Name: Yüksek verim Antifungal İlaç Tarama Candida albicans Biyofilm Chip (Ca BChip) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-18T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Keşfedin, Candida albicans biyofilm chip (Ca BChip) kullanarak yüksek verimli antifungal ilaç tarama yöntemini. Bu mikrodizi platformu, geleneksel yöntemlerle karşılaştırılabilir ilaç duyarlılık profilleri sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Güney Teksas Teknoloji Yönetimi (POCrr 2009,041), Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi (UL 1RR025767) ile Tıp ve Bilim Entegrasyon Enstitüsü, gelen hibelerle ve Diş &amp; Kraniyofasiyal Araştırmalar Ulusal Enstitüsü (kısmen finanse edildi 5R21DE017294).

1. Fonksiyonlu Slaytlar hazırlanması <ol><li> Çıkarılabilir bir slayt rafa mikroskop yerleştirin ve% 99 etanol (histolojik grade) içeren bir boyama kavanoza daldırarak iki kez yıkayın. Slaytlar sıkıştırılmış azot gazı bir jet kullanarak kağıt havlu (kağıt tozu üretmek için değil sağlanması), ve kuru kullanarak temizleyin. </li></ol> NOT: ince kağıt tozu üretecek olarak slayt silmek için Kim-Mendil kullanmayın. <ol start="2"><li> Gece boyunca oda sıcaklığında konsantre sülfürik asit ve inkübe ile doldurulmuş bir boyama kavanoz slaytlar içeren kayar raf batırmak. </li></ol> NOT: Konsantre asitlere ve toksik ve korozif kimyasallar ile çalışırken Deri ile teması engellemek için, kimyasala dayanıklı eldiven ve koruyucu gözlük kullanın. <ol start="3"><li> 30 dakika boyunca Milli-Q ile 30 dk ve yıkama (MΩ 18) su kaydırağı sonikasyon, bir başka yıkama ile takip edin5 dk için cetone. Bu tedavi Camdaki silanol grupları ortaya koyar. </li><li> Coat, 30 dakika boyunca APTES içinde kayar raf daldırarak her bir yıkama 15 dakika süreyle Milli-Q su ile 3 defa, yıkama ve kabartma tarafından 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) çözeltisi,% 2.5 &#39;i ile temiz bir kaydırak (su içinde hacim / hacim) 110 azından bir fırın içerisinde slaytlar ° C&#39;de 15 dakika süreyle. Pişirme yüzeyinin-NH2-fonksiyonlandırmalar sonuçlanan APTES bir çapraz bağlantı sağlar. </li></ol> NOT: tercihen cam kap duvarlarında APTES mevduat yana plastik bir kapta APTES çözüm olun. <ol start="5"><li> Hidrofobik kaplama 6 arasında bir mono-tabaka elde etmek için% 1 (toluen içinde ağırlık / hacim) polistiren-Co-maleyik anhidrid (PS-MA) (Sigma) ile bir sıkma kaplayıcı, kaplama slaytlar kullanılması. 30 s için 3000 rpm&#39;de bir spin lak ve kat üzerine monte temiz bir cam slayt üzerine PS-MA 2.0 mL ekleyin. Bu koşullar, kaplama gibi spin kaplama parametreleri yüzden göre değişebilirDirekt Ekspres, zemin, kaplama kalınlığı ve aşağıdaki denklemi 7 tarafından yönetilir </li></ol><img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/3845/3845eq1.jpg" /> h film kaplama kalınlığı burada, E buharlaşma oranı, η, C ve ρ, sırasıyla, kaplama solüsyonu viskozite, konsantrasyon ve yoğunluğu, ve ω açısal hız olup. NOT: çeker ocak uzun bir zaman ve kullanım için solunduğunda Toluen zararlıdır önerilir. <ol start="6"><li> 8 ° C - slaytlar 2 kuru ve tozsuz bir ortamda bir ay kadar bir slayt rafta saklanabilir </li></ol> 2. Maya inokulum ve Kollajen Encapsulation hazırlanması <ol><li> C. bir gecede kültür hazırlayın Maya pepton dekstroz albicans soyu SC5314, [YPD; 10 g / L maya ekstresi, 20 g / L pepton ve 20 g / L dekstroz] C. tek bir koloni inokulastonu ile sıvı ortamın al10 içine bicans - YPD 8, 20 mL. 30 ° C&#39;da - orbital çalkalayıcı (200 rpm 150) kültür inkübe edin. 10 mM fosfat tamponu, 2.7 mM potasyum klorid,; Hasat 1 mL Candida albicans maya gece boyunca YPD kültürleri (5-10 dakika boyunca 5000 rpm&#39;de santrifüje edilerek) hücreleri ve steril 1 ml fosfat içinde 10 dakika süreyle iki defa yıkayıp (PBS tamponlu salin 137 mM sodyum klorid, yıkama başına pH 7.4) (Sigma). Hasat 10 dakika boyunca 1900 rpm&#39;de santrifüje edilerek ayrıca hücreleri yıkanmıştır. 