Name: Yenidoğan Rat Beyin Dokusu Karışık Glial Hücre Kültürleri Primer mikroglia İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Öğrenin, yenidoğan sıçan beyninden primer mikroglia izolasyonu için karışık glial hücre kültürü protokolünü. Bu yöntem, yüksek saflıkta mikroglia elde ederek in vitro nörolojik araştırmaları kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Üniformalı Hizmetleri Üniversitesi intramural programı tarafından finanse edilmektedir.

1. Yenidoğan Rat Beyin Dokusu diseksiyonu <ol><li> Chill Leibovitz L-15 şartlandırılmış ortam (Leibowitz L-15 +% 0.1 BSA, 1 +% Pen / Strep) ile 4 ° C. Sıcak kültür ortamına (DMEM% 10 FBS + +% 1 penisilin / streptomisin) 37 ° C&#39;ye kadar Buz üzerinde klimalı L-15 medya 4-5 ml 4 60x15 mm Petri kapları hazırlayın. % 100 etanol ile tüm cerrahi aletleri sterilize edin. </li><li> % 70 etanol ile P2 yenidoğan rap yavrular durulayın. (P1-P5 arası Yenidoğan sıçan yavrularının bu protokolü kullanılabilir.) </li><li> Hızla steril keskin bir makas ile yavru sıçan başını kesmek ve% 70 etanol içine hemen kafasını bırakın. 5 sıçan yavrularının toplam tekrarlayın sonra tuzlu su çözeltisi içine başlarını aktarmak. </li><li> Buz üzerinde 5 ml L-15 solüsyonu (Leibowitz L-15 +% 0,1 BSA +% 1 Kalem / Strep) - 4 Petri içine başkanları ve yerden tüm beyinleri çıkarın. </li><li> 1.4 çöp kalan yavrular için - prosedürleri 1.2 tekrarlayın. </li><li> Beyin meninks çıkarın ve des aktarmakL-15 solüsyon 4-5 ml ile yeni bir petri içine ired beyin dokusu (yani, korteks, serebellum, tüm beyin, vb) (Leibowitz L-15 +% 0,1 BSA +% 1 Kalem / Strep) buz üzerinde. </li></ol> 2. Karışık Glial Hücre Nüfus hazırlanması <ol><li> Makas veya bıçakla zarar veren beyin dokusu olmaksızın, steril bir 50 ml konik tüp için 10 ml pipet ile doku aktarımı. </li><li> 4 ° C sıcaklıkta 5 dk için 2500 RCF azından konik santrifüje </li><li> Süpernatant aspire. Taze L-15 medya 4-5 ml ekle (Leibowitz L-15 +% 0,1 BSA +% 1 Kalem / Strep). </li><li> Steril bir 10 ml pipetle Pipet doku yukarı ve aşağı 10 kez. </li><li> Taze bir 50 ml konik boru üzerine bir hücre süzgecinden (100 mikron gözenek) yerleştirin. 5 ml steril bir pipetle ve hücre süzgecinden boşaltım pipet ile bir kez pipetle doku yukarı ve aşağı doğru, konik tüpe hücre süzgecinden malzemenin dağıtım. </li><li> Taze L-15 ortam 4-5 ml (sahip bir hücre süzgecinden durulama Leibowitz L-15 +% 0.1 BSA +% 1 Pen / Strep). </li><li> 4, 5 dakika boyunca 2500 RCF azından süzme hücreleri ile konik santrifüje ° C. </li></ol> 3. Karışık Glial Hücre Kültürleri Kaplama ve Bakım <ol><li> Her sıçan beyni yavru işleme için, kültür ortamı, 12 ml ilave edilerek 1 steril bir T-75 şişeye hazırlanması (DMEM% 10 FBS + +% 1 penisilin / streptomisin) her bir balona. </li><li> Pelet hücrelerden süpernatan aspire ve hücre pelletini kültür medya 5-6 ml ekleyin. 10 ml lik bir pipet yardımıyla 10 kez aşağı yukarı Pipeti ve. </li><li> Her bir T-75 balona hücre süspansiyonu eşit hacimde aktarın. </li><li> 1-3 hafta olmak üzere toplam 37 ° C&#39;de% 5 CO 2 inkübatörde matara inkübe edin. </li><li> Flasks ilk 5 gün süre ile inkübe, ve beşinci gününde, taze ortam 12 ml ile, her şişe içinde kültür ortamı değiştirmek ve inkübatöre geri edilmelidir. Daha sonra, her 3 gün, birleştiği elde etmek için taze ortam 12 ml ile, her şişe içinde şartlandırılmış ortam yerini alır. Bu yapmanız gerekmektedirne çok dikkatli hücrelerinin tutunup matara alt dokunmadan. </li></ol> 4. İlköğretim mikroglia İzolasyon ve Kaplama <ol><li> Mikst glial kültürler tamamen konfluent olduktan sonra, inkübatör gelen şişeler kaldırmak ve çevresel hava ile gaz değişimi önlemek için parafilm ile şişesi kapakları kapsamaktadır. </li><li> 37 1 saat için 100 rps (Lab Companion SI-600, Jeio Tech) de matara çalkalayın ° C </li><li> Şişeye yüzeyinde astrosit tabakası bozmadan 10 ml pipetle her şişe ortam Collect. 