YFP ifade Temizlendi Fare Beyin Multiphoton Mikroskopi

Fikse edilmiş dokuların çok foton mikroskopisi normalde sadece birkaç yüz mikronluk sığ penetrasyon derinlikleriyle sınırlıdır. Yakın zamanda, benzo alkol ve benzoyl benzoat çözeltisi ile optik berraklaştırma kullanarak, fikse edilmiş fare organlarında birkaç milimetre derinliğe kadar ulaşan ilk çok foton mikroskopisi uygulamasını gerçekleştirdiğimizi gösterdik. İlk gösterimimizde, teknikle dokunun intrinsik floresansı görüntülenmiştir.

Ancak, GFP gibi floresan proteinler eksprese eden dokularda optik berraklaştırma yöntemlerini kullanmaya yönelik ilgi artmaktadır. Burada, uyluk tarafından eksprese edilen sarı floresan proteinin floresansını koruyan benzo alkol çözeltisinin aynısı ile berraklaştırılmış beyin dokusunun çok fotonlu mikroskobisi için bir protokol sunuyoruz. Fare beynindeki bir promotör; çok fotonlu mikroskopi kullanılarak gerçekleştirilen yüksek çözünürlüklü bütün fare organı görüntülemesi, görüntüleme öncesinde organın optik olarak berraklaştırılmasıyla mümkün hale gelmektedir. Berraklaştırma yapılmadan Çok fotonlu.

Beyin görüntüleme, su ile beyin dokusunu oluşturan proteinlerin kırılma indisleri arasındaki farkların yarattığı yoğun ışık saçılması etkileri nedeniyle, doku yüzeyinin 300 mikron altına kadar sınırlıdır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için organyadsızlaştırılır ve suyun yerine dokuyu oluşturan proteinlerle benzer kırılma indisine sahip bir sıvı konur. Bu optik berraklaştırma işlemi, ışık