1 ml yeniden tampon (2.2% (ağırlık / hacim) sodyum bikarbonat ve% 4.8 (ağırlık / hacim) HEPES, pH 7.2 ile 0.2 N NaOH) içinde yıkanmış hücreleri yeniden süspanse edin. </li></ol> NOT: C. albicans Risk Grubu 1/BSL1 mikroorganizmadır. Her zaman bu mikroorganizma ile çalışmak için iyi aseptik / steril teknikler kullanmak ve biyolojik tehlikeli malzemelerin uygun şekilde bertaraf edilmesi için kurumsal prosedürleri takip etmeyi unutmayın. <ol start="2"><li> Bir hemocyt kullanarak hücreleri hesaplamaparlak bir alan mikroskobu Ometer ve 5 hücre yoğunluğu × 10 7 hücre / ml için ayarlayın. </li><li> Daha da 10 ilavesiyle süspansiyonu on kat seyreltik × RPMI-1640 L-glutamin ve takviye morpholinepropanesulfonic (MOPS) asit (pH 7.2) ile tampon. </li><li> Kolajen (1.8 mg / mL) ile RPMI-1640 yılında hücre süspansiyonu ile karıştırılması kollajen maya hücrelerinin saklanması (fare kuyruk gelen tipi 1, BD Biosciences, Bedford, MA) / 4 arasında bir nihai konsantrasyon x 10 hücreleri 6 elde etmek için ml. Yazdırmadan önce kollajen jelleşme önlemek için buz üzerinde kollajen-hücre süspansiyonu tutun. </li></ol> 3. Ca BChip hazırlanması <ol><li> Temizleyin ve% 70 izopropanol silerek kaynak plaka istasyonu, yıkama ve vakum istasyonu, vakum slayt tabağı ve baskı odası da dahil olmak üzere microarrayer tüm yüzeyleri, dezenfekte edin. </li><li> Mic slayt güvertesinde PS-MA-kaplı cam istenilen sayıda koyun ve vakum ile tutunroarrayer. </li><li> Vorteks hücre kuvvetlice kollajen süspansiyon ve sadece baskı öncesinde, bir 96-kuyulu plakalı bir kuyuya iyi karıştırılmış süspansiyonun 100 uL aspire. Yükleme istasyonu bu kaynak plaka yerleştirin. </li><li> Baskı sürecinde mikroarray odasında% 100 bağıl nem korumak için nemlendirici açın. </li><li> Konik konik 190 mikron delikli seramik ipuçlarını kullanarak temassız birikimi sonucu mikroarray gözcü (Omnigrid Micro, Digilab Inc, Holliston, MA) kullanılarak 1.2 mm aralıklı noktalar ile 48 satır ve 16 sütun bir dizi hücre süspansiyonu 50 nL yazdır (Digilab). </li><li> Başbakan baskı her turdan sonra uçları iki kez durulayın ve vakum-kurulayın. </li><li> Hemen baskıdan sonra, bir hava-sıkı, nemli odasına (Hibridizasyon kaset, ArrayIt Corporation, Sunnyvale, CA) slayt koyun ve 37 ° C biyofilm oluşumuna imkan vermek için 24 saat inkübe edin. </li></ol> 4. Pr Duyarlılık TestiAntifungal Ajanlar Karşı Ca BChip içinde eformed Biyofilmler <ol><li> Antifungal ilaçların stok solüsyonları veya toz itibaren, RPMI-1640 ortamı içinde çalışan bir solüsyon hazırlanır. Çalışma çözeltisi, tipik maksimum konsantrasyon 1024 ug / ml ve flukonazol için amfoterisin B 5 için 16 ug / ml &#39;dir. Diğer konsantrasyonları farklı ajanlar için kullanılabilir. </li><li> Ortasında bileşiğinin yaklaşık IC50 ile bir aralık yayılma, iki misli dilüsyonları içinde stok çözeltisi seyreltilmesiyle bileşiğin farklı konsantrasyonları sekiz hazırlayın. </li><li> Biyofilm büyüme 24 saat sonra, en azından, (20 dakika süreyle sodyum hipoklorit ile muamele) pozitif (sadece ortam hiçbir ilaç, yani hücre) ve negatif birlikte, kontrol ilaçların sekiz farklı konsantrasyonları 50 nL yazdırmak için microarrayer kullanımı Altı biyofilmlerin üstüne çoğaltır. </li></ol> NOT: add ise lekelerin kurumasını önlemek için% 100 nispi nemi koruyunilaçlar ing. <ol start="4"><li> Kısa bir süre ilaç eklendikten sonra, 24 saat süreyle 37 ° C sıcaklıkta nemlendirilmiş bir odacık içinde ilaçları ile çip inkübe edilir. </li><li> CaBChip 2 dakika 3-5 kez PBS içinde her zaman dunking tarafından uyuşturucu yıkayın ve 37 0.5 mM FUN1 ile 30 ° C min 9 Ca BChip kuluçkaya leke. </li><li> Yıkayın her dunk 1-3 dakika PBS Ca BChip 3-5 kez smaç tarafından kapalı leke ve bir azot akımı kullanarak Ca BChip kurulayın. 