50 ml konik tüpler ortam yerleştirin. Inkübatöre matara ve dönüş matara taze Medya ekle. </li><li> 4, 5 dakika boyunca 2500 RCF azından konik tüpler santrifüje ° C. </li><li> Tüm konik tüpler süpernatanıyla aspire. Hücre peletler, yüksek saflıkta mikroglia hücrelerdir. Mikroglia kaplama ortam (DMEM +% 10 FES +% 1 penisilin / streptomisin) 1 ml Pastör pipetiyle peletleri. </li><li> Kullanılarak tekrar süspanse edilir ortam içinde hücre yoğunluğu saymaBir hemositometre. </li><li> Ml yoğunluğa başına 2 x 10e5 hücreler elde etmek için mikroglia kaplama ortam uygun bir hacmi ekleyin. Deneysel analiz için uygun Plate. </li><li> Mikroglia gecede eklemek için izin ver. </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Protokolü yüksek saflıkta ilköğretim mikroglia kültürlerde sonuçları yukarıda anlatılan. Gibi bir makrofaj / mikroglia hücre spesifik bir işaretleyici (Iba1) immünohistokimyasal olarak belirlenen, kaplama mikroglia kültürleri&gt;% 90 saf (Şekil 2). Ayrıca, astrosit, oligodendrosit ve nöron hücresi spesifik marker için boyama minimal kontaminasyon (Şekil 2) göstermektedir. Karışık glial hücre kültürleri kurduktan sonra, arka arkaya mikrogliya 4 kat kadar çalkalama ile izole edilebilir. İlk mikroglia izolasyonu yaklaşık 2.2 x 106 hücre / ml veya 10 matara ve beklenen verimi yaklaşık 9 milyon hücre birbirini izleyen sha azalır verecektirke. Bu yöntem ile izole mikroglia fagositoz yeteneği, nitrik oksit üretimi gibi işleyen ve nöronal toksisite (Şekil 3) 13-14 araştırmak için başarıyla kullanılmaktadır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig1.jpg" /> Şekil 1. Karışık glial hücre kültürleri ve primer mikroglianın izolasyonu hazırlanması için protokol bakış. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig2.jpg" /> Şekil 2. Olarak astrosit mikroglia (Iba-1, kırmızı), (GFAP, yeşil), nöron (Neun, kırmızı) ve oligodendrosit kullanılarak immünohistokimyasal analizi ile doğrulanmış yüksek saflıkta mikroglia İzolasyon (CC1, kırmızı) özgül belirteçler. DAPI (mavi) tarafından kültürdeki hücre DNA lekelenmesi de gösterilir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig3.jpg" /> Şekil 3. Mikroglia yöntemi tarif izoleyatağı da dahil olmak üzere bir dizi deneyler, in kullanılabilir, fakat deneyler fagositozunu, fonksiyon deneyleri ve nörotoksik çalışmaları, bunlarla sınırlı olmamak edilmiştir. Bu çalışmalarda, biz (A) veya LPS (B) tedavi medya, ölçülebilir floresan ile işaretlenmiş lateks boncuk (kırmızı), (onların fagositoz artırmak mikroglia (Iba-1 pozitif, yeşil), kontrol maruz kaldığında bulduk C). Bundan başka, LPS (1ng/ml) tedavisi mikroglia (D), nitrik oksit üretimi arttırır. Son olarak, transwell insert ayrılmış veya doğrudan mikroglia-nöron iki kültür yoluyla, biz laktat dehidrogenaz (LDH) sürümü (E, F) ile ölçülen LPS ile inkübe mikroglia nöronal hücre ölümüne sebep bulduk.

