Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis Biyofilmler

Bu prosedürün genel amacı, model organizma olan bacillus subtles'in biyofilmlerinde farklılaşan özel hücrelerin farklı alt popülasyonlarını görselleştirmek ve ölçmektir. Bu, önce transkripsiyonel raportörlerin B süptil kromozomuna yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Bu raportörler, yalnızca incelenen hücrelerin alt popülasyonunda ifade edilecektir.

Bir sonraki adım, biyofilm indükleyici ortamda, Ms GG gg'de B inceliklerini büyüterek bir biyofilmin gelişimini teşvik etmektir. Biyofilm oluşumundan sonra, biyofilmden gelen hücreler dağıtılır ve para formaldehit ile sabitlenir. Prosedürün son adımı, floresan, mikroskopi ve akış sitometrisi kullanarak mikrobiyal topluluğun tek hücreleri tarafından yayılan floresan sinyalini tespit etmektir.

Sonuç olarak, sonuçlar hücrelerin üretmek ve salgılamak için nasıl özelleştiğini göstermektedir. Biyofilmi oluşturan hücre dışı matris, matris üreticilerinin alt popülasyonunun farklılaşmasından sorumlu sinyal molekülü olan yüzey aktif maddeyi salgılayan hücrelerden farklı bir alt popülasyondur. Bu tekniğin, mikroışın analizinin Vita Ities tahlilleri kullanılarak transkripsiyon ifadesinin ölçülmesi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, gen ekspresyonunu tek bir hücre düzeyinde izlememize ve belirli bir geni ifade etmek için özelleşmiş hücrelerin özellikle küçük hücre popülasyonlarını görselleştirmemize izin vermesidir.

Bu gen ifadeleri, genel popülasyon analiz edilirken tespit edilmeyecektir. Bütünleştirici plazmitler, B süptillerini etiketlemek için kullanılır ve burada bir örnek gösterilmiştir. PTAA, tass üretiminden sorumlu genlerin destekleyicisi.

Bir matris proteini, ECO R bir ve Hintçe üç kısıtlama bölgeleri kullanılarak vektöre klonlanır. CFP raportör geninin ekspresyonu artık B'yi etiketleme prosedürünü başlatmak için ptap A'nın kontrolü altındadır, incelikler enzimatik sindirim ile bütünleştirici plazmiti doğrusallaştırır. Önerilen kısıtlama enzimi XH oh birdir, bütünleştirici plazmit hazır olduğunda, hücreleri 37 santigrat derecede beş saat boyunca yeterlilik indükleyici ortamda büyüterek B en ince suş 1 68'de doğal yeterliliği indükleyin.

Doğrusallaştırılmış plazmidi yetkin B en ince hücrelerin kültürüne ekleyin ve iki saat sonra 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin, hücreleri agar üzerinde spect misin ile kaplayın ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. B süptil kromozomunun, biyofilm gelişimini etkilemeden raportör füzyonlarını entegre etmek için kullanılabilen Amy, E, E ve LAC A olmak üzere iki nötr lokusu vardır. Doğrusallaştırılmış PKM 0 0 8 plazmid, çift rekombinasyon yoluyla B süptillerinin genomuna entegre olur.

Bir sonraki adım, raportörü etiketli suştan SPP bir faj transdüksiyon protokolünü kullanarak biyofilm oluşturabilen bir suşa aktarmaktır. Bu videonun amacı doğrultusunda, yalnızca protokoldeki önemli adımlar gösterilmektedir. Donör suşu 1 68'i büyütün, raportör füzyonunu 37 santigrat derecede TY ortamında, kültür 200 mikrolitre hücrede erken durağan faza ulaşana kadar bir cam tüp içinde 100 mikrolitre seyreltilmiş faj stoğuna ulaşana kadar büyütün.

Ve 37 santigrat derecede 15 dakika bekleyelim. Ardından, sıcak TY yumuşak agar'ı tüpe pipetleyin ve girdap yaparak iyice karıştırın. Yavaşça taze bir TY plakasına yayın ve faj halelerinin ortaya çıkmasına izin vermek için sekiz ila 16 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Faj halelerini toplamak için, plakaya üç mililitre TY ortamı ekleyin ve üst agar'ı parçalamak için cam pipeti kullanın. Agar süspansiyonunu 15 mililitrelik bir şahin tüpüne aktarın. Agarı parçalamak için hafifçe girdap yapın ve ardından 1000 G'de 15 dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Süpernatanı 22 mikronluk bir şırınga filtresinden geçirin. TY ortamında yetiştirilen alıcı suşun bir kültürünü enfekte etmek için bu süpernatanı kullanın.