380 PMT kazancı ile 532 nm dalga boyunda bir mikroarray tarayıcı (GenePix 4100A, Axon Instruments, CA) kullanılarak floresans yoğunluğu okuyun. </li><li> Pozitif kontrol (ilaç) ve% 100 ve% 0 ölü (çamaşır suyu ile tedavi) biyofilm lekelerin floresans şiddeti, sırasıyla ayarlayın. </li><li> Aşağıdaki denklem kullanılarak kontrol lekelerin ortalama göreli floresans yoğunluğunu (F) &#39;in redüksiyon oranı ile inhibisyonunu belirleme </li></ol><img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/3845/3845eq2.jpg" /> F, F max ve F o çiğ floresan uyuşturucu tedavi yoğunluk, hiçbir ilaç kontrolü ve çamaşır suyu ile tedavi edilen noktalar, sırasıyla nerede. Tarayıcı ayarlarını sırasıyla F max ve 30000 ve 4000 RFU F o, elde etmek ayarlandı. <ol start="9"><li> GraphPad Prism Software (La Jolla, CA) kullanılarak değişken eğimi Tepesi denklemi takılması ile% 50 inhibitör konsantrasyonu veya IC50 hesaplamak. </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar 48 oluşan bir temsilci Ca BChip, × C nano-biyofilmlerin 16 dizi albicans, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Aydınlık alan mikroskobu nano-biyofilm genel bir mimari özellik gösterir. Mantar hifleri matris içinde gömülü olduğu biyofilm göstermektedir taramalı elektron mikroskobik görüntüleriçapı yaklaşık 2 um ile 100 nm olan elyafları kolajen, sırasıyla. FUN1 lekeli mikroarray tarayıcı görüntüleri fungal biyofilm karakteristik maya ve hifal formlar, göstermektedir. FUN1 lekeli biyofilmlerin 2D ve 3D-konfokal floresans görüntüleri dışı matriks (tarafından da üretilen exopolymeric malzeme kapsülleme malzemesi ve büyük ihtimalle de kollajen oluşmaktadır içinde serpiştirilmiş metabolik olarak aktif hücre bölgeleri ile, mekansal heterojen olması görülebilir metabolik boya ile boyanan değildir biyofilm hücreleri). Biyofilm kalınlığı yaklaşık 50 mikron olarak tahmin edilmiştir. Ca BChip iki ilaç, flukonazol ve amfoterisin B antifungal duyarlılık tahmin etmek için kullanıldı ve sonuçları Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Endüstri standardı 96-plaka deneyleri yayınlanan raporlar ile uyumlu olarak, biyofilm flukonazol 10 ve hesaplanan IC 50 dayanıklı<html> amfoterisin B 0.3 mg / mL 11&#39;dir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3845/3845fig1.jpg" /> Ca BChip imalatı için Şekil 1. Akış çizelgesi. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3845/3845fig2.jpg" /> Şekil 2. Baskılı yüksek thoughput Ca BChip, bir resmi bir robot microarrayer kullanarak ve PS-MA-kaplı slaytlar üzerinde 768 lekeler içeren. Her yarım küre spot çapı yaklaşık 700 mikron ve noktalar arasında 1.2 mm ayrılması ile, hacmi 50 nL olduğunu. Ayrıca (saat yönünde) gösterilen ışık mikroskobu, mikroarray tarayıcı, 2D ve 3D-floresan mikroskobu ve Ca BChip üzerinde bireysel biyofilmlerin elektron mikroskobu görüntüleri taramak vardır. 25.000 x yüksek büyütmede SEM rakam genişliği 2 um hifal filament gösterir. Şekil 3 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3845/3845fig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3. Ca BChip kullanarak (A) flukonazol ve (B) amfoterisin B için IC50 değerleri antifungal duyarlılık testi ve kararlılık Sonuçları. Amfoterisin B-arıtılmış biyofilmlerin floresans mikroskobu görüntüleri (C) &#39;de gösterilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart hata 10 içeren iki ayrı yongaları için ortalama olarak her bir durum için çoğaltır.