<ol><li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+physiology%3A+unique+stimuli%2C+specialized+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).</li>
<li>Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroglial+activation+repertoire+in+the+injured+brain%3A+graded+response%2C+molecular+mechanisms+and+cues+to+physiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).</li>
<li>Loane, D. J., Byrnes, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microglia+in+neurotrauma%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Role of microglia in neurotrauma.</a> Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).</li>
<li>Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+inflammation+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration.</a> Cell. 140, 918-934 (2010).</li>
<li>Pocock, J. M., Liddle, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+signalling+cascades+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease.</a> Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).</li>
<li>Block, M. L., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+microglial+activation+and+progressive+dopaminergic+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity.</a> Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).</li>
<li>Barger, S. W., Basile, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+microglia+by+secreted+amyloid+percursor+protein+evokes+release+of+glutamate+by+cystine+exchange+and+attenuates+synpatic+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function.</a> J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).</li>
<li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+rat+primary+microglia%3A+isolation%2C+culturing%2C+and+selected+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17(2010).</li>
<li>Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+flow+cytometric+characterization+of+newborn+mouse+brain-derived+microglia+maintained+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro.</a> J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).</li>
<li>Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+newborn+rabbit+brain-derived+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia.</a> Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).</li>
<li>Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+fetal+brain-derived+microglia+in+in+vitro+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture.</a> Neuroscience. 41, 149-158 (1991).</li>
<li>Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+highly+enriched+and+quiescent+microglia+from+adult+rat+hippocampus%3A+immunophenotypic+and+functional+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).</li>
<li>Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+glutamate+receptor+5+activation+inhibits+microglial+associated+inflammation+and+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity.</a> Glia. 57, 550-560 (2009).</li>
<li>Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+metabotropic+glutamate+receptor+5+modulates+microglial+reactivity+and+neurotoxicity+by+inhibiting+NADPH+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase.</a> J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokol rutin araştırma deneyleri için saf ve sağlıklı mikroglia üretmek için kullanılır iken, prosedürün kritik parçalar sırasında teknik yönlerini dikkatle düşünülmesi izole mikroglia değişkenliği en aza indirecektir. İlk olarak, zamanında çalışan yenidoğan sıçanların yavrularının beyin dokusu, diseksiyon sırasında doku hipoksik ve iskemik hasarı en aza indirmek için gereklidir. Ancak, meninksler varlığı bu kültür şartlarında hızlı çoğalma hızı nedeniyle önemli fibroblast kontaminasyon katkıda çünkü tamamen diseks...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 60 mm x 15 mm petri </td><td> Fisher marka </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> Keskin diseksiyon makas </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 14094-11 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # kavisli 7b forseps standart ip uçları, 11cm </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11270-20 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 forseps standart ipuçları, düz, 11 cm </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11251-10 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml konik bir santrifüj tüpünde </td><td> VWR </td><td> 89039-656 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml serolojik pipet </td><td> Grenier Bio Bir </td><td> 606180 </td><td></td></tr><tr><td> 10 ml serolojik pipet </td><td> Grenier Bio Bir </td><td> 607180 </td><td></td></tr><tr><td> 100 mikron steril naylon hücre süzgecinden </td><td> Şahin </td><td> 35-2360 </td><td></td></tr><tr><td> 75 cm 2 doku kültürü şişeleri </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco ortamı minimum gerekli (DMEM) </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 31053-028 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 orta </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 11415064 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 16000-036 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal at serumu </td><td> Balıkçı </td><td> SH3007402 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin-Streptomisin </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 15140163 </td><td></td></tr><tr><td> % 100 etanol </td><td> Warner Graham Şirketi </td><td> 64-17-5 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfat 10X tuzlu su çözeltisi, pH 7.4 tamponlu </td><td> Kalite Biyolojik, inc. </td><td> 119-069-131 </td><td> Steril distile su 1X </td></tr><tr><td> Biohazard çanta </td><td> VWR </td><td> 14220-028 </td><td></td></tr><tr><td> Haemocytometer </td><td> Hausser Bilimsel </td><td> 1492 </td><td></td></tr><tr><td> CellBIND yüzeyi ile 6-de hücre kültür plakaları </td><td> Corning </td><td> 3335 </td><td></td></tr></tbody></table>

yenidoğan rat beyin dokusu karışık glial hücre kültürleri primer mikroglia İzolasyonu

