3 boyutlu montaj Self-Peptid Hidrojel İnsan Sinir Progenitör Hücreler Yetiştiriciliği

Bu prosedürün genel amacı, üç boyutlu bir ortamda kültüre edilen insan nöral progenitör hücrelerinin nöronal diferansiyasyon analizini hızlandırmaktır. Bu, öncelikle hücrelerin kendi kendine birleşen peptit tabanlı hidrojel saf matris içinde kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, hücreler üç boyutlu iskelelerden serbest bırakılır.

Üçüncü adımda, hücrelerin immünofitokimyasal boyaması gerçekleştirilir. Hücreler, akış sitometrik analizi ile sayılır. Son olarak, akış sitometrik analizi aracılığıyla sırasıyla nöronal veya apoptotik belirteçler üzerinden nöronal diferansiyasyon oranı veya apoptoz oranı belirlenebilir.

Bu teknikle, nöral diferansiyasyonun nicelendirilemesi çok daha hızlıdır ve Optane verileri daha geniş bir temele ve mikrofotografi tekniklerine dayanmaktadır. Hücrelerin saf matrise gömülmesi için, öncelikle dört kuyucuklu bir hücre kültür plağının iki kuyucuğuna 13 milimetre çapında sterilize edilmiş cam lameller yerleştirin. Ardından, plağı daha sonra kullanmak üzere temiz bir çalışma alanında (clean bench) saklayın. Sonra, 2,5 mililitre taze hazırlanmış tripsin ekleyerek insan nöral progenitör hücrelerini veya H NPCs'leri ayırın.

Kültür kabına benzon a çözeltisi ekleyin ve hücre süspansiyonunu 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında inkübe edin. Beş dakika sonra, reaksiyonu tripsin inhibitörü benzon a çözeltisi ile durdurun. Ardından, ayrılan hücreleri oda sıcaklığında 3000 ×g'de beş dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün, oluşan peleti 5 mL %10 sakroz çözeltisi ile yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu aynı santrifüj koşulları altında yıkayın.

Resüsyon süpernatantını uzaklaştırdıktan sonra, peleti son hücre konsantrasyonu 1 × 10⁶ hücre/mL olacak şekilde sakroz çözeltisi içinde süspanse edin. Şimdi mümkün olduğunca hızlı bir şekilde, 60 µL hücre süspansiyonunu birinci çözelti ile karıştırın; bu süspansiyondan 120 µL'yi ikinci çözeltinin bulunduğu konik tüpe aktarın, dikkatlice karıştırın ve ardından karışımın 100 µL'sini derhal dört kuyucuklu plaktaki lamel camların her birinin üzerine katmanlar halinde ekleyin. Son olarak, her bir kuyucuğa yavaşça 200 µL hücre kültür ortamı ekleyin.

İki ila üç dakika sonra, matriksin kendi kendine birleşmesini başlatmak için kuyucuklara 200 µL daha hücre kültür medyumu ekleyin. Hücreleri, temizleme kabininizin ısıtmalı bölgesinde 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Matriksler birleştikten sonra hücre kültür plağını mümkün olduğunca hareket ettirmemeye özen göstererek, matrikslerin kurumasını önlemek amacıyla medyumun tamamını değil, büyük bir kısmını uzaklaştırmak için 1000 µL'lik bir pipet kullanın.

Ardından matrisleri 10 dakika boyunca 500 µL taze besiyeri ile yıkayın. Son olarak, yıkama besiyerini uzaklaştırın. 500 µL daha besiyeri ekleyin ve kültür plağını inkübatöre yerleştirin.

Mümkünse, boyama deneyinin ilk gününde yapıların yanlışlıkla sarsılmasını önlemek için matrisleri kendi inkübatörlerinde saklayın. Medyumu 1000 microliter pipetle matrislerden uzaklaştırın ve ardından iskeleleri bir kez beş dakika boyunca PBS ile yıkayın.

Ardından PBS'yi uzaklaştırın ve matrisleri sabitlemek için her kuyucuğa 400 µL paraldehit ekleyip oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İskeleler sabitlendikten sonra, beş dakika boyunca 500 µL PBS ile yıkayın. Daha sonra yapıları ve bloklama tamponunu altı ila dokuz saat boyunca inkübe edin; tamponu her iki ila üç saatte bir değiştirin ve son olarak ertesi güne kadar dört °C'de taze bloklama tamponunda gece boyu inkübe edin; ertesi gün bloklama tamponunu uzaklaştırın.

Antikor çözeltisini kuyucuklara ekleyin ve matrisleri tekrar dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Şimdi, primer antikor çözeltisini uzaklaştırın ve iskeleleri 500 µL PBS ile sekiz saat boyunca yıkayın; PBS'yi her iki saatte bir değiştirin ve ardından taze PBS ile dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca yıkamaya devam edin. Gece boyu süren yıkama işleminden sonra PBS'yi uzaklaştırın ve iskeleleri sekonder antikor çözeltisi ile oda sıcaklığında, karanlıkta dört saat boyunca inkübe edin.

Ardından, numuneleri her seferinde bir saat boyunca dört ila altı kez PBS ile yıkayın ve daha sonra yapıları dört derece Celsius'ta, karanlıkta, gece boyunca taze PBS ile inkübe edin. Matrislerin montajına hazırlamak için mikroskop lamlarının üzerine 50 µL MOE all dab co ekleyin. Daha sonra her lamın üzerine dikkatlice bir kapatma camı yerleştirin.

Son olarak, burada gösterilen nöronal belirteç beta three tubulin ekspresyonu için yeşil boyanmış H NPCs'lere benzer şekilde tekil mikrograflar ve Zacks elde etmek için floresan mikroskobu kullanın. İskeleleri bir dakika boyunca 500 µL HBSS ile yıkadıktan sonra, iskeleleri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarmak için 1000 µL'lik bir pipet kullanın. Ardından, matrisleri mekanik olarak parçalamak için hücre solüsyonunu 1000 µL'lik bir pipetle birkaç kez yeniden süspande edin ve ardından iskele solüsyonunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 3000 ×g'de santrifüjleyin, süpernatantı bir pipetle uzaklaştırın ve daha sonra peleti birkaç kez yukarı aşağı pipetleyerek 500 µL tripsin benzin solüsyonunda yeniden süspande edin.

Ardından hücreleri 37 °C'de inkübe edin. Beş dakika sonra reaksiyonu bir mililitre tripsin inhibitörü ile durdurun. Hücre süspansiyonunu aynı santrifüj koşulları altında çöktürdükten sonra Benzonase çözeltisini birkaç kez pipetleyerek karıştırın.

Hücreleri iki kez 2 mL HBSS tamponu ile yıkayarak tüm matriks kalıntılarını uzaklaştırın. Son olarak, hücre süspansiyon çözeltisini aynı koşullar altında 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirerek agregatları temizleyin ve hücreleri hücre kültürü ortamına toplayın. Ayrıştırılmış hücrelerin oda sıcaklığında, bir çalkalayıcı üzerinde %1 paraformaldehit ile 15 dakika boyunca fikse edilmesiyle işleme başlayın.

Ardından, hücreler çöktürüldükten sonra peleti yıkama tamponunda süspanse edin. Hücreler 4 °C'de 350 ×g kuvvetinde 10 dakika boyunca santrifüj edildikten sonra, elde edilen peleti 25 µL antikor çözeltisinde tekrar süspanse edin. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında, bir çalkalayıcı üzerinde iki saat boyunca inkube edin.

Ardından, numunelere doğrudan 300 µL pon tamponu ekleyin ve ardından hücre süspansiyonlarını aynı santrifüj koşulları altında iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, 25 µL sekonder antikor ekleyin ve ardından hücreleri oda sıcaklığında, karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra hücreleri saponin tamponu ile iki kez daha yıkadıktan sonra, peleti 500 µL yıkama tamponu ile akış sitometrik analiz için yeniden süspanse edin.

Bu şekilde, enkapsüle edilmiş H NPC'ler ve saf matris gösterilmiştir; hücreler, küreler arasındaki çapı birkaç yüz mikrona kadar ulaşabilen, yoğun paketlenmiş yapılarda küreler halinde büyür. Hücreler tarafından oluşturulan uzantı demetleri beyaz oklarla belirtildiği gibi gözlemlenebilir. Münferit hücreler güçlükle tanınabilse de, laminin ile desteklenmiş saf matrise enkapsüle edilen hücreler, bu şekilde görüldüğü üzere daha az yoğun yapılarda büyür ve daha homojen bir şekilde dağılır; hatta siyah oklarla belirtilen daha az yoğun alanlarda tekil hücreler tanınabilir. Burada H NPC'ler, nöronal marker ekspresyonu için yeşil boyanmış, laminin destekli saf matriste dört gün boyunca diferansiye edilmiştir.

Pozitif hücrelerin yüzdesini değerlendirmek için Beta üç tübülin gösterilmiştir. Toplam hücre sayısı, burada dappy ile maviye boyanmış hücre çekirdeklerinin sayılmasıyla belirlenebilir. Bu mikrofotograf, bir floresan mikroskopla çekilen Z istiflemesi görüntülerinin tam projeksiyonunu temsil etmektedir.

Matristen salınan hücreler, örneğin bu şekilde gösterildiği gibi, ileri fonksiyonel çalışmalar için lameller üzerine tekrar yerleştirilebilir. Bu mikrograf, daha önce bahsedilen salınma prosedürüne tabi tutulduktan sonra 3D olarak kültüre edilen ve üç gün boyunca kültüre edilen hücreleri göstermektedir. Kırmızı renkteki beta üç tubulin boyaması, boyanmamış hücrelerin negatif kontrol olarak kullanıldığı 3D iskelede konaklanan hücrelerle benzer bir morfoloji sergilemektedir.

Burada siyah çerçeve ile temsil edilen GA, beta three tubulin pozitif hücrelerin sonraki analizi için ayarlanmıştır; bu nokta grafiğinde pozitif hücreler x ekseninin sağ kısmındaki siyah çerçeve içinde görünmektedir ve noktalı çerçeve içindeki ara popülasyon ise büyük olasılıkla hücre kalıntılarını temsil etmektedir ve gözlemlenebilmektedir. Manuel hücre sayımı ile akış sitometrisi ile yapılan sayımın karşılaştırması bu son şekilde gösterilmiştir. Açık siyah karelerle belirtildiği üzere, akış sitometrik analizi ile, dolu siyah üçgenlerle belirtilen tipik manuel sayıma kıyasla çok daha yüksek oranda pozitif hücre tespit edilebilmektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, kenar MPC'lerin 3D iskelede kültürlenmesi için düşük metriklerin nasıl kullanılacağı ve hücrelerin akış sitometrisi analizörleri için iskeleden nasıl serbest bırakılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.