<ol><li>Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+bloodstream+infections+in+United+States+hospitals%3A+a+three-year+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis.</a> Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).</li>
<li>Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+multidrug+efflux+pumps+in+relation+to+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms.</a> J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).</li>
<li>Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+High-Throughput+Candida+albicans+Biofilm+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip.</a> PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).</li>
<li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Iberoam.+Micol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li>
<li>Pierce, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+reproducible+96-well+plate-based+method+for+the+formation+of+fungal+biofilms+and+its+application+to+antifungal+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing.</a> Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).</li>
<li>Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cellular+microarray+for+high-throughput+toxicology+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).</li>
<li>Meyerhofer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+resist+films+produced+by+spinning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Characteristics of resist films produced by spinning.</a> Journal of Applied Physics. 49, (1978).</li>
<li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).</li>
<li>Chandra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+the+fungal+pathogen+Candida+albicans%3A+Development%2C+architecture%2C+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance.</a> Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).</li>
<li>Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+biofilms+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Fungal biofilms and drug resistance.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).</li>
<li>Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+activity+of+amphotericin+B%2C+caspofungin+and+posaconazole+on+Candida+albicans+biofilms+in+intermediate+and+mature+development+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases.</a> Mycoses. 53, 208-214 (2010).</li>
</ol>

Jose L. Lopez-Ribot ve antifungal ajanlar geliştiriyor MicrobeHTS Technologies, Inc, Anand K. Ramasubramanian kendi öz. MicrobeHTS Technologies, Inc bu çalışmalar için mali destek sağladı.

