Name: Önce DNA Saflaştırma olmadan Bitki ve Hayvan Örnekleri genotiplendirmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Öğrenin, DNA saflaştırma olmadan bitki ve hayvan dokularından doğrudan PCR ile genotipleme yapmayı. Arabidopsis, meşe yaprağı ve transgenik fare örneklerinde zamandan ve maliyetten tasarruf sağlayan bu yöntemi keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Arabidopsis örnekleri ve ilgili PCR primerleri için biz Profesör Jaakko Kangasjärvi ve grubu, Bitki Stres Grubu, Bitki Biyolojisi, Biosciences Bölümü, Helsinki Üniversitesi ederim. Geleneksel yöntem ile deneyler Bayan Airi Lamminmäki tarafından yapılmıştır. Transgenik fare örnekleri Dr Jaana Vesterinen, Biyotıp / Biyokimya Enstitüsü, Helsinki Üniversitesi tarafından sağlandı. Harris Uni-Core ve Harris Kesme Mat Tüm diğer ticari markalar Thermo Fisher Scientific Inc ve iştiraklerinin mülkiyetindedir Shunderson Communications Inc ticari markalarıdır.

1. Doğrudan Protokolü Arabidopsis Bitki Bireylerin genotiplendirmesi <ol><li> Arabidopsis bitki yaprağı doğrudan dCAPS genotipleme tahlil başlamak için, ilk olarak Tablo 1&#39;de açıklandığı phire Bitki Direkt PCR Kit kullanarak 20 veya 50 ul PCR reaksiyonları formüle. </li><li> Sonraki Harris Uni-Core ve Harris Kesme Mat kullanarak Arabidopsis bitki yaprak bir 0.50 mm yumruk kesti. Sıkıca zımba Holding, doku içine kesme kenarına basın ve ileri geri puncher döndürün. </li><li> PCR reaksiyon karışımı içine zımba diski çıkarmak için dalgıç basın. Örnek PCR çözüm içine düşer ve tüp duvarları sopa değil emin olun. </li><li> 2% NaClO çözelti içine batırarak çapraz bulaşmayı önlemek için her örnek arasındaki delici ve kesici kenar temizleyin. Dalgıç kadar basın ve aşağı birkaç kez ve temiz bir kağıt havlu ile kesme kenarı silin. Kesme mat de olmalıdırnumuneler arasındaki durulanır. </li><li> Daha sonra, bir termo Scientific kullanmak piko Cycler ve Thermo Scientific piko PCR Plate Tablo 2 &#39;de tarif edilen döngü koşulları kullanılarak PCR reaksiyonları gerçekleştirmek için 24-iyi termal. PCR reaksiyonları, aynı zamanda, geleneksel PCR termal cycler&#39;ların içinde gerçekleştirilebilir. </li><li> PCR sonra, bitki materyali aşağı spin. Yeni bir mikrosantrifüj tüpüne 5 ul süpernatan aktarın. Su 4 ul ve restriksiyon enzimi, SspI 1 ul ekleyin. Yavaşça karıştırın ve tüpün dibinde içeriği toplamak için kısaca aşağı doğru döndürün. 37. az bir saat boyunca reaksiyon karışımı inkübe ° C. 20 dakika süreyle 65 ° C&#39;de inkübe edilerek kısıtlama enzim inaktive eder. </li><li> Bitki dokuları doğrudan DNA yükselterek zaman, PCR ürünleri restriksiyon sindirimi enzimi ile etkileşime girebilir bitki ve PCR-türetilmiş bileşenler içerir. Bu nedenle, ya da seyreltik (örn., 1:2 veya su 1:3) ya da t önce PCR ürünü temizlemek için gerekli olabilecekböyle Thermo Scientific GeneJET PCR Saflaştırma Kiti gibi uygun bir ticari kit kullanılarak, örneğin sonraki sindirim,. </li><li> , Sınırlama enzimi özümlemesi takiben, bir agaroz jeli üzerinde analiz çıkan parçalar. Reaksiyon için 5x yükleme tampon 2.5 ul ekle ve nihai karışım, 10 ul ile agaroz jel elektroforezi gerçekleştirir. </li></ol> 2. 15 yaşındaki Oak Spesifik DNA parçaları yükselterek Seyreltme Protokolü kullanarak Yapraklar <ol><li> Başlamak için, meşe yaprağı 2 mm yumruk kesti. </li><li> Phire Bitki Direkt PCR Kit ile birlikte Sulandırma Tamponu 20 ul içine örneği yerleştirin. Delici ve kesici kenar temizleyin ve daha önce olduğu gibi mat kesme. </li><li> Tüp duvara kısaca basarak 100 ul pipet ucu ile yaprak örneği Crush. Bitki materyali bağlı dilüsyon protokolü bazen örnek ezilmeden iyi çalışır. </li><li> T kadar mikrosantrifüj kısaca örnekleri Spino reaksiyon Tüplerin tabanında yer almaktadır. </li><li> Süpernatan PCR içinde doğrudan kullanılabilir, ya da örnek türüne bağlı olarak steril su 1:10 ya da 1:100 dilüe edilebilir. Bir 20 ul PCR reaksiyonu için şablon olarak süpernatan ya da seyreltme 1 ul 0.5 ul kullanın. Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi reaksiyonu hazırlayın. </li><li> Reaksiyonları hazırlanır sonra, bir Thermo Scientific kullanmak piko Cycler ve Thermo Scientific piko PCR Plate Tablo 2 &#39;de tarif edilen döngü koşulları kullanılarak PCR reaksiyonları gerçekleştirmek için 24-iyi termal. PCR reaksiyonları, aynı zamanda, geleneksel PCR termal cycler&#39;ların içinde gerçekleştirilebilir. </li><li> PCR sonra, reaksiyon için 5x yükleme tamponu 5 ul ekleyin ve nihai karışım, 15 ul ile agaroz jel elektroforezi gerçekleştirir. </li></ol> 3. Seyreltme Protokolü kullanarak Transgenik Farelerin genotiplendirmesi <ol><li> M 2 mm yumruk koyarak transgenik fareler üzerinde seyreltme protokolü Başlayanphire Hayvansal Doku Direkt PCR Kit ile birlikte DNARelease Katık 0.5 ul içeren Sulandırma Tamponu 20 ul ouse kulak. </li><li> 98 2 dakika inkübasyon, ardından 2 dk ° C&#39;de için numuneler oda sıcaklığında inkübe </li><li> Reaksiyon tüplerin alt olana kadar bir mikrosantrifüj içinde kısaca örnekleri Spin. </li><li> Tablo 3 &#39;de tarif edildiği gibi hazırlanan bir 20 ul PCR reaksiyonu için şablon olarak 1 ul süpernatan kullanımı. Hemen kullanılmak üzere olmayan herhangi bir Süpernatant yeni bir tüpe aktarılmıştır ve -20 ° C&#39;de saklanabilir </li><li> Daha sonra, bir termo Scientific piko 24-iyi termal döngü cihazı ve Thermo Scientific piko PCR Plate Tablo 4 &#39;de tarif edilen döngü koşulları kullanılarak PCR reaksiyonları gerçekleştirmek için kullanır. Yine, PCR reaksiyonları, aynı zamanda, geleneksel PCR cycler&#39;ların içinde gerçekleştirilebilir. </li><li> PCR sonra, reaksiyon için 5x yükleme tamponu 5 ul ekle ve agaroz jel elektroforez w gerçekleştirmekMeydana gelen karışım, Vizyonunda 15 ul. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar DCAPS teknikte ilgi SNP içinde sınırlandırma bölgesi ya da katılabilmekte ya da hedef DNA bir ya da daha fazla uyumsuzlukları ile bir PCR primer ile yok edilir. Arabidopsis bitki bireylerin Genotiplendirme doğrudan yaprak yumruklar gelen dCAPS tekniği ile yapıldı. Amplifiye ürünler sindirilir ve her bireyin genotipinin ortaya çıkan parçalar (Şekil 2) jel elektroforezi ile analiz edildi. Bu örnekte, Arabidopsis genom ilgi SNP sitesi (G ya da A alleli) içeren 160 bp PCR ürünleri phire Plant doğrudan PCR Kit ile bitkinin yaprak zımbalar amplifiye edildi. Ileri primer ilgi SNP (A aleli) dahil, ancak, hedef DNA bir SspI özel sınırlama alanı yaratmak, 3 &#39;ucunda bir uyumsuzluk içerdiğiSNP (Şekil 2B) diğer allel içinde. Seyreltme protokolleri fenolik bileşikler, yüksek konsantrasyonu nedeniyle bu tür meşe yaprağı gibi zorlu bitki materyali, için gereklidir. Seyreltme protokolü kullanılarak burada açıklandığı gibi, chloroplastic DNA 297 bp fragmanı 3 aşamalı bir protokol kullanılarak büyütüldü. Dilüsyondan ile Oak yaprak örneklerinde pozitif ve negatif kontroller ek olarak, Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Phire Hayvansal Doku Direkt PCR Kit için transgenik fareler için 1500 bp ve 200 bp hem doğru boyutlu ürünlerin bol verimi sonuçlanan bir primer seti büyük bir boyut farkı olan iki parçalarının amplifikasyonu için kullanılan zorlu bir protokol ile istihdam edildi vahşi tip farelerde (Şekil 4). Heterozigot farelerde zayıf üst bant aynı primer çifti için iki şablon (alleli) ve rekabet nedeniyle, ancak, genotiping sonuçlar açık bulunmaktadır. Seyreltme protokol kullanılarak hazırlanan numunelerin stabilitesi de test edilmiştir. Elde edilen sonuçlar, seyreltme numuneler, en az bir yıl süre ile -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir olduğunu göstermektedir. Ayrıca, tekrarlanan donma / çözülme döngüsü anlamlı reaksiyon (Şekil 5) etkilememiştir. Ayrıca phire DNA Polimeraz ve sıcak başlangıç ​​Taq polimeraz ve saflaştırılmış DNA (Şekil 6) göre doğrudan PCR yöntemiyle fare kulak doku örneklerinden sağlam amplifikasyon olduğu gösterilmiştir. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Bileşenleri </td><td fo:width=".75in"> 20 ul reaksiyon </td><td fo:width=".75in"> 50 ul reaksiyon </td><td fo:width=".75in"> Final Conc. </td></tr><tr><td> H2O </td><td> 20 ul ekle </td><td> 5 ekle0 ul </td><td></td></tr><tr><td> 2x phire Bitki PCR Tamponu </td><td> 10 ul </td><td> 25 ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Astar A </td><td> X ul </td><td> X ul </td><td> 0.5 uM </td></tr><tr><td> astar B </td><td> X ul </td><td> X ul </td><td> 0.5 uM </td></tr><tr><td> Phire Hot Start II DNA Polimeraz </td><td> 0.4 ul </td><td> 1 ul </td><td></td></tr><tr><td> Örnek / doğrudan protokol </td><td></td><td> 0.50 mm yumruk </td><td></td></tr><tr><td> Örnek / seyreltme protokolü </td><td> 0.5-1 ul </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1.<html> Bitki PCR reaksiyon şartları bu protokolü kullanılmıştır. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Döngü Adım </td><td fo:width=".5in"> Temp. </td><td fo:width=".5in"> Zaman </td><td fo:width=".4in"> Döngüler </td></tr><tr><td> İlk denatürasyon </td><td> 98 ° C </td><td> 5 dk </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Denature * Tavlama Uzatma </td><td> 98 ° C X ° C 72 ° C </td><td> 5 sn 5 sn 20 sn </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Nihai Uzatma </td><td> 72 ° C 4 ° C </td><td> 1 dakika tutmak </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Bitki PCR BİSİKLET koşulları bu protokolü kullanılmıştır. At * Tm hesaplayıcıoscientific.com / pcrwebtools &quot;hedef =&quot; phire Hot Start II DNA polimeraz ile kullanılmak için primerler için Tm belirlerken _blank &quot;&gt; www.thermoscientific.com / pcrwebtools tavsiye edilmektedir. primerler için tavsiye edilen tavlama sıcaklık ≤ 20 nt kadardır webtool tarafından verilen daha düşük Tm. primerler&gt; 20 nt için bir tavlama sıcaklık 3 ° &#39;lik C webtool tarafından verilen daha düşük Tm daha yüksektir. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Bileşenleri </td><td fo:width=".75in"> 20 ul reaksiyon </td><td fo:width=".75in"> Final Conc. </td></tr><tr><td> H2O </td><td> 20 ul ekle </td><td></td></tr><tr><td> 2x phire Hayvansal Doku PCR Tamponu </td><td> 10 ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Astar A </td><td> X ul </td><td> 0.5 uM </td></tr><tr><td> astar B </td><td> X ul </td><td> 0.5 uM </td></tr><tr><td> Phire Hot Start II DNA Polimeraz </td><td> 0.4 ul </td><td></td></tr><tr><td> Örnek / seyreltme protokolü </td><td> 1 ul </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 3. Hayvansal Doku PCR için reaksiyon koşullarının bu protokolü kullanılmıştır. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Döngü Adım </td><td fo:width=".5in"> Temp. </td><td fo:width=".5in"> Zaman </td><td fo:width=".4in"> Döngüler </td></tr><tr><td> İlk denatürasyon </td><td> 98 ° C </td><td> 5 dk </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Denature * Tavlama Uzatma </td><td> 98 ° C X ° C 72 ° C </td><td> 5 sn 5 sn 20 sn ≤ 1 kb 20 sn / kb&gt; 1 kb </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Nihai Uzatma </td><td>72 ° C 4 ° C </td><td> 1 dakika Tutmak </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tablo 4. Bu protokolde kullanılan Hayvansal Doku PCR için Bisiklete binme koşulları. * Olarak Tm hesap makinesi <a href="http://www.thermoscientific.com/pcrwebtools" target="_blank">www.thermoscientific.com / pcrwebtools</a> phire Hot Start II DNA polimeraz ile kullanılmak için primerler için Tm belirlerken tavsiye edilir. Primerler ≤ 20 nt için önerilen bir tavlama sıcaklık webtool tarafından verilen daha düşük Tm eşittir. Primerler&gt; 20 nt için bir tavlama sıcaklığı 3 kullanın ° C webtool tarafından verilen düşük Tm daha yüksektir. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Doğrudan PCR iş akışı. Direkt PCR iki alternatif protokoller kullanılarak yapılabilir. Doğrudan protokol örneği küçük bir miktar doğrudan bilgisayara eklenirR reaksiyonu. Seyreltme protokol numune malzemeden DNA serbest bırakmak için PCR önce, kısa bir ön-kuluçka adım kullanmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> Şekil 2. Yaprak yumruklar doğrudan dCAPS tekniği ile Arabidopsis bitki bireylerin genotiplendirmesi. A) Şekil 2A dCAPS testinin prensibi gerçekleştirilir göstermektedir. İlgi SNP içinde sınırlandırma bölgesi ya da katılabilmekte ya da hedef DNA bir ya da daha fazla uyumsuzluğu olan bir primer kullanılarak PCR ile uzaklaştırılır. PCR ürünleri sindirilir ve elektroforezi ile analiz edildiğinde çıkan parçalar her bireyin genotipinin ortaya koymaktadır. B) Bitki yapraklarından 0.50 mm yumruklar 50 ul PCR reaksiyonlarında doğrudan yerleştirildi edilir. SNP sitesi (G veya A alleli) içeren 160 baz çiftlik PCR ürünleri primerleri A alleli için eşsiz bir SspI sitesini tanıtan ile amplifiye edildi. Arıtılmadan PCR ürünleri Diges idiSspI restriksiyon enzimi ile ted. Elde edilen fragman, bir% 3 agaroz jeli üzerinde analiz edilmiştir. Lane M boyut işaretleyici olarak kullanılabilir; şerit A ve G&#39;nin her biri numune SNP allel karşılık gelir. Elde edilen sonuçlar PCR ve restriksiyon sindirimi (veriler gösterilmemiştir) tarafından takip DNA ekstraksiyonu geleneksel analizi ile teyit edilmiştir. Şablon DNA olmadan negatif kontrol reaksiyonları kurmak testi dahil ve sindirim (veriler gösterilmemiştir) gerçekleştirmeden önce gerçek PCR reaksiyonları ile paralel ayrı bir agaroz jel üzerinde çalışıldı. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3.jpg" alt="Şekil 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3highres.jpg" /> Şekil 3,. Seyreltme protokolü meşe yaprağı örnekleri kullanarak. Seyreltme protokolü (1:100, 1:10, 1 farklı dilüsyonlarda meşe yaprağı örnekleri (3-adım protokolü, 62 ° C&#39;de tavlama) içinde chloroplastic DNA 297 bp parçasının büyütülmesi için kullanılan : 1 ve 2:1) ve pozitif ve negatif controls [C +: C-: Hiçbir şablon DNA negatif kontrol saflaştırılmış DNA (Arabidopsis), pozitif kontrol]. Örnek isimlendirme numune toplama site (Finlandiya kasaba) ve numaralandırma örnek temsil eder. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig4.jpg" alt="Şekil 4," /> Şekil 4. Seyreltme protokolü kullanarak bir primer çifti ile transgenik farelerin genotiplendirmesi. Dokuz ayrı fareler (şerit 1-9) Kulak dokuların DNARelease Katkı dahil Sulandırma Tamponu 20 ul yerleştirildi. Oda sıcaklığında inkübe edilmesi ve sonra, 98 ° C, 1 ul süpernatan 20 ul PCR tepkimesinde bir şablon olarak kullanılmıştır. Fragment boyutları: 1500 bp (transgenik) ve 200 bp (yabani-tip). <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig5.jpg" alt="Şekil 5," /> Şekil 5,. Numuneler uzun süreli depolama boyunca stabildir. Fare kulak doku örnekleri inc olan seyreltme protokolüne göre hazırlanmış<html> DNARelease katkı maddesi de dahil olmak üzere seyreltme tamponu 20 ul içinde ubated ve tekrarlanan donma / çözülme (kulvar 1) tabi tutuldu bir yıl (kulvar 2) için -20 ° C &#39;de depolandığı ya da PCR (yol 3) için hemen kullanılmıştır. Amplifiye parçası boyutları 900 bp 1.500 bp ve 3.200 bp idi. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6. Phire Hayvansal Doku Direkt PCR Kit sıcak bir başlangıç ​​Taq DNA polimeraz ile birlikte ticari bir DNA arıtma sistemi geride bırakıyor. Dört amplikonlarının (0.5-1.5 kb) phire Hayvansal Doku Direkt PCR Kit seyreltme protokolü kullanarak fare kulak dokulardan amplifiye edildi. Karşılaştırma için, DNA ilk olarak ticari bir DNA çıkarma kiti kullanılarak ve aynı parçaları üreticilerin önerilerine uygun olarak sıcak bir başlangıç ​​Taq DNA polimeraz kullanılarak amplifiye edildi saflaştırılmıştır. Sadece phire Hayvansal Doku Direkt PCR Kit ile başarıyla güçlendirilmiş dört amplikonlarının vardı. T &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig7.jpg" alt="Şekil 7" /> Şekil 7. Kez / tüketilen reaktifleri. Tahmini ile iş akışı Evrensel karşılaştırılması Thermo Scientific Direkt PCR yaklaşımı DNA izolasyonu yaklaşımı, Ekstraksiyon tampon yaklaşımı ve PCR tampon yaklaşımı ile karşılaştırılır. Önceki PCR adım her yaklaşım için tahmini süre kırmızı metin listelenir. Thermo Scientific Direkt PCR yaklaşımı PCR öncesi numune hazırlama için sadece 0-4 dakika sürer. Her bir yöntem Aşağıda, tüketilen reaktifler listelenmiştir. Thermo Scientific Direkt PCR yaklaşımın diğer yöntemlere kıyasla reaktiflerin az miktarda kullanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3844/3844fig7large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol><li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochemical Bulletin. 19, 11-15 (1987).</li>
<li>Kim, C. S., Lee, C. H., Shin, J. S., Chung, Y. S., Hyung, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+method+for+isolation+of+high+quality+genomic+DNA+from+fruit+trees+and+conifers+using+PVP%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP.</a> Nucleic Acids Research. 25, 1085-1086 (1997).</li>
<li>Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dCAPS%2C+a+simple+technique+for+the+genetic+analysis+of+single+nucleotide+polymorphisms%3A+experimental+applications+in+Arabidopsis+thaliana+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.</a> The Plant Journal. 14, 387-392 (1998).</li>
<li>Michaels, S. D., Amasino, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+method+for+detecting+single-nucleotide+changes+as+polymorphic+markers+by+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A robust method for detecting single-nucleotide changes as polymorphic markers by PCR.</a> The Plant Journal. 14, 381-385 (1998).</li>
<li>John, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+isolation+of+RNA+and+DNA+from+plants+containing+polyphenolics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenolics.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2381-23 (1992).</li>
<li>Wang, Z., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+DNA+from+mouse+tails%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Extraction of DNA from mouse tails.</a> BioTechniques. 41, 410-412 (2006).</li>
<li>Malumbres, M., Mangues, R., Ferrer, N., Lu, S., Pellicer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+High+Molecular+Weight+DNA+for+Reliable+Genotyping+of+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Isolation of High Molecular Weight DNA for Reliable Genotyping of Mice.</a> BioTechniques. 22, 1114-1119 (1997).</li>
<li>Yang, Y., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+Leaves+Using+AnyDirect+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis Leaves Using AnyDirect system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40, 444-447 (2007).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory%22">Molecular Cloning: A Laboratory</a>. , 2nd ed, CSH Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).</li>
<li>Meldgaard, M., Bollen, P. J. A., Finsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+method+for+sampling+and+extraction+of+mouse+DNA+for+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Non-invasive method for sampling and extraction of mouse DNA for PCR.</a> Laboratory Animals. 3, 413-441 (2004).</li>
</ol>

