Yenidoğan Rat Beyin Dokusu Karışık Glial Hücre Kültürleri Primer mikroglia İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, yenidoğan sıçan beyinlerinden primer mikroglial hücre kültürleri hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle beynin izole edilmesi ve meningelerin uzaklaştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, beynin homojenize edilmesi ve karma glial kültürün T 75 flasklara ekilmesidir.

Ardından, bir astrosit monokatmanı konfluensa ulaşana kadar flasklar 10 ila 14 gün boyunca inkübe edilir. Son adımda, astrosit monokatmanı üzerinde büyüyen mikrogliaları serbest bırakmak için flasklar çalkalanır ve böylece saflaştırılmış bir mikroglia kültürü elde edilir. Nihayetinde, yüksek saflıktaki primer mikroglialar, sonraki in vitro tek hücre kültürü ve ko-kültür analizlerinde kullanılabilir.

Bu tekniğin Perico gradyan yöntemi gibi mevcut yöntemlere karşı temel avantajı, nominal mekanik bozunmanın mikroglial disfonksiyonu veya aktivasyonu minimize etmesi ve deneyler için mikrogliaların ilk hazırlıktan haftalar sonra bile üretilebilmesidir. Bu prosedürü, Dr. Clifton Dau guard'ın laboratuvarında lisansüstü öğrencisi olan Tammy Tero ile birlikte göstereceğim. Bu protokol sırasında elde edilen yüksek saflıktaki mikroglia kültürleri, mikroglia fonksiyonlarını hem normal fizyolojik koşullar hem de patolojik hastalık durumları altında incelemek için in vitro deneylerde kullanılabilir.

Mikrogliaların doku hasarına ve inflamatuar stimuluslara verdiği yanıtlar, nörolojik yaralanmalar ve nörodejeneratif hastalık durumlarıyla doğrudan ilgilidir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan bireyler, primer mikroglia kültürlerindeki fibroblast kontaminasyonunu azaltmak için beyin dokusundan meningeslerin zamanında nasıl temizleneceği konusunda deneyimsiz oldukları için zorluk yaşayabilirler. Ayrıca, flaskların sallanması ve mikroglia kültürlerinin taşınması sırasında astrosit monotabakasının zarar görmemesi için dikkatli olunmalıdır.

Prosedüre hazırlanmak için, Chi Livi'yi dört santigrat dereceye soğutulmuş, 60 by 15 milimetrelik L 15 medyalı Petri kaplarına hazır hale getirin ve buz üzerine yerleştirin. Kültür medyasını 37 santigrat dereceye ısıtın ve tüm cerrahi aletlerin sterilize edildiğinden emin olun. P1 ile P5 arasındaki bir sıçan yavrusunun kafasını keskin bir makasla kestikten sonra, kafayı %70 etanol içerisine bırakın.

Beş sıçan yavrusunun başları toplandıktan sonra, başları salin solüsyonuna aktarın. Kulakların üzerindeki kafatasının her iki yanına dikkatlice insizyonlar yaparak ve beyni dışarı çıkarıp buz üzerinde L 15 medyum içeren Petri kaplarından birine alarak her baştan tüm beyni çıkarın. İlk beş beyin buz üzerinde L 15'e aktarıldıktan sonra, tüm beyinler toplandığında sonraki beş yavru da aynı şekilde işlenebilir.

Meningeal tabakanın bir kenarını pensetle nazikçe kavrayarak ve alttaki korteksten dikkatlice soyarak meningesleri çıkarın. Meningeslerin tamamen ve mümkün olduğunca hızlı bir şekilde çıkarılması esastır. Meningesler çıkarıldıktan sonra, beyinlerin her birini buz üzerinde bulunan taze L 15 besiyerli bir Petri kabına aktarın.

Beyin dokusunu ve medyumu plakadan steril 50 mililitrelik konik bir tüpe aspirat etmek için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Ardından, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 2.500 RCF'de santrifüjleyin. Santrifüjleme işleminin ardından aspirasyon yapın.

Ardından, çökeltiyi yeniden süspand etmek için steril 10 mililitrelik bir pipet kullanılır. Çökeltiyi dört ila beş mililitre taze L 15 medyumunda süspande edin, medyum ve dokuyu pipetle 10 kez aşağı yukarı hareket ettirin. Daha sonra, taze bir 50 mililitrelik konik tüpün üzerine 100 mikron gözenekli bir hücre süzgeci yerleştirin.

Doku süspansiyonunu yukarı ve aşağı doğru pipetlemek için steril beş mililitrelik bir pipet kullanın ve ardından pipeti hücre süzgecine yaslayarak materyali süzgeç üzerinden konik tüpe aktarın. Süzgeci dört ila beş mililitre taze soğutulmuş L 15 medyum ile durulayın. Ardından, örneğinizi 4 °C'de beş dakika boyunca 2.500 RCF'de santrifüjleyin.

İşlenen her sıçan yavrusu beyni için, her bir şişeye 12 mililitre önceden ısıtılmış kültür medyumu ekleyerek steril bir T 75 flask hazırlayın. Ardından, çöktürülmüş hücrelerden süpernatantı aspire ettikten sonra, hücre peletine beş ila altı mililitre kültür medyumu ekleyin ve 10 mililitrelik bir pipetle 10 kez aşağı yukarı pipetleyin. Daha sonra, her bir T 75 flaska eşit hacimde hücre süspansiyonu transfer edin.

