüncü olarak, kur yapma indeksi, hayvanlarla yapılan bir deneyde kur yapmaya ayrılan sürenin, toplam süreye ve kopülasyona kadar geçen süreye bölünmesidir. F-U-S-T-L-S ile ilişkili miyotrofik lateral skleroz mutasyonları taşımaktadır. İnsersiyon merkezli gen mutantları, wild type kontrollerinin yarısı kadar sürünme yeteneği gösterirken, R 5 21 C missense mutasyonu sürünme hızını dakikada sadece yaklaşık bir santimetreye düşürmüştür.

Genç yaban tipindeki yetişkin sineklerin halka testi sonucunda, üç saniyelik bir süre zarfında üç ile beş santimetre arasında tırmanma şeklinde ortalama bir yükseklik elde edilmiştir. Bu analizde, halka testi denemeleri sırasında birer dakika arayla gerçekleştirilen beş ardışık denemeye kadar herhangi bir duyarsızlaşma gözlemlenmemiştir. Zamanlama konusunda mümkün olduğunca hassas davranmayı hatırlamak önemlidir.

Yöntemye hakim olunduğunda, düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde larval crowding deneyi, tek bir genotip için 10 denemeyi gözlemlemek amacıyla 30 ila 40 dakikada tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, sineklerde kur davranışlarının nasıl gözlemleneceği ve puanlanacağı konusunda da yeterli bilgiye sahip olmalısınız.