Bu makalenin Üretim ve Serbest Giriş Thermo Fisher Scientific, Inc tarafından desteklenen

Burada gösterilen doğrudan PCR yaklaşımı zaman gerekli azaltılması ve bitki ve hayvan genotipleme (Şekil 7) için akışı kolaylaştırmak üzere doğrudan arıtılmadan örneklerinin küçük miktarlarda PCR amplifikasyonu için bir olanak sağlar. Ayrıca burada gösterilen doğrudan PCR yaklaşımı (Şekil 3) ile kombinasyon halinde seyreltme protokolünün kullanılmasıdır. Seyreltme protokolü zor örnekleri (bileşikler müdahale içeren örneğin yaşlı bitki yaprakları, bitki türleri) veya uzun (veya GC-zengin) amplikonlarının ile tavsiye edilir. Reaksiyon optimizasyonu için izin veren yeni bir doğrudan PCR deneyi, başlangıç ​​Bu protokol, özellikle yararlıdır. Protokol, doku malzemesi ve / veya kullanılan primerler farklılıklar nedeniyle düşük ürün verimleri gibi zaman zaman zorlukları gidermek için bir araç olarak hizmet edebilir. Seyreltme protokolü genelinde örnek bir tüketilen değildir sağlarken Ayrıca, aynı örnekten birden fazla reaksiyonlar çalıştırırken kullanmakreaksiyon. PCR için bitkilerden DNA arındırmak için, kongre potansiyel PCR analizi 8 engelliyor olabilir çeşitli bileşenleri kullanılarak DNA izolasyonu takiben hücre lizis yapılmasıdır. Yüksek fenolik içerik, polivinilpirolidon ilavesi ile özellikle zor bitkiler için geleneksel bir hücre parçalama 2,5 takiben DNA bağlama bileşikleri çıkarmak için kullanıldı. Açıkça burada olduğu gibi, bu karmaşık, zaman yoğun adımları hedef DNA tespit phire Bitki Direkt PCR Kit kullanımı ile önlenebilir. Hücre parçalama ve DNA izolasyonu adımları doğrudan Arabidopsis bitki yaprakları (Şekil 2) duyarlı dCAPS teknikler kullanılarak atlanabilir. Burada gösterildiği gibi, seyreltme protokol etkili bir PCR (Şekil 3) ile karışabilir sorunlu bileşenlerinin varlığını yönetir. Geleneksel olarak, hayvan genotipleme için bir önkoşul isolati olduorganik çözücü ekstraksiyonu, alkol yağış ve santrifüj adımları 6,9,10 takip deri ve bağ dokusu, sindirimi proteinaz K ile uzun bir inkübasyon ile karakterize bir toksik, zaman alıcı bir süreç yoluyla hayvan dokusu genomik DNA üzerinde. Olarak burada gösterdi, bu sürecin basitleştirilmesi transgenik farelerin önceden DNA arıtma (Şekil 4) olmadan genotiplenmiştir izin vererek, phire Hayvansal Doku Direkt PCR Kit kullanımı yoluyla elde edilir. Bu makale gösterilen örnek, özellikle tek bir primer seti büyük bir boyut farkı olan iki parçalarının amplifikasyonu için kullanılan gibi zordur. Protokol doğuştan gelen güç olmasına rağmen basit seyreltme protokol iki PCR ürünleri (Şekil 4) yüksek verimle sonuçlandı ile birlikte doğrudan PCR yaklaşımı kullanır. PCR tabanlı hedef DNA tespiti belirlemek için genotip analizi de dahil olmak üzere, araştırma alanında bir çok uygulama vargelişimi, fizyolojisi ve hastalık genlerin rolleri. Özel DNA polimeraz inhibitörü tolerans sayesinde, önceki protokol DNA arıtma olmadan en az sürede tamamlanabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Phire Bitki Direkt PCR Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-130 </td><td> 200 reaksiyonlar (50 ul her biri) </td></tr><tr><td> Phire Hayvansal Doku Direkt PCR Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-140 </td><td> 200 ilişkilerini de kullanmaya çalışıyorum (50 ul her biri) </td></tr><tr><td> Harris Uni-Core 0.35 mm (pembe) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-180s / L </td><td> Miktar: 5/25 </td></tr><tr><td> Harris Uni-Core 0.50 mm (mavi) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-185S / L </td><td> Miktar: 5/25 </td></tr><tr><td> Harris Mat 6,4 × 7,6 cm Kesme </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-190 </td><td> Miktar: 5 </td></tr><tr><td> SspI </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> ER0771 </td><td> 100 ul (100 reaksiyonlar) </td></tr><tr><td> Piko 24-Well Termal Cycler </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TCP0024 </td><td></td></tr><tr><td> 24-Peki Piko PCR Tabaklar </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> SLP0241 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJET PCR Saflaştırma Kiti </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> K0701 K0702 </td><td> 50 preparatlarıyla 250 preparatlarıyla </td></tr></tbody></table>