Bir ila 10 seyreltilmiş 10 mililitre kültüre 30 mikrolitre süpernatan ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Bundan sonra, yedi dakika boyunca 5.000 RPM'de santrifüjleyin, peleti 200 mikrolitre TY ortamında tekrar askıya alın ve SPECT misin artı 10 milimolar içeren bir plaka üzerine yayın. Sodyum sitrat.

37 santigrat derecede 12 ila 36 saat inkübe edin. Bir koloni seçin ve gece boyunca 37 santigrat derecede sıvı LB içinde büyütün. Son olarak, gece boyunca kültürün üç mikrolitresini katı biyofilm indükleyici ortamda tespit edin.

Hücrelerin 30 santigrat derecede 72 saat büyümesine izin verin. Üç günlük büyümeden sonra, Ms.GG agarın yüzeyinde oluşan biyofilmler, agar yüzeyinde karmaşık bir morfolojik mimari geliştirecektir. Bu işleme başlamak için, MSGG agarın yüzeyinden biyofilmi çıkarmak için bir kürdan veya cımbız kullanın.

Biyofilmin kıvamı, agar yüzeyinden soyulmasını sağlamalıdır. Tek parça halinde, biyofilmi üç mililitre PBS tamponuna yerleştirin, biyofilmi hafifçe dağıtın. Tek hücre analizinden önce numuneleri sabitlemek için üç çıkış ve 0,7 saniye genlik ile 12 darbe gerçekleştirin.

Resus, 300 mikrolitre hücre süspansiyonunu bir mililitre, %4'lük bir paraform aldehit çözeltisi içinde askıya alır ve oda sıcaklığında tam olarak yedi dakika inkübe eder. Yedi dakikalık fiksasyondan sonra, hücreleri PBS tamponunda üç kez yıkayın. Son olarak, floresan mikroskobundan önce hücreleri 300 mikrolitre PBS tamponunda yeniden süspanse edin.

Slaytın üzerine 200 mikrolitre% 0.8 agros pipetleyerek ve dikkatlice başka bir slaytla kaplayarak bir mikroskop lamı hazırlayın. İki dakika sonra, alt noktadaki slayta bağlı bir agros tabakası elde etmek için üst sürgüyü yavaşça çıkarın. Agros tabakasının yüzeyine iki mikrolitre sabit hücre koyun ve bir mikroskop kapak camı ile örtün.

Numuneyi floresan mikroskobunun sahnesine yerleştirin. Uyarma periyodunu, deney için seçilen koşullarda floresan göstermeyen negatif bir kontrole göre ayarlayın. Maruz kalma 50 ila 200 milisaniye arasında olmalıdır.

Her görüş alanı için bir floresan görüntüsünün yanı sıra parlak bir alan görüntüsü elde edin. Hücreleri akış sitometrisi analizi için hazırlamak için, sabit hücrelerin örneğini hafif sonikasyon ile dağıtın. Hücre lizizine neden olmadan kümeleri tek hücrelere dağıtmak için beş çıkışlı ve 0,7 saniyelik bir genliğe sahip iki seri 12 darbe gerçekleştirin.

Işık mikroskobu ile hücre dağılımının verimliliğini onaylayın. Ardından, numuneyi PBS tamponunda bir ila 100 oranında seyreltin. YFP floresan için bu analiz için bir BD faks canto iki akış sitometresi kullanılacaktır.

CFP floresansı için 5 30 30 filtre ile birleştirilmiş 488 nanometrede bir lazer uyarımı kullanılır. 4 0 8 40 filtre ile birleştirilmiş 405 nanometrede bir lazer uyarımı kullanılır, akış sitometresini iki negatif kontrol ile kalibre edin. Süspansiyonda hücre içermeyen bir PBS tamponu numunesi, akış sitometresi tarafından algılanan partikülün boyutu için negatif bir kontrol görevi görmelidir.

Floresan raportörü olmayan bir numune, akışın floresan hassasiyeti için negatif bir kontrol görevi görmelidir. Kalibrasyondan sonra sitometre, her numune için akış sitometresine bir floresan raportör ile etiketlenmiş numuneyi yerleştirin, saniyede 303.000 olay arasında bir akış hızına sahip en az 50.000 olayı analiz edin. B Subtles, biyofilm indükleyici ortamın bir plakası üzerinde büyüdüğünde, 30 santigrat derecede üç günlük inkübasyondan sonra MSGG biyofilm oluşumu gözlenir.

