Yenidoğan Rat Beyin Dokusu Karışık Glial Hücre Kültürleri Primer mikroglia İzolasyonu

Beynin hücresel heterojenite birincil mikroglia Yalıtımlı fizyolojik ve patolojik hem de kendi rolünü araştırmak için esastır. Bu protokol bir mekanik izolasyon ve yüksek verim ve yüksek saflıkta sağlar karışık hücre kültürü tekniği için geçerli birincil mikroglia hücreleri açıklar

Bu prosedürün genel amacı, yenidoğan sıçan beyinlerinden primer mikroglial hücre kültürleri hazırlamaktır. Bu, önce beynin izole edilmesi ve meninkslerin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, beyni homojenize etmek ve T 75 şişelerine karışık glial kültür için plakalamaktır.

Daha sonra, şişeler bir astrosit tek tabakası birleşene kadar 10 ila 14 gün boyunca inkübe edilir. Son adım, astrosit tek tabakasının üzerinde büyüyen mikrogliaları serbest bırakmak için şişeleri sallamaktır, bu da saflaştırılmış bir mikroglia kültürü ile sonuçlanır. Sonuç olarak, yüksek saflıkta primer mikroglia, sonraki in vitro tek hücreli kültür ve ko-kültür deneylerinde kullanılabilir.

Bu tekniğin Perico gradyan yöntemi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, nominal mekanik bozulmanın mikroglial disfonksiyonu veya aktivasyonu en aza indirmesi ve deneyler için mikroglia'nın ilk hazırlıktan sonra haftalar boyunca üretilebilmesidir. Bu prosedürü, Dr.Clifton Dau gardiyanının laboratuvarında yüksek lisans öğrencisi olan Tammy Tero ile birlikte göstereceğim. Bu protokol sırasında elde edilen yüksek saflıkta mikroglia kültürleri, normal fizyolojik koşullar altında ve ayrıca patolojik hastalık koşulları altında mikroglia fonksiyonunu incelemek için in vitro deneylerde kullanılabilir.

Mikroglia, doku hasarına yanıt verme ve inflamatuar uyaranlar, nörolojik yaralanma ve nörodejeneratif hastalık durumları ile doğrudan ilişkilidir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, primer mikroglia kültürlerinde fibroblast kontaminasyonunu azaltmak için meninkslerin beyin dokusundan zamanında nasıl çıkarılacağını bilmedikleri için mücadele edebilirler. Ek olarak, şişelerin çalkalanması ve mikroglia kültürlerinin taşınması sırasında astrosit tek tabakasına zarar vermemeye özen gösterilmelidir.

Prosedüre hazırlanmak için, Chi Livi L 15 ortamdan dört santigrat dereceye kadardır, L 15 ortam içeren 60 x 15 milimetre Petri kapları için hazırdır ve buz üzerine yerleştirilir. Kültür ortamını 37 santigrat dereceye ısıtın ve tüm cerrahi aletlerin sterilize edildiğinden emin olun. Keskin bir makasla bir ila P beş sıçan yavrusunun kafasını kestikten sonra, kafayı %70 etanole bırakın.

Beş sıçan yavrusunun kafaları toplandıktan sonra, kafaları tuzlu su çözeltisine aktarın. Kafatasının her iki tarafında kulakların üzerinde dikkatlice kesiler yaparak ve beyni dışarı çekerek ve buz üzerinde L 15 besiyeri içeren Petri sorunlarından birine çekerek tüm beyni her kafadan çıkarın. İlk beş beyin buz üzerinde L 15'e aktarıldıktan sonra, sonraki beş yavru, tüm beyinler toplandığında aynı şekilde işlenebilir.

Meningeal tabakanın bir kenarını forseps ile nazikçe kavrayarak ve alttaki korteksten dikkatlice soyarak meninksleri çıkarın. Meninksleri iyice çıkarmak ve bunu mümkün olduğunca çabuk yapmak çok önemlidir. Meninksleri çıkardıktan sonra, beyinlerin her birini buz üzerinde L 15 orta dereceli taze bir Petri kabına aktarın.

Beyin dokusunu ve ortamı plakadan steril 50 mililitrelik konik bir tüpe aspire etmek için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Daha sonra dört santigrat derecede beş dakika boyunca 2.500 RCF'de santrifüjleyin. Santrifüj aspirasyonunu takiben.

Supinat daha sonra Reese için steril 10 mililitrelik pipet kullanır. Peletleri dört ila beş mililitre taze L 15 ortamında askıya alın, ortamı ve dokuyu 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra 100 mikronluk bir gözenek hücresi süzgecini 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe yerleştirin.

Doku süspansiyonunu yukarı ve aşağı pipetlemek için steril beş mililitrelik bir pipet kullanın ve ardından pipet hücre süzgecine akıtıldığında, malzemeyi hücre süzgecinden konik tüpe dağıtın. Süzgeci dört ila beş mililitre taze soğutulmuş L 15 ortamı ile durulayın. Ardından 2.500 RCF'nizi beş dakika dört santigrat derece boyunca santrifüjleyin.

İşlenen her sıçan yavrusu beyni için, her şişeye 12 mililitre savaş öncesi kültür ortamı ekleyerek steril bir T 75 şişesi hazırlayın. Daha sonra, peletlenmiş hücrelerden sözü aspire ettikten sonra, hücre peletine beş ila altı mililitre kültür ortamı ekleyin, 10 mililitrelik bir pipetle 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra her bir T 75 şişesine eşit hacimde hücre süspansiyonu aktarın.

