Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis Biyofilmler

Bu prosedürün genel amacı, model organizma olan bacillus subtles'ın biyofilmlerinde farklılaşan özelleşmiş hücrelerin belirgin alt popülasyonlarını görselleştirmek ve niceliklerini belirlemektir. Bu, öncelikle B subtles'ın kromozomuna transkripsiyonel raporlayıcıların yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Bu raporlayıcılar, yalnızca incelenen hücre alt popülasyonunda eksprese edilecektir.

Bir sonraki adım, B subtles'ın biofilm indükleyen ortam olan Ms GG gg içerisinde büyütülerek bir biyofilmin gelişimini teşvik etmektir. Biyofilm oluşumunun ardından, biyofilmdeki hücreler dağıtılır ve paraformaldehit ile sabitlenir. Prosedürün son adımı, mikrobiyal topluluğun tekil hücreleri tarafından yayılan floresan sinyalinin floresan mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak tespit edilmesidir.

Nihayetinde sonuçlar, hücrelerin nasıl üretme ve salgılama konusunda özelleştiğini göstermektedir. Biyofilmi oluşturan hücre dışı matrisi üretenler, sürfaktan salgılayanlardan farklı bir alt popülasyondur; sürfaktan, matris üretici alt popülasyonun farklılaşmasından sorumlu olan sinyal molekülüdür. Bu tekniğin, Vita Ities assayleri veya mikroarray analizi kullanılarak yapılan transkripsiyon ekspresyonu kantifikasyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, gen ekspresyonunu tek hücre düzeyinde izlememize ve özellikle belirli bir geni eksprese etmek üzere özelleşmiş çok küçük hücre popülasyonlarını görselleştirmemize olanak tanımasıdır.

Genel popülasyon analiz edildiğinde bu gen ekspresyonları tespit edilemeyecektir. B subtiles'ların etiketlenmesi için integratif plazmitler kullanılır ve buna bir örnek burada gösterilmiştir. PTAA, tass üretiminden sorumlu genlerin promotörüdür.

Bir matris proteini, ECO R one ve Hindi three restriksiyon bölgeleri kullanılarak vektöre klonlanır. CFP raporlayıcı geninin ekspresyonu artık ptap A kontrolü altındadır. B. subtiles etiketleme prosedürüne başlamak için, integratif plazmidi enzimatik sindirim yoluyla lineerleştirin. Önerilen restriksiyon enzimi XH oh one'dır. İntegratif plazmid hazır olduğunda, hücreleri beş saat boyunca 37 °C'de kompetans indükleyici besiyerinde büyüterek B. subtles suşu 1 68'de doğal kompetansı indükleyin.

Lineerleştirilmiş plazmidi yetkin B. subtilis hücre kültürüne ekleyin ve 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin; iki saatten sonra, hücreleri spektinomisin içeren agara ekin ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. B. subtilis kromozomu, biyofilm gelişimini etkilemeden raporlayıcı füzyonların entegre edilmesine olanak tanıyan AmyE ve LAC A olmak üzere iki nötral lokusa sahiptir. Lineerleştirilmiş PKM 0 0 8 plazmidi, çift rekombinasyon yoluyla B. subtilis genomuna entegre olur.

Bir sonraki adım, raporlayıcıyı işaretli suştan, SPP 1 faj transduksiyon protokolünü kullanarak biyofilmler oluşturabilen bir suşa aktarmaktır. Bu videoda, protokolün yalnızca önemli adımları gösterilmektedir. Raporlayıcı füzyonu taşıyan donör suş 1 68'i, kültür erken stasyoner faza ulaşana kadar 37 °C'de TY besiyerinde büyütün ve ardından bir cam tüp içerisinde 200 µL hücreye 100 µL seyreltilmiş faj stok çözeltisi ekleyin.

Ve 15 dakika boyunca 37 °C'de bekletelim. Ardından, tüpe sıcak TY yumuşak agar pipetleyin ve vorteksleyerek iyice karıştırın. Taze bir TY plakasına nazikçe yayın ve fago halolarının oluşması için 8 ila 16 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin.

Faj halelerini toplamak için plağa üç mililitre TY besiyeri ekleyin ve üst agarı parçalamak için cam pipet kullanın. Agar süspansiyonunu 15 mililitrelik bir falcon tüpüne aktarın. Agarı parçalamak için hafifçe vorteksleyin ve ardından 1000 G'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Süpernatantı 22 mikronluk bir şırınga filtresinden geçirin. Bu süpernatantı, TY besiyerinde büyütülmüş alıcı suş kültürünü enfekte etmek için kullanın.