Biz Candida albicans biyofilmlerin nanoliter ciltten oluşan hücre tabanlı yüksek yoğunluklu mikroarray, Ca BChip geliştirdik. Mikroarray olmayan yayılan, hemisferik 3D jel için gerekli hidrofobluğu sağlarken kollajen jel lekelerin sağlam eki için izin modifiye cam malzeme üzerine basılmıştır. A tek bir Ca BChip yaklaşık sekiz 96-kuyucuklu plaklar yerini alabilir ve birkaç yongaları aynı anda basılır ve işlenebilir. Çip, nano ölçekli kültürler kullanır kolay ve hızlı bir şekilde kullanılmasını ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 440140 </td></tr><tr><td> Polistiren-Co-maleyik anhidrid (PS-MA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 426946 </td></tr><tr><td> Cam mikroskopi slaytlar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-549-3 </td></tr><tr><td> Fare kuyruk kolajeni tip I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> Robotik Microarrayer </td><td> Omnigrid Micro </td><td> MICROSYS4000/4100A </td></tr><tr><td> Mikroarray Tarayıcı </td><td> Genepix Kişisel 4100A </td><td> GENEPIX4100A </td></tr><tr><td> Hibridizasyon Kaset </td><td> ArrayIt Şirketi </td><td> AHCXD </td></tr><tr><td> FUN1 [2-klorro-4-(2,3-dihidro-3-metil-(benzo -1,3-tiyazol-2-il)-metilliden)-1-fenil quinoliniumiodide] </td><td> Invitrogen Corp </td><td> F-7030 </td></tr><tr><td> Flukonazol </td><td> Sicor Pharmaceuticals, Inc </td><td> J02AC01 </td></tr><tr><td> Amfoterisin B </td><td> Sigma </td><td> A2411 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> Mediatech, Inc </td><td> 50-020-PC </td></tr><tr><td> Seramik İpucu 190 mikron orifis </td><td> Digilab </td><td> 60020441-00 </td></tr><tr><td> GraphPad Prism Yazılımı </td><td> GraphPad Software, Inc </td><td></td></tr><tr><td> Genepix Pro V4.1 </td><td> Molecular Devices </td><td></td></tr></tbody></table>

yüksek verim antifungal İlaç tarama candida albicans biyofilm chip (ca bchip)

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans şu anda ABD hastanelerinde 1 dördüncü en sık görülen nozokomiyal kan dolaşımı enfeksiyonu temsil kandidiazis ana etyolojik ajan kalır. Bu fırsatçı enfeksiyonlar tehlikeye bireylerin sayısının artmasıyla için büyüyen bir tehdit ve kabul edilemez yüksek mortalite oranları taşırlar. Bu en sık kullanılan antifungal ajanlara karşı direncin ortaya çıkmasına da antifungal ilaçların sınırlı cephaneliği nedeniyle kısmen, ama. Ileri tedavi komplike kandidiyazis tezahürleri çoğunluğu biyofilmlerin oluşumu ile ilişkili olduğu bir gerçektir ve bu biyofilm içindeki hücrelerin klinik olarak en kullanılan antifungal ajanlar 2 direnç seviyelerinin artmasına göstermektedir. Burada C. oluşan bir yüksek yoğunluklu mikroarray geliştirilmesi tarif Biz Ca BChip 3 adında var albicans nano-biyofilmlerin. Kısaca, bir robot microarrayer t kullanılırC. o baskı maya hücreleri sağlam bir zemin üzerine albicans. Baskı sırasında, maya hücreleri gibi nL 50 kadar düşük ve uygun bir kaplama ile birlikte bir cam zemin üzerinde immobilize bir birimi kullanılarak, üç boyutlu bir matris içine alınır. İlk baskıdan sonra, slaytlar biyofilm geliştirilmesi için izin vermek için 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Bu dönemde noktalar olgun C ile ilişkili tipik yapısal ve fenotipik özellikleri göstermeyen tam gelişmiş &quot;nano-biyofilm&quot; içine büyümek albicans biyofilm (yani morfolojik karmaşıklığı, üç boyutlu mimari ve ilaç direnci) 4. Genel olarak, Ca BChip ~ 750 eşdeğeri ve mekansal farklı biyofilm oluşur; birden fazla fiş baskılı ve aynı anda işlenebilir olduğu ek avantaj. Hücre canlılığı FUN1 metabolik floresan yoğunluğu mikroarray tarayıcı kullanarak lekeyi ölçerek tahmin edilmektedir. Bu mantar çip ideal u için uygundurantifungal ilaç keşfi için gerçek yüksek verimlilik tarama se. Mevcut standartlar (yani biyofilm 5 96-mikrotiter plate modeli) ile karşılaştırıldığında, fungal biyofilm çip ana avantajları otomasyon, minyatür, miktarı ve reaktifler ve analizler zaman maliyet tasarrufu, hem de işçiliğinin ortadan kaldırılmasına olan yoğun adımları. Biz çip önemli antifungal ilaç keşfi sürecini hızlandırmak inanıyorum.