Önce dna saflaştırma olmadan bitki ve hayvan Örnekleri genotiplendirmesi

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

Doğrudan PCR yaklaşımı, doğrudan arıtılmadan örnek küçük miktarlarda PCR amplifikasyon kolaylaştırır, ve çeşitli bitki ve hayvan dokuları (Şekil 1) için burada gösterilmiştir. Direkt PCR onları böyle inhibitörleri yüksek tolerans gibi benzersiz özellikleri veren bir çift iplikli DNA bağlayıcı etki alanı içeren özel tasarlanmış Thermo Scientific Phusion ve phire DNA polimerazlar esas alınmaktadır. PCR tabanlı hedef DNA tespiti bitki genotip analizi ve transgenlerin doğrulanması dahil olmak üzere bitki araştırma birçok uygulama vardır. Bitki dokuları PCR geleneksel pahalı veya toksik reaktifler gerektirebilir ilk DNA izolasyonu adım içerir. Süreci zaman alıcıdır ve çapraz kontaminasyon 1, 2 riskini artırır. Tersine, Thermo Scientific phire Bitki Direkt PCR kiti kullanılarak hedef DNA kolayca önceden DNA ekstraksiyonu olmadan tespit edilebilir. Bu modelde, burada bir göstermiştiryarılan amplifiye edilen polimorfik sekans analizi (dCAPS) 3,4 örnek Arabidopsis bitki yapraklarından direkt olarak yapılır. dCAPS genotipleme deneyleri SNP allel-spesifik endonükleazlar 3 ile tek nükleotid polimorfizmleri (SNP) tanımlamak için kullanılır. Bazı bitki örnekleri onlar gibi fenolik bileşikler gibi PCR ile müdahale bileşenleri içerir olarak doğrudan PCR yöntemleri kullanırken daha zor olma eğilimindedir. Bu durumda, bileşikler kaldırmak için ilave bir aşama geleneksel 2,5 gereklidir. Burada, bu sorun, doğrudan PCR amplifikasyonu (Şekil 1) takip ettiği bir hızlı ve kolay bir seyreltme protokolü kullanılarak bu sorunun üstesinden gelinmemektedir. Numune tanen içeren fenolik bileşikler içerdiği yüksek miktardaki olarak Onbeş yaşındaki meşe yaprağı zorlu tesisleri için bir model olarak kullanılmaktadır. Fareler içine gen aktarımı genel olarak develo genlerin rollerini araştırmak için kullanılmaktadırpment, fizyolojisi ve insan hastalıkları. Bu hayvanların kullanımı genellikle PCR ile, transgen varlığının taranması gerekir. Geleneksel olarak, bu kulak, kuyruk veya ayak dokuları 6,7 arındırılan PCR analizi için hangi DNA sırasında zaman alıcı bir DNA izolasyonu adım içerir. Bununla birlikte, Thermo Scientific phire Animal Tissue doğrudan PCR Kit transgenik fareler ile önceden DNA arıtma olmaksızın genotipleme edilebilir. Bu protokol genotipleme transjenik fare gibi bir primer kümesi boyutu büyük ölçüde farklılık gösteren iki parça arasında amplifikasyonu için kullanılan bir zorlu örneğin burada gösterildiği gibi, fare kulak dokular tarafından doğrudan elde edilir.