Biyofilm, farklı katılımcı hücre alt popülasyonlarının göstergesi olan karmaşık bir morfolojik mimari gösterir. Örneğin, hücre dışı matriks ve biyofilmlerin üretimi, koloninin yüzeyinde kırışıklıkların oluşmasına neden olur. Bu şekil, floresan mikroskobu kullanılarak tek bir etiketli suşta hücre farklılaşmasının görselleştirilmesinin bir örneğini göstermektedir.

Bu suş, mavi renkli matris üreten hücrelerin alt popülasyonunda ifade edilen bir CFP olan floresan raportör Ptap'ı barındırır. Bu alt popülasyon, biyofilmi oluşturan hücre dışı matrisi üretir ve salgılar. Bu sonraki görüntü, muhabir Ptap, A CFP ve ek raportör P Surfactin YFP'yi barındıran çift etiketli bir suşun floresan mikroskobu ile görselleştirilmesinin sonucudur.

Bu ikinci raporlayıcı, matris üreticilerinin farklılaşması için sinyal kaskadını tetikleyen sinyal molekülü surfaktini salgılamaktan sorumlu hücrelerin alt popülasyonunun izlenmesini sağlar. Burada, matris üreticileri mavi renkte yanlış renkliyken, yüzey aktif madde üreticileri sarı renkte yanlış renklidir, raportör ptap'ı barındıran tek bir etiketli suş kullanılarak yapılan 2D akış sitometrisinin sonuçları. Burada bir YFB sunulmaktadır.

Herhangi bir floresan protein geni içermeyen tedavi edilmemiş kontrol suşu, ptap barındıran düşük nispi floresan hücrelere sahip tek bir popülasyon gösterdi. Biyofilm indükleyici olmayan koşullar altında bir YFP, matris üreticilerinin alt popülasyonunu ayırt etmedi ve tüm popülasyon da düşük nispi floresan gösterdi. Buna karşılık, biyofilm indükleyici koşullar altında, yüksek bağıl floresansa sahip bir hücre alt popülasyonu, düşük bağıl floresanın sağında bir omuz olarak tespit edildi.

3D akış sitometrisinden elde edilen pik sonuçlar burada gösterilmektedir. İzlenen kanalların floresan sinyalleri, YFP ve Y ekseni için X ekseninde sunulur CFP için, sol üst panel, arka plan floresansı için bir kontrol olarak floresan protein genleri içermeyen bir suş gösterir. Sağ üst panelde, sarı ile çerçevelenmiş YFP floresan kanalında yüzey aktif madde üreticilerinin alt popülasyonunu tespit etmek için tek bir etiketli suş kullanıldı.

Sol alt panelde, matris üreticilerinin alt popülasyonunu tespit etmek için farklı bir tek etiketli suş kullanıldı. Mavi ile çerçevelenmiş CFP floresan kanalında, matris üreticilerinin ve yüzey aktif madde üreticilerinin alt popülasyonları, çift etiketli suş kullanılarak izlenir ve sonuçlar sunulur. Bu sağ alt panelde.

Floresan raportörlerin yüksek seviyelerini ifade eden iki hücre alt popülasyonu tespit edilir. Her popülasyon, özelleşmiş hücrelerin iki alt popülasyonu arasında raportörlerin ifadesinde hiçbir örtüşme olmadığını gösteren çerçevelenmiştir. Bu son şekil, matris üreticilerinin ve yamyamların alt popülasyonlarının 3D akış sitometrisi ile nicelleştirilmesini göstermektedir.

Sağ üst panelde, yamyamların alt popülasyonunu tespit etmek için tek bir etiketli suş kullanıldı. Sarı ile çerçevelenmiş YFP floresan kanalında, yamyamların bu alt popülasyonunun, matris üreticilerinin alt popülasyonu ile koordineli olarak farklılaştığı tanımlanmıştır. Sol alt panelde, matris üreticilerinin alt popülasyonu, CFP floresan kanalındaki başka bir tek etiketli suşta tespit edilir.

Mavi çerçeveli, sağ alt paneldeki çift etiketli suştan elde edilen sonuçlar, yeşil çerçeveli CFP'nin her iki YFP'sini ifade eden tek bir floresan hücre alt popülasyonunu gösterdi. İki raportörün eşzamanlı ifadesi, her iki hücre farklılaşma yolunun da aynı alt popülasyonda koordineli olarak aktive edildiğini gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, floresan mikroskobu veya akış sitometrisi gibi hücre popülasyonunun hücre analizini kullanarak mikrobiyal bir biyofilm oluşturan hücrelerin farklı alt popülasyonlarını nasıl görselleştireceğinizi ve ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.