Biz 3D nano-biyofilm oluşan yüksek yoğunluklu mikroarray platformu geliştirdi<em&gt; C. albicans</em&gt; Denir<em&gt; Ca</em&gt; BChip. Ilaç duyarlılık profili bir test<em&gt; Ca</em&gt; BChip mantar çip ideal antifungal ilaçların gerçek yüksek verimli görüntüleme için uygundur düşündüren, geleneksel 96-plaka modeli ile karşılaştırılabilir.

Yüksek verim Antifungal İlaç Tarama Candida albicans Biyofilm Chip (Ca BChip)

*Candida albicans*, günümüzde en yaygın dördüncü hastane kaynaklı kan dolaşımı enfeksiyonunu temsil eden kandidiyazislerin temel etiyolojik ajanı olmaya devam etmektedir...

Bu prosedürün genel amacı, antifungal ilaç keşfi için mikroarray tabanlı, yüksek kapasiteli bir biyofilm tarama yöntemi geliştirmektir. Bu işlem, öncelikle mikroskop cam lamlarının yüzeyinin kimyasal olarak modifiye edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, maya hücreleri bir kolajen matris içine kapsüllenir.Ardından, robotik bir mikro dizi kullanılarak bir candida albicans biyofilm çipi veya cab çipi hazırlanır. Son olarak, cab çipi kullanılarak ilaç duyarlılığı tahmin edilir. Nihayetinde, bir mikro dizi tarayıcısı kullanılarak gerçekleştirilen canlılık testi, bir cab çipi üzerinde oluşan nano biyofilmlere karşı antifungal ilaçların duyarlılık profilini gösterir.Bu mikro-dizi tabanlı tekniğin, endüstri standardı olan 96 kuyucuklu plaka gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, gerçekten yüksek çıktılı olmasıdır. Hızlı ve sağlamdır, daha küçük bir çalışma hacmi kullanır ve zaman kazandırır. Fonksiyonelleştirilmiş lamları hazırlamak için, öncelikle mikroskop lamlarını çıkarılabilir bir lam rafına yerleştirerek başlayın. Lamları, %99'luk histolojik sınıf etanol içeren bir boyama kabına daldırarak iki kez yıkayın.Ardından, koruyucu gözlük ve kimyasallara dayanıklı eldivenler takılıyke

candida-albicans-biofilm-chip-cabchip-for-high-throughput-antifungal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu video laboratuarımızda rutin tripsin tonlar insan embriyonik kök hücre hatları geçişleri nasıl göstermektedir.

Tripsin ile Pasajlanması tonlar İnsan Embriyonik Kök Hücre hatları

Biz oluşumu için basit, hızlı ve sağlam bir bir yöntem...

İzleme Oluşumu ve Antifungal Duyarlılık Testi için 96 Şey microtiter Levha tabanlı Yöntemi Candida albicans Biyofilmler

Bu video, Candida albicans'ın deri altı dokuda biyofilm oluşumunu incelemek için bir in vivo fare modelinin geliştirilmesini göstermektedir. Deney, Candida ile enfekte olmuş cihazların biyofilm gelişimi için hayvanın sırt bölgesine implante edilmesini içeriyor.

Candida albicans Bir İn Vivo Fare Modelinde Biyofilm Oluşumu

Bir fare deri altı modelinde Candida albicans biyofilm gelişiminin deneysel bir prosedürünü sunuyoruz. Mantar biyofilmleri, koloni oluşturan birimlerin sayısının belirlenmesi ve üretilen ışık miktarının canlı hücre sayısına karşılık geldiği invaziv olmayan bir biyolüminesans görüntüleme ile ölçüldü.