1/10 oranında seyreltilmiş 10 mililitre kültüre 30 µL süpernatan ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından 5.000 RPM'de yedi dakika santrifüjleyin, pellet'i 200 µL TY besiyerinde yeniden süspanse edin ve SPECTmycin ile 10 mM sodyum sitrat içeren bir plak üzerine yayınız.

37 °C'de 12 ila 36 saat boyunca inkübe edin. Bir koloni seçin ve bunu 37 °C'de sıvı LB içerisinde gece boyunca büyütün. Son olarak, gece boyu büyütülen kültürden üç µL'yi katı biyofilm indükleme ortamına damlatın.

Hücrelerin 30 °C'de 72 saat boyunca büyümesine izin verin. Üç günlük büyümenin ardından, Ms.GG agar yüzeyinde oluşan biyofilmler, agar yüzeyinde karmaşık bir morfolojik yapı geliştirecektir. Bu prosedüre başlamak için, biyofilmi MSGG agar yüzeyinden çıkarmak üzere bir kürdan veya cımbız kullanın.

Biyofilmin kıvamı, agar yüzeyinden soyulabilmesine olanak sağlamalıdır. Biyofilmi tek parça halinde üç mililitre PBS tamponuna yerleştirin ve biyofilmi hafifçe dağıtın. Tek hücre analizinden önce örnekleri sabitlemek için üç çıkış gücünde ve 0.7 saniye genlikte 12 puls uygulayın.

Hücre süspansiyonunun 300 mikrolitresini, bir mililitrelik %4'lük paraformaldehit çözeltisi içinde yeniden süspande edin ve oda sıcaklığında tam yedi dakika boyunca inkübe edin. Yedi dakikalık fiksasyonun ardından, hücreleri PBS tamponu ile üç kez yıkayın. Son olarak, floresan mikroskobisi öncesinde hücreleri 300 mikrolitre PBS tamponu içinde yeniden süspande edin.

Slayt üzerine 200 µL %0,8 agros pipetleyerek ve üzerine dikkatlice başka bir slayt kapatarak bir mikroskop lamı hazırlayın. İki dakika sonra, alt noktadaki slayta yapışmış bir agros tabakası elde etmek için üstteki slaytı nazikçe kaldırın. Agros tabakasının yüzeyine 2 µL fikse edilmiş hücre ekleyin ve üzerini bir mikroskop lamel ile kapatın.

Numuneyi floresan mikroskobun tablasına yerleştirin. Eksitasyon süresini, deney için seçilen koşullarda floresan göstermeyen bir negatif kontrole göre ayarlayın. Pozlama süresi 50 ile 200 milisaniye arasında olmalıdır.

Her bir görüş alanı için hem bir floresan görüntü hem de bir aydınlık alan görüntüsü elde edin. Hücreleri akış sitometrisi analizine hazırlamak için, fikse edilmiş hücre örneğini hafif sonikasyonla dağıtın. Hücre lizisine neden olmadan kümeleri tekil hücrelere dönüştürmek için beş çıkış gücünde ve 0,7 saniye genlikte, 12 pulsluk iki seri uygulayın.

Hücre dağılımının etkinliğini ışık mikroskobu ile doğrulayın. Ardından, örneği PBS tamponunda 1/100 oranında seyreltin. YFP floresans analizleri için BD facs canto II akış sitometrisi kullanılacaktır.

CFP floresan için 488 nanometrelik bir lazer uyarımı ile birlikte 5 30 30 filtre kullanılır. 405 nanometrelik bir lazer uyarımı ile birlikte 4 0 8 40 filtre kullanılır; akış sitometresini iki negatif kontrol ile kalibre edin. Süspansiyonda hücre bulunmayan bir PBS tamponu örneği, akış sitometresi tarafından algılanan partikül boyutu için negatif kontrol olarak kullanılmalıdır.

Floresan raporlayıcı içermeyen bir örnek, akış sitometresinin kalibrasyon sonrası floresan hassasiyeti için negatif kontrol olarak kullanılmalıdır. Floresan raporlayıcı ile işaretlenmiş örneği akış sitometresine yerleştirin ve her örnek için, saniyede 303.000 olay arasındaki bir akış hızıyla en az 50.000 olayı analiz edin. B Subtles, biyofilm indükleyici ortam içeren bir plakada büyütüldüğünde, 30 °C'de üç günlük inkübasyon sonrası MSGG biyofilm oluşumu gözlemlenir.