Şişeleri bir ila üç hafta boyunca 37 santigrat derecede %5'lik bir karbondioksit inkübatörde inkübe edin ve hücrelerin ilk kaplamadan sonraki ilk beş gün boyunca rahatsız edilmeden oturmasına izin verin. Beş gün sonra, birleşme elde etmek için her bir şişedeki şartlandırılmış ortamı 12 mililitre taze ortamla değiştirin. Bu, hücrelerin bağlandığı şişenin dibine dokunmadan çok dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.

Karışık glial kültürler tamamen birleştiğinde, şişeyi inkübatörden çıkarın. Ortam havası ile gaz değişimini önlemek için şişe kapaklarını param ile kapatın ve şişeleri bir saat geçtikten sonra bir saat boyunca 100 RPS ve 37 santigrat dereceye ayarlanmış sallanan bir inkübatöre yerleştirin, astrosit tabakasını bozmadan medyayı şişelerden toplamak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın ve 50 mililitrelik konik tüplere dağıtın. Şişelere taze ortam ekleyin ve inkübatöre geri dönün.

Tüpleri beş dakika boyunca dört santigrat derece boyunca 2.500 RCF'de santrifüjledikten sonra, supinatı aspire edin ve hücreleri bir mililitre mikroglia kaplama ortamında yeniden askıya alın. Daha sonra bir insan sitometresi ve standart prosedürler kullanarak hücreleri sayın. Hücre sayısı belirlendikten sonra, bir hücre elde etmek için uygun hacimde mikroglial kaplama ortamı ekleyin.

Deney için mililitre plaka başına iki kez 10 ila beş hücre konsantrasyonu uygundur ve inkübatöre geri döner. Mikroglia'nın gece boyunca yapışmasına izin vermek için. Hücreler, kırmızı görünen bir mikroglial belirteç olan IBA birine özgü bir antikor ile immün boyanmıştır.

Kırmızı görünen yeni NA nöronal belirteç için bir antikor kullanılarak immüno boyamanın bu mikroskop görüntüsünde gösterildiği gibi, kültürün nöronal hücrelerle minimal kontaminasyonu vardır. Slayt, tüm hücre çekirdeklerini maviye boyamak için DPI ile boyanmıştır. Bu görüntü, GFAP ve astrosit markörü ile immün boyamayı göstermektedir.

Astrositler yeşil görünür. Burada, bir oligodendrosit markörü olan CC one'a özgü bir antikor ile boyanmış mikroglial kültür immünosunun bir görüntüsünü görüyoruz. Oligodendrositler kırmızı görünür.

Bu histogram, her hücre tipinin nicelik belirlemesinin sonuçlarını gösterir. Kaplanmış mikroglial kültürlerin %90'dan fazla saf olduğu görülebilir. Bu floresan mikroskobu görüntüsü, IBA için immün boyama olan bir mikroglial kültürü göstermektedir.

Kırmızı alanlar floresan olarak etiketlenmiş lateks boncuklardır. Burada gösterilen mikroglial kültür, mililitre lipo polisakkarit başına bir nanogram ile muamele edilmiştir ve mikroglial hücrelerin, floresan etiketli lateks boncuklar olan fagositoza sahip olduğu görülebilir. Burada, fagositoz testinin sonuçları bir histogramda görüntülenir.

LPS ile tedaviden sonra artmış fagositoz görülür. Bu şekil, LPS ilavesinden sonra mikroglial kültürlerde nitrik oksit üretiminin de arttığını göstermektedir. Son olarak, hem doğrudan hem de transwell insert ile ayrılmış mikroglia nöron kültürleri, laktat dehidrojenaz salınımı ile ölçüldüğü gibi LPS ile inkübasyondan sonra artan hücre ölümüne karşı hassastır Bu tekniğin ilk kısmına hakim olduktan sonra, T 75'e kaplamaya kadar, şişeler bir buçuk saat içinde yapılabilir ve tam prosedür iki hafta içinde yapılabilir.

Bu protokolün optimizasyonu sırasında göz önünde bulundurulması gereken bir diğer husus da sürenin belirlenmesidir. Yüksek saflıkta kültürlerin kurulmasını takiben, kaplama için birincil mikroglia izole edilmeden önce karışık glial kültürler korunmalıdır. Bu prosedür kullanılarak, mikroglia fonksiyonu değerlendirilebilir in vitro nitrik oksit üretiminin, sitokin ve kemokin salınımının ölçümü ve ayrıca fazik aktivitenin tümü rutin laboratuvar testleri kullanılarak belirlenebilir ve ölçülebilir.

Bu nedenle, bu prosedürün gelişmesiyle birlikte, sinirbilim alanındaki araştırmacılar, homojen bir hücresel ortamda mikroglia aktivitesini keşfetme ve çeşitli nörolojik koşullar altındaki rollerini araştırma kapasitesine sahiptir. Bu videoyu izledikten sonra, yenidoğan sıçan beyinlerinden birincil mikroglial hücre kültürlerinin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Önce beyni izole ederek ve meninksleri çıkararak, daha sonra beyni homojenize ederek ve şişelere yerleştirerek, şişeler bir astrosit tek tabakası birleşene kadar 10 ila 14 gün inkübe edilir.

Son adım, astrosit tek tabakasının üzerinde büyüyen mikrogliaları serbest bırakmak için şişeleri sallamaktır, bu da saflaştırılmış bir mikroglia kültürü ile sonuçlanır.