Flaskları, ilk ekimden sonraki ilk beş gün boyunca hücrelerin rahatsız edilmeden kalmasına izin vererek, %5 karbon dioksitli bir inkübatörde 37 degrees Celsius'de bir ila üç hafta boyunca inkübe edin. Beş gün sonra, konfluens sağlamak için her flasktaki kondisyonlu medyumu 12 milliliters taze medyum ile değiştirin. Bu işlem, hücrelerin yapıştığı flask tabanına dokunmadan çok dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmelidir.

Karışık glial kültürler tamamen konfluens hale geldiğinde, flaskı inkübatörden çıkarın. Çevredeki hava ile gaz değişimini önlemek için flask kapaklarını parafilm ile kapatın ve flaskları 100 RPS ve 37 °C'ye ayarlanmış bir çalkalayıcı inkübatöre bir saatliğine yerleştirin. Bir saat dolduktan sonra, astrosit tabakasını bozmadan flasklardaki medyumu toplamak için 10 mL'lik bir pipet kullanın ve medyumu 50 mL'lik konik tüplere aktarın. Flasklara taze medyum ekleyin ve inkübatöre geri yerleştirin.

Tüpler 4 °C'de beş dakika boyunca 2,500 RCF'de santrifüj edildikten sonra, süpernatantı aspire edin ve hücreleri bir mililitre mikroglia ekim ortamında yeniden süspansiyona getirin. Ardından, bir hemositometre ve standart prosedürler kullanarak hücreleri sayın. Hücre sayısı belirlendikten sonra, uygun hücre yoğunluğunu elde etmek için uygun hacimde mikroglia ekim ortamı ekleyin.

Mililitre başına 2 × 10⁵ hücre konsantrasyonundaki plak deney için uygundur ve inkübatöre geri yerleştirilir. Bu işlem, mikrogliaların gece boyunca yapışmasını sağlamak içindir. Hücreler, kırmızı renkte görünen bir mikroglial belirteç olan IBA1'e özgü bir antikor ile immün boyanmıştır.

Kırmızı renkte görünen yeni NA nöronal markörü için kullanılan bir antikorla yapılan immün boyamanın bu mikroskop görüntüsünde gösterildiği üzere, kültürde nöronal hücre kontaminasyonu minimum düzeydedir. Slayt, tüm hücre çekirdeklerini maviye boyamak için DPI ile karşıt boyanmıştır. Bu görüntü, GFAP ve astrosit markörü ile yapılan immün boyamayı göstermektedir.

Astrositler yeşil görünmektedir. Burada, bir oligodendrosit belirteci olan CC1'e özgü bir antikorla immün boyanmış mikroglia kültürü görüntüsü görülmektedir. Oligodendrositler kırmızı görünmektedir.

Bu histogram, her bir hücre tipinin nicelleştirme sonuçlarını göstermektedir. Ekilen mikroglial kültürlerin %90'dan daha saf olduğu görülmektedir. Bu floresan mikroskop görüntüsü, IBA1 için immün boyama yapılmış bir mikroglial kültürü göstermektedir.

Kırmızı alanlar, floresanla işaretlenmiş lateks boncuklardır. Burada gösterilen mikroglial kültür, mililitre başına bir nanogram lipopolisakkarit ile işleme tabi tutulmuştur ve mikroglial hücrelerin floresanla işaretlenmiş lateks boncukları fagosite ettiği görülebilir. Burada, fagositoz analizinin sonuçları bir histogramda sunulmuştur.

LPS tedavisi sonrası fagositozda artış görülür. Bu şekil, LPS eklenmesinin ardından mikroglial kültürlerde nitrik oksit üretiminin de arttığını göstermektedir. Son olarak, laktat dehidrogenaz salınımı ile ölçüldüğü üzere, hem doğrudan hem de transwell insert ile ayrılmış mikroglia nöron kültürleri, LPS ile inkübasyon sonrası artan hücre ölümüne karşı duyarlıdır. Bu tekniğin ilk kısmında uzmanlaşıldığında, T 75 flasklara ekime kadar olan süreç bir buçuk saatte tamamlanabilir ve tüm prosedür iki hafta içinde gerçekleştirilebilir.

Bu protokolün optimizasyonu sırasında dikkat edilmesi gereken bir diğer husus, sürenin belirlenmesidir. Yüksek saflıkta kültürler oluşturulduktan sonra, primer mikroglialar ekim için izole edilmeden önce karma glial kültürlerle sürdürülmelidir. Bu prosedür kullanılarak, mikroglia fonksiyonları in vitro nitrik oksit üretimi, sitokin ve kemokin salınımı ile fazik aktivitenin ölçümü yoluyla rutin laboratuvar analizleri kullanılarak belirlenebilir ve ölçülebilir.

Böylece, bu prosedürün geliştirilmesiyle birlikte, sinirbilim alanındaki araştırmacılar mikroglia aktivitesini homojen bir hücresel ortamda keşfetme ve çeşitli nörolojik durumlar altındaki rollerini inceleme kapasitesine sahip olmuşlardır. Bu videoyu izledikten sonra, yenidoğan sıçan beyinlerinden primer mikroglial hücre kültürlerinin nasıl hazırlanacağına dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Öncelikle beynin izole edilip meningeslerin uzaklaştırılması, ardından beynin homojenize edilip flasklara ekilmesiyle süreç başlar ve flasklar, bir astrosit monokatmanı konfluensa ulaşana kadar 10 ila 14 gün boyunca inkübe edilir.

Son adım, astrosit monokatmanının üzerinde büyüyen mikrogliaları serbest bırakmak için flaskların çalkalanmasıdır; bu işlem sonucunda saflaştırılmış bir mikroglia kültürü elde edilir.