Biyofilm, katılan belirgin hücre alt popülasyonlarının göstergesi olan karmaşık bir morfolojik mimari sergiler. Örneğin, hücre dışı matriks ve biyofilm üretimi, koloninin yüzeyinde kırışıklıkların oluşmasıyla sonuçlanır. Bu şekil, floresan mikroskopi kullanılarak tek bir işaretlenmiş suşta hücre farklılaşmasının görselleştirilmesine bir örnek göstermektedir.

Bu suş, mavi renkte boyanmış matris üreten hücre alt popülasyonunda eksprese edilen bir CFP olan floresan raporlayıcı Ptap, A CFP'yi taşımaktadır. Bu alt popülasyon, biyofilmi oluşturan hücre dışı matrisi üretir ve salgılar. Bir sonraki görüntü, raporlayıcı Ptap, A CFP ve ek raporlayıcı P Surfactin YFP'yi taşıyan çift etiketli bir suşun floresan mikroskobu ile görselleştirilmesinin sonucudur.

Bu ikinci raporlayıcı, matris üreticilerinin farklılaşması için sinyal kaskadını tetikleyen sinyal molekülü surfaktini salgılamaktan sorumlu olan hücre alt popülasyonunun izlenmesini sağlar. Burada, ptap raporlayıcısını taşıyan tek bir etiketli suş kullanılarak gerçekleştirilen 2D akış sitometrisi sonuçları görülmektedir; matris üreticileri maviye, surfaktan üreticileri ise sarıya yanlış renklendirilmiştir. Burada bir YFB sunulmaktadır.

Herhangi bir floresan protein geni içermeyen işlem görmemiş kontrol suşu, ptap taşıyan düşük bağıl floresan hücrelerden oluşan tek bir popülasyon göstermiştir. Biyofilm oluşturucu olmayan koşullar altındaki YFP, matris üreticisi alt popülasyonunu ayırt etmemiş ve tüm popülasyon yine düşük bağıl floresan göstermiştir. Buna karşın, biyofilm oluşturucu koşullar altında, düşük bağıl floresanın sağ tarafında bir omuz şeklinde yüksek bağıl floresansa sahip bir hücre alt popülasyonu tespit edilmiştir.

3D akış sitometrisinden elde edilen pik sonuçları burada gösterilmiştir. İzlenen kanalların floresan sinyalleri X ekseninde YFP ve Y ekseninde CFP için sunulmuştur; sol üst panel, arka plan floresansı için kontrol olarak floresan protein genleri içermeyen bir suşu göstermektedir. Sağ üst panelde, sarı çerçeve ile belirtilen YFP floresan kanalında surfaktin üreticisi alt popülasyonunu tespit etmek için tekli işaretlenmiş bir suş kullanılmıştır.

Sol alt panelde, matris üretici alt popülasyonunu tespit etmek için farklı bir tek işaretli suş kullanılmıştır. Mavi çerçeveli CFP floresan kanalında, çift işaretli suş kullanılarak matris üreticileri ve sürfaktan üreticileri alt popülasyonları izlenmiş ve sonuçlar bu sağ alt panelde sunulmuştur.

Floresan raporlayıcıların yüksek seviyelerini ifade eden iki hücre alt popülasyonu tespit edilir. Her bir popülasyon, özelleşmiş iki hücre alt popülasyonu arasında raporlayıcıların ifadesinde herhangi bir örtüşme olmadığını gösterecek şekilde çerçevelenmiştir. Bu son şekil, 3D akış sitometrisi ile matris üreticileri ve kanniballerin alt popülasyonlarının nicelendirmesini göstermektedir.

Sağ üst panelde, kanibal alt popülasyonunu tespit etmek için tekli işaretli bir suş kullanılmıştır. Sarı çerçeveli YFP floresan kanalında, bu kanibal alt popülasyonunun matris üretici alt popülasyonu ile koordinatlı olarak farklılaştığı tanımlanmıştır. Sol alt panelde ise matris üretici alt popülasyonu, CFP floresan kanalında başka bir tekli işaretli suşta tespit edilmiştir.

Mavi çerçeveyle belirtilen, sağ alt paneldeki çift etiketli suştan elde edilen sonuçlar, hem YFP hem de yeşil çerçeveli CFP'yi ifade eden tek bir floresan hücre alt popülasyonu göstermiştir. İki raporun eş zamanlı ifadesi, her iki hücre diferansiyasyon yolunun da aynı alt popülasyonda koordineli olarak aktive edildiğini gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, floresan mikroskopi veya akış sitometrisi gibi hücre popülasyonu analiz yöntemlerini kullanarak, mikrobiyal bir biyofilm oluşturan farklı hücre alt popülasyonlarının nasıl görselleştirileceği ve nicelendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.