Biyoparlaklık Görüntüleme Ardından Fare Subkutan Modeli Tıbben-ilgili yabancı Organları Candida albicans Biyofilm Geliştirme

Bu protokol ana bilgisayar fizyolojik koşullar altında Candida albicans biyofilm oluşumu görselleştirmek için özelleştirilebilir otomatik mikrosıvısal aygıt kullanımını açıklar.

Görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumu

Biz derleme işlemi, tarif ve gerçek zamanlı akış iken altında görüntü mantar biyofilm oluşumu için bir akış cihazları temizlik tasarlanmış. Biz de sağlamak ve elde edilen görüntülerde kullanılmak üzere sayısal algoritmalar tartışıyorlar.

Gerçek zamanlı görüntüleme ve miktar iki aşamalı dolaşım akış sistemi kullanarak mantar biyofilm gelişimi

Burada, Candida albicans biyofilm büyüme üzerine kırmızı ışık uygulama sonucu değerlendirmek için bir protokol mevcut. 635 nm dalga boyu ve enerji yoğunluğu 87.6 J·cm-2 , tutarlı olmayan kırmızı ışık aygıtla Candida albicans biyofilmler 48 h için büyüme boyunca uygulandı.

Kırmızı ışık düzenlemek Candida albicans biyofilm büyüme ile günlük fototerapi

Candida albicans biyofilmlerinin iç özelliklerini görüntülemek ve ölçmek için, kırılma indisi eşleştirmesi ile açıklığa kavuşturulan sabit bozulmamış numuneler hazırlıyoruz. Daha sonra, optik kesit mikroskopisi biyofilmin tam kalınlığı na rağmen üç boyutlu görüntü verilerini elde etmek için kullanılabilir.

Aydınlatma ve Görüntüleme Candida albicans Biyofilmler

Bu protokol, peptitlerin ve küçük moleküllü antifungal ajanlar gibi diğer bileşiklerin Candida albicans'a karşı antifungal aktivitesi hakkında nicel veriler elde etmek için bir yöntemi açıklar. Büyüme inhibisyonunu ölçmek için koloni oluşturan birimleri saymak yerine optik yoğunluk kullanımı, zamandan ve kaynaklardan tasarruf sağlar.

Peptitlerin Candida albicans'a Karşı Antifungal Aktivitesinin Ölçülmesi

Antikorların C. tropicalis tarafından oluşturulan biyofilmler üzerindeki etkilerini incelemek için 2,3-bis (2-metoksi-4-nitro-5-sülfofenil)-5-karboksanil-2H-tetrazolyum (XTT) indirgeme testi kullanan 96 kuyucuklu mikrotitrek plaka bazlı bir protokol burada açıklanmıştır. Bu in vitro protokol, potansiyel yeni antifungal bileşiklerin biyofilmlerdeki Candida türü hücrelerinin metabolik aktivitesi üzerindeki etkisini kontrol etmek için kullanılabilir.

Antikorların Candida tropicalis Biyofilmleri Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek için Çözünür Tetrazolyum Bazlı İndirgeme Testi

Kateter üzerinde biyofilmin oluştuğu ve C.albicans ile konakçı arasındaki etkileşimin klinik CRI ile iyi korelasyon gösterdiği C.albicans ile ilişkili kateterle ilişkili enfeksiyonun (CRI) bir fare modelini oluşturduk. Bu model, C.albicans biyofilmle ilişkili CRI için tarama tedavilerine yardımcı olarak klinik dönüşüm için bir temel oluşturur.

Farede Kateterle İlişkili Candida albicans Enfeksiyon Modeli

Keşfedin, Candida albicans biyofilm chip (Ca BChip) kullanarak yüksek verimli antifungal ilaç tarama yöntemini. Bu mikrodizi platformu, geleneksel yöntemlerle karşılaştırılabilir ilaç duyarlılık profilleri sunar.

Yüksek verim Antifungal İlaç Tarama Candida albicans Biyofilm Chip (Ca BChip)

Daha fazla video keşfet