Burada sunulan Direkt PCR yaklaşım doğrudan arıtılmadan bitki ve hayvan dokusu küçük miktarlarda PCR kolaylaştırır.

Önce DNA Saflaştırma olmadan Bitki ve Hayvan Örnekleri genotiplendirmesi

Doğrudan PCR yaklaşımı, saflaştırılmamış küçük miktardaki örneklerden doğrudan PCR amplifikasyonunu kolaylaştırır ve burada çeşitli bitki ve ... için gösterilmektedir.

Bu videonun genel amacı, bitki ve hayvan dokuları da dahil olmak üzere, saflaştırılmamış küçük miktardaki örneklerden doğrudan PCR amplifikasyonunun üç örneğini göstermektir. Doğrudan PCR, iki alternatif protokol kullanılarak gerçekleştirilebilir. Doğrudan protokolde, saflaştırılmamış çok küçük bir miktar örnek doğrudan PCR reaksiyonuna eklenirken, dilüsyon protokolü DNA'nın örnek materyalden salınması için PCR öncesinde kısa bir ön inkübasyon adımı gerektirir.İlk örnekte, arabidopsis genotiplendirmesi doğrudan protokol kullanılarak gerçekleştirilir. Hedef DNA'ya alele özgü bir restriksiyon bölgesi yerleştirilir ve ardından restriksiyon endonükleaz sindirimini takiben alele özgü tek nükleotid polimorfizmleri tanımlanır. Daha sonra, önce 15 yıllık meşe yapraklarından spesifik DNA fragmanlarını amplifiye etmek, ardından transgenik fareleri doğrudan fare kulak dokusundan genotiplendirmek için dilüsyon protokolü uygulanır.Her üç örnekte de, doğrudan PCR yöntemi sayesinde PCR öncesinde herhangi bir numune saflaştırma adımı uygulanmadan DNA amplifikasyonu gerçekleştirilmiştir. Doğrudan PCR'ın geleneksel yöntemlere göre temel avantajı, herhangi bir DNA ekstraksiyonu veya saflaştırma adımının gerekmemesidir. Bu durum, hem zaman hem de maliyet tasarrufu sağlamaktadır.Yazılı protokolde açıklandığı şekilde, bitki doğrudan PCR kiti kullanarak 20 veya 50 mikrolitre PCR reaksiyonları hazırlayarak türetilmiş kesilmiş, amplifiye edilmiş polimorfik dizi analizi veya dCAPS genotipleme deneyiyle başlayın. Ardından, Harris Uni unicorn ve kesme matı kullanarak, delgeçle Arabidopsis bitkisi yaprağından 0,50 milimetrelik bir örnek alın; bu sırada delgeçle sıkıca tutun. Kesme kenarını dokuya bastırın ve delgeci ileri geri döndürün.Zımba diskini PCR reaksiyon karışımına fırlatmak için pistonu bastırın. Numunenin PCR solüsyonuna düştüğünden ve iki duvara yapışmadığından emin olun. Doğrudan protokolde çapraz kontaminasyonu önlemek için, örnekleme aracının temizlenmesinde doğru yöntemin kullanılması kritik önem taşır.Her örnek arasında, delme aparatının kesici ucunu %2 sodyum hipoklorit çözeltisine daldırarak temizleyin. Pistonu birkaç kez yukarı aşağı bastırın ve kesici ucu temiz bir kağıt havluyla silin. Kesme matı da örnekler arasında durulanmalıdır.Ardından, bu videoya eşlik eden metinde açıklanan döngü koşullarını kullanarak PCR reaksiyonlarını gerçekleştirmek için bir Pico 24 kuyucuklu termal döngüleyici ve PCR plakası kullanın. PCR işleminden sonra, bitki materyalini santrifüjleyin. Dört mikrolitre su ekledikten sonra, süpernatanttan beş mikrolitre yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bir mikrolitre restriksiyon endonükleaz SSP ekleyin, hafifçe karıştırın ve tüpün dibindeki içeriği toplamak için kısa süreliğine santrifüj yapın.Reaksiyon karışımını 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, 65 °C'de 20 dakika boyunca inkübe ederek restriksiyon enzimini inaktive edin. Restriksiyon enzimi sindirimi sonrası, reaksiyona 2,5 µL beş x yükleme tamponu ekleyin.Elde edilen karışımın 10 µL'sini jel kuyucuğuna yükleyerek, sonuç fragmanlarını analiz etmek için agaroz jel elektroforezi gerçekleştirin. Başlangıç olarak, meşe yaprağından iki milimetrelik bir disk kesin. Numuneyi, plant direct PCR kiti ile birlikte verilen 20 µL seyreltme tamponu içerisine yerleştirin.Delme ve kesme matının keskin kenarını daha önce olduğu gibi temizleyin, yaprak örneğini 100 µL pipet ucuyla tüp duvarına kısa süreliğine bastırarak ezin. Reaksiyonlar tüplerin dibine çökene kadar örnekleri mikro santrifüj tüpünde kısa süreliğine döndürün. Süpernatant doğrudan PCR'da kullanılabilir veya steril su ile 1/10 veya 1/100 oranında seyreltilebilir.Numune tipine bağlı olarak, 20 µL'lik bir PCR reaksiyonu için şablon olarak 0,5 µL ila 1 µL süpernatan veya dilüsyon kullanın. Reaksiyonları yazılı protokolde açıklandığı şekilde hazırlayın. Reaksiyonlar hazırlandıktan sonra, metinde belirtilen döngü koşullarını kullanarak PCR reaksiyonlarını gerçekleştirmek için PICO 24 kuyucuklu termal döngüleyici