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Memeli beyninde toplam hücresel nüfusunun yaklaşık% 12 için mikroglia hesabı. Nöronlar ve astrositler sinir sisteminin önemli hücre tipleri kabul edilirken, mikroglia enkaz ve patojenler için doku izlenmesi ve fagositik aktivite 1,2 ile parankiminde homeostazı koruyarak normal beyin fizyolojisi önemli bir rol oynamaktadır. Mikroglia nörodejeneratif hastalıklar, travmatik beyin hasarı ve sinir sistemi enfeksiyonu 3 de dahil olmak üzere yaralanma ve hastalık, bir dizi sırasında aktive edilir. Bu aktive edici koşullar altında, mikroglia, bunların fagositik aktiviteyi artırır morpohological ve proliferatif değişikliğe uğrar ve aktif reaktif oksijen ve nitrojen türlerinin, pro-inflamatuar kemokinler ve sitokinler salgılar, genellikle bir parakrin veya otokrin döngü 4-6 aktive. Bu mikroglial yanıtları nörolojik koşullarda hastalığı patogenezine katkıda gibi, araştırma m odaklandıicroglia garantilidir. Beynin hücresel heterojenite nedeniyle, in vivo deneyler sırasında yüksek saflıkta yeterli mikroglial örnek materyal elde etmek teknik olarak zordur. Mikroglia nöroprotektif ve nörotoksik fonksiyonları üzerine Mevcut araştırma tutarlı çalışması için yeterli verimi ile saf ve sağlıklı mikroglia üretmek için rutin bir teknik yöntem gerektirir. Biz, metin ve video, aşağı çeşitli uygulamalar için karışık glia kültürlerden saf primer mikroglia izole etmek için bir protokol mevcut. Kısaca, bu tekniğin karışık glial hücre kültürü üretmek için yenidoğan sıçanların yavrularının ayrışmış beyin dokusu kullanır. Karışık glial kültürler konfluent ulaştıktan sonra, primer mikroglia mekanik çalkalama kısa bir süre ile kültür izole edilir. Mikroglia sonra deneysel çalışma için yüksek saflıkta kaplanıyor. Bu yöntemin prensibi ve protokol olduLiteratürde 7,8 tarif. Buna ek olarak, birincil mikrogliya izole etmek için alternatif bir yöntem de 9-12 tarif edilmektedir. Homojenize beyin doku primer mikroglia 12 verim yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile ayrılabilir. Ancak, orta boy santrifüjleme (45 dakika) ve hücre hasar ve aktivasyonu, aynı zamanda, zenginleştirilmiş mikroglia ve diğer hücre popülasyonları neden neden olabilir. Başka bir protokol kültürünün çalkalama 9-11 iken (16 saat) uzamış organizmalar çeşitli primer mikroglia izole etmek için kullanılmıştır. Çalkalandıktan sonra, süpernatan ortam mikroglia izole etmek için santrifüje tabi tutulur. Bu işlem iki aşamalı bir yöntem ayrıca izolasyonu mikrogliyal fonksiyonu ve aktivasyon karıştırmayı olabilir. Biz esas nedenlerle bir dizi için laboratuvar aşağıdaki mikroglia izolasyon protokolü kullanır: (1) primer mikroglia (2, daha sadık ölümsüzleştirdi kemirgen mikroglia hücre hatları daha vivo biyoloji simüle) Nominal mekanik bozulma potansiyeli hücresel disfonksiyon veya aktivasyon en aza indirir, ve (3) yeterli verim karışık glial hücre kültürlerinin geçiş olmadan elde edilebilir. Bu protokol mikroglia yalıtmak için yenidoğan sıçanların yavrularının beyin dokusu kullanır ve mikroglia önemli ölçüde izole mikroglia verimi, aktivasyon durumu ve fonksiyonel özelliklerini etkileyebilir izole etmek için büyük sıçan kullanarak bu dikkat etmek önemlidir. Yaşlanma mikroglia disfonksiyon, artmış nöro-inflamasyonu ve nörodejeneratif patolojileri ile bağlantılı olduğuna dair kanıtlar vardır, bu nedenle önceki çalışmalarda yaşlanmanın önemli bir parametre olduğu daha iyi nörodejeneratif hastalıklarda mikroglia rolünü anlamak için ex vivo yetişkin mikroglia kullandık. Bununla birlikte, ex vivo mikrogliya uzun süreler için kültür tutulması mümkün değildir. Bu protokolün bir kültürü primer mikroglianın ömrünü uzatır iken, bu nedenle, bu mikrogliya d davranırlar not edilmelidirin vivo ortamda bir tercüme ettiğimizde ifferently yetişkin mikroglia gelen ve in vitro çalışmalar dikkatle düşünülmelidir.