ve PCR plakası kullanın.PCR sonrası, reaksiyona beş mikrolitre beş x yükleme tamponu ekleyin ve elde edilen karışımdan 15 mikrolitre ile agaroz jel elektroforezi gerçekleştirin. Transgenik farelerin genotiplemesi için dilüsyon protokolüne, hayvan dokusuyla birlikte sağlanan 0,5 mikrolitre DNA salınım katkısı içeren 20 mikrolitre dilüsyon tamponuna iki milimetrelik fare kulak dokusu punch'ı yerleştirerek başlayın. Direct PCR kiti ile örnekleri iki dakika boyunca oda sıcaklığında, ardından iki dakika boyunca 98 °C'de inkübe edin.Numuneler santrifüj edildikten sonra, 20 µL'lik bir PCR reaksiyonu için kalıp olarak 1 µL süpernatan kullanın. Hemen kullanılmayacak olan süpernatanlar yeni bir tüpe aktarılabilir ve -20 °C'de saklanabilir. Son adım olarak, yazılı prosedürde belirtilen döngü koşulları kullanılarak PCR reaksiyonlarını gerçekleştirmek için 24 kuyucuklu termal döngüleyici ve PCR plakası kullanılır. PCR sonrası, reaksiyona 5 µL 5x yükleme tamponu ekleyin ve D caps tekniği ile elde edilen karışımdan 15 µL kullanarak agaroz jel elektroforezi gerçekleştirin. İlgilenilen SNP içindeki kısıtlama bölgesi, hedef DNA ile bir veya daha fazla uyumsuzluğa sahip bir PCR primeri kullanılarak ya oluşturulur ya da yok edilir.Bu örnekte, Arabidopsis genomundaki ilgili g veya a SNP bölgesini içeren 160 baz çiftlik PCR ürünleri, Fire Plant Direct PCR kiti kullanılarak bitki yaprak disklerinden amplifiye edilmiştir. Forward primer, hedef DNA'da (A alelinde bulunan ancak SNP'nin diğer alelinde bulunmayan) bir SspI spesifik restriksiyon bölgesi oluşturan, 3' ucunda tek bir uyumsuzluk içermekteydi. Saflaştırılmamış PCR ürünleri SspI restriksiyon enzimi ile sindirilmiş ve ortaya çıkan fragmanlar agaroz jelde analiz edilmiştir; g ve a şeritleri her bir örneğin SNP allellerine karşılık gelmektedir.Bu görüntüde, bozulmamış PCR ürünleri solda, sindirilmiş fragmanlar ise sağda yer almaktadır. Meşe yaprağı gibi fenolik bileşiklerin konsantrasyonunun yüksek olduğu zorlu bitki materyalleri için, burada açıklanan dilüsyon protokolünün kullanılması gereklidir. Kloroplast DNA'sının 297 baz çiftlik fragmanı, üç adımlı bir protokol ile amplifiye edilmiştir.Pozitif ve negatif kontrollere ek olarak farklı dilüsyonlardaki meşe yaprağı örnekleri gösterilmektedir. Büyük boyut farkı olan iki fragmanın yalnızca tek bir primer seti kullanılarak amplifikasyonu için ateş hayvan dokusu direkt PCR kiti kullanılmıştır; bu işlem, transgenik fareler için 1500 baz çifti ve vahşi tip fareler için 200 baz çifti olan doğru boyutlardaki her iki ürünün bol miktarda elde edilmesiyle sonuçlanmıştır. Heterozygot farelerdeki daha zayıf üst bant, her iki şablonun aynı primer bağlanma bölgesi için rekabet etmesinden kaynaklanmaktadır.Buna karşın, genotipleme sonuçları kesin ve nettir. Dilüsyon protokolü kullanılarak hazırlanan örneklerin stabilitesi de test edilmiştir. Sonuçlar, tekrarlanan dondurma-çözme döngülerine maruz kalan dilüe edilmiş örneklerin ve en az bir yıl boyunca -20 °C'de saklananların, doğrudan PCR için kullanılan örneklerle karşılaştırılabilir olduğunu göstermektedir. Bu prosedürün performansını daha fazla test etmek için, fire animal tissue direct PCR kiti dilüsyon protokolü kullanılarak fare kulak dokularından dört amplikon amplifiye edilmiştir.Karşılaştırma amacıyla, DNA önce ticari bir DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak saflaştırılmış ve aynı fragmanlar, üretici önerilerine uygun olarak hot start tac DNA polimeraz ile amplifiye edilmiştir; yalnızca fire animal tissue direct PCR kiti ile dört amplikonun tamamı başarıyla amplifiye edilmiştir. Doğrudan PCR, çok sayıda örneğin amplifikasyonunu gerektiren genotipleme çalışmalarında özellikle kullanışlıdır. DNA saflaştırma adımının atlanması, deneyin gerçekleştirilmesi için gereken süreyi önemli ölçüde azaltabilir. Bu teknik, kontaminasyon riskini düşürerek ve değerli örnek materyalinden tasarruf sağlayarak ek avantajlar sunar.

genotyping-of-plant-and-animal-samples-without-prior-dna-purification

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz Amerikan pika gösterildiği gibi, verimli bir şekilde zor küçük memeliler saç örnekleri toplamak için bir non-invaziv örnekleme yaklaşımı sunuyoruz. Biz örneklenmiş saç DNA açılan ve yaban hayatı ekolojisi ve korunması çalışmalarında yaygın olarak kullanılan moleküler belirteçler çeşitli yükseltme bu yöntemin yararını göstermektedir.

Elusive Küçük Memeliler Yüksek Kalite DNA Edinme Noninvaziv Saç Örnekleme Tekniği

Hücre biyolojisinde temel bir arayış ökaryotik hücrelerin yapmak organellerin kimliği altında yatan mekanizmaları belirlemektir. Burada floresan mikroskobu ve yeni nesil dizileme araçlarını kullanarak bitki organel morfolojik ve fonksiyonel bütünlüğü sorumlu genleri tanımlamak için bir yöntem öneriyoruz.

Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

Bu makalede, zebra balığı kuyruk klipsinden DNA ekstraksiyonu açıklanmaktadır. Protokol, zebra balığı genotiplerini analiz etmek için hızlı ve verimli bir yöntem göstermektedir.

Kuyruk Klibinden DNA Ekstraksiyonu: Zebra Balığı Genotiplemesinde Kullanılan Bir Yöntem

Biz etiketleme ve yenidoğan farelerin genotiplenmesi ve onlardan birincil nöronal kültürlerin üreten prosedürleri açıklar. genotyping, hızlı, verimli ve güvenilir, ve otomatik nükleik asit ekstraksiyon için izin verir. Bu neonatally öldürücü fareler ve genotipleme önce tamamlanmasını gerektirmektedir kültürleri için özellikle yararlıdır.

Hayvanlar Rapid Genotipleme Beyin Nöronlar İlköğretim Kültürler kurulması izledi

Örneğin, kistik fibroz hava yolunu kullanarak, el yazması bir hayvan ile ilişkili örneklerde mikrobik ve virüs toplulukları karakterize metagenomic ve metatranscriptomic yaklaşımların bir kombinasyonu içeren kapsamlı bir akışını göstermektedir.

Saf olmayan Arındırıcı: Sıralama Metagenomes ve Metatranscriptomes Kompleksi Hayvan ilişkili Örneklerinden

Bakteriyel efektör proteinleri başarılı enfeksiyonları kurulması için önemlidir. Bu protokol, doğal bitki konukçuda bir bakteriyel efektör proteininin proteinli bağlanma partnerleri ile deneysel tanımlanmasını açıklar. Maya iki hibrit ekranlarından yoluyla bu efektör etkileşimleri belirlenmesi moleküler patojenite stratejilerinin çözülüyor önemli bir araç haline gelmiştir.

Bir Maya İki hibrid Ekran kullanarak Olmayan ekilebilir Bitki Patojen bir Bakteriyel Efektör Fonksiyonu aydınlatmak

Burada açıklanan, uzun okunan genom dizilemede kullanılmak üzere zorunlu biyotrofik mantar patojeni olan küllemeden genomik DNA'nın ekstraksiyonu, saflaştırılması ve kalite kontrolü için bir yöntemdir.

Uzun Okuma Dizi Yapmak İçin Küllemesi Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA saflaştırılması

İki bitki organelleri DNA zenginleştirme yönteminin karşılaştırılması ve optimizasyonu sunulmaktadır: geleneksel diferansiyel santrifüjleme ve metilasyon durumuna dayalı toplam gDNA'nın fraksiyonlanması. Ortaya çıkan DNA miktarını ve kalitesini değerlendirir, kısa okunmuş yeni nesil dizilemede performans gösteririz ve uzun okunan tek moleküllü dizilemede kullanım potansiyelini tartışırız.

Yeni nesil Sıralama için Uygun Bitki Organelleri DNA Zenginleştirme Yöntemlerinin Optimizasyonu ve Karşılaştırmalı Analizi

PBIBAC-GW ikili vektör oluşturma transgenik bitkiler sağlam tek kopya eklemeler, kolay bir süreç ile kolaylaştırır. Burada, bir dizi protokol okuyucu transgenik Arabidopsis bitkiler üretme ve bitkiler intactness için sınama işlemi boyunca rehberlik ve ekleme sayısı kopyalamak sunulur.

Transgenik bitkiler BIBAC-GW ikili vektör kullanarak tek kopya ekleme ile oluşturma

Bu iletişim kuralının amacı bilinen yalnızca kısmen bir ortak arındırıcı serisinden kolayca ayrılamayan roman dizileri bulamadı bir arada hesaplamalı ve tezgah araştırma kullanmaktır.

Eksiltici genomik tarafından roman sıra bulma

Mevcut protokol, bitki bazlı tıbbi materyallerin ve tıbbi bitki Angelica sinensis'in (Oliv.) Diels bir örnek olarak tanımlandı.

Tıbbi Bitkileri Tanımlamak için DNA Barkodlama Uygulaması

Öğrenin, DNA saflaştırma olmadan bitki ve hayvan dokularından doğrudan PCR ile genotipleme yapmayı. Arabidopsis, meşe yaprağı ve transgenik fare örneklerinde zamandan ve maliyetten tasarruf sağlayan bu yöntemi keşfedin.

Önce DNA Saflaştırma olmadan Bitki ve Hayvan Örnekleri genotiplendirmesi

Daha fazla video keşfet