Beynin hücresel heterojenite birincil mikroglia Yalıtımlı fizyolojik ve patolojik hem de kendi rolünü araştırmak için esastır. Bu protokol bir mekanik izolasyon ve yüksek verim ve yüksek saflıkta sağlar karışık hücre kültürü tekniği için geçerli birincil mikroglia hücreleri açıklar<em&gt; In vitro</em&gt; Çalışma ve aşağı uygulamaları.

Yenidoğan Rat Beyin Dokusu Karışık Glial Hücre Kültürleri Primer mikroglia İzolasyonu

Mikrogliyalar, memeli beynindeki toplam hücresel popülasyonun yaklaşık %12'sini oluşturur. Nöronlar ve astrositler temel ... olarak kabul edilse de

Bu prosedürün genel amacı, yenidoğan sıçan beyinlerinden primer mikroglial hücre kültürleri hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle beynin izole edilmesi ve meningelerin uzaklaştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, beynin homojenize edilmesi ve karma glial kültürün T 75 flasklara ekilmesidir.Ardından, bir astrosit monokatmanı konfluensa ulaşana kadar flasklar 10 ila 14 gün boyunca inkübe edilir. Son adımda, astrosit monokatmanı üzerinde büyüyen mikrogliaları serbest bırakmak için flasklar çalkalanır ve böylece saflaştırılmış bir mikroglia kültürü elde edilir. Nihayetinde, yüksek saflıktaki primer mikroglialar, sonraki in vitro tek hücre kültürü ve ko-kültür analizlerinde kullanılabilir.Bu tekniğin Perico gradyan yöntemi gibi mevcut yöntemlere karşı temel avantajı, nominal mekanik bozunmanın mikroglial disfonksiyonu veya aktivasyonu minimize etmesi ve deneyler için mikrogliaların ilk hazırlıktan haftalar sonra bile üretilebilmesidir. Bu prosedürü, Dr. Clifton Dau guard'ın laboratuvarında lisansüstü öğrencisi olan Tammy Tero ile birlikte göstereceğim. Bu protokol sırasında elde edilen yüksek saflıktaki mikroglia kültürleri, mikroglia fonksiyonlarını hem normal fizyolojik koşullar he

primary-microglia-isolation-from-mixed-glial-cell-cultures-neonatal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, sıçan beyinlerinden mikroglia'yı izole etmek ve kültürlemek için bir yöntemi göstermektedir. Mikrogliaya özgü bir monoklonal antikor ile kaplanmış plakalar kullanılarak mikroglia'yı diğer nöronal ve nöronal olmayan hücrelerden ayırmayı gerektirir.

Sıçan Beyinlerinden Serumsuz Besiyeri Kullanılarak Mikroglia İzolasyonu ve Kültürü

Video, yenidoğan bir fare beyninden hücreleri izole etme ve kültürleme yöntemini gösterdi. Beynin enzimatik ve mekanik ayrışmasını ve ardından karışık bir glial popülasyon elde etmek için nöronal büyüme faktörü olmayan büyüme ortamında kültürlemeyi içeriyordu.

Yenidoğan Fare Beyninden Karışık Glial Hücre Kültürü Elde Edilmesi

Biz neonatal serebral korteks ve yetişkin omurilik canlı mikroglia verimli ve hızlı izolasyon / kültür yöntemleri özetlemektedir. Kortikal mikrogliya diseksiyonu ve kaplama ilk diseksiyonu sonrasında yer ~ 10 gün alarak sonraki mikrogliyal hasat ile, 90 dakika içinde yapılabilir.

Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

Mikrogliyal biyoloji başarılı bir soruşturma için bir anahtar CNS dokudan izolasyonu sırasında ex vivo mikroglialardan immunofunction korunmasıdır. Flüoresan görüntüleme, bağışıklık kimyası ve proenflamatuar stimuli lipopolisakarit (LPS) ile Pam 3 CSK 4 (PAM) ile ELISA aşağıda mikroglia aktivasyonu ile değerlendirilen gibi son derece saf ve immunofunctional hücre kültürlerinde döner çalkalama sonuçları ile mikroglia izole edilmesi.

Kemirgen Yenidoğan itibaren Korunan immunfenotipine ve İşlevselliği ile Kortikal mikrogliya İzolasyonu

Burada, in vitro deneyler için doğum sonrası fare yavrularından mikroglia izole etmek için bir protokol (gün 1) sunulmuştur. izolasyon Bu doğaçlama yöntem hem de yüksek verim ve saflıkta, mikroglial biyoloji açıklık amacıyla geniş bir aralık deney sağlar alternatif yöntemler üzerinde önemli bir avantaj oluşturur.

Geliştirilmiş Saflık ve Çok Yönlü İlköğretim mikroglia hızlı ve Rafine CD11 Manyetik İzolasyon

Ayrıntılı olarak mikroglial işlevini anlamak için çaba olgun vivo içinde microglia özelliklerini özetlemek mikroglial kültür modellerin eksikliği tarafından engel. Bu iletişim kuralı sağlam çok ramified olgun sıçan microglia tanımlanan-orta koşullar altında yaşama korumak için tasarlanmış bir yalıtım ve kültür yaklaşım anlatılmaktadır.

Yalıtım ve dinamik bir teşvik etmek kemirgen Microglia kültürünü Morfoloji Serum-Alerjik orta Ramified

Burada, bir fare CNS'sinden çoklu glial hücre popülasyonlarının in vitro izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, bölgesel mikroglia, oligodendrosit öncü hücreleri ve astrositlerin çeşitli kültür sistemlerinde her birinin fenotiplerini incelemek için ayrılmasına izin verir.

Murine glia'nın Multipl Merkezi Sinir Sistemi Bölgelerinden Diseksiyonu ve İzolasyonu

Bu protokol, canlı, yetişkin, insan beyin dokusundan birincil mikroglia izole etkili, uygun maliyetli ve sağlam bir yöntemdir. İzole birincil insan mikroglia homeostaz ve hastalık hücresel süreçleri incelemek için bir araç olarak hizmet verebilir.

Yetişkin İnsan Beyin Dokusundan İnsan Mikroglia elde

Primer mikroglia kültürleri, yeni anti-enflamatuar molekülleri değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Mevcut protokol, mikroglia'yı yenidoğan yavrulardan manyetik olarak izole etmek için tekrarlanabilir ve ilgili bir yöntemi tanımlamaktadır.

Birincil Hücre Kültürleri için Yenidoğan Fareden Mikroglial Hücrelerin Manyetik İzolasyonu

Bu protokol, embriyonik 15-16. günlerde fare embriyolarından izole edilen primer nöronal hücrelerden ve doğum sonrası 1-2. günlerde yenidoğan farelerinin beyinlerinden üretilen primer mikrogliadan kurulan bir mikroglia-nöronal ko-kültürü tanımlar.

Murin Primer Mikroglia ve Kortikal Nöronların Üretilmesi ve Birlikte Kültürlenmesi

Öğrenin, yenidoğan sıçan beyninden primer mikroglia izolasyonu için karışık glial hücre kültürü protokolünü. Bu yöntem, yüksek saflıkta mikroglia elde ederek in vitro nörolojik araştırmaları kolaylaştırır.

Yenidoğan Rat Beyin Dokusu Karışık Glial Hücre Kültürleri Primer mikroglia İzolasyonu

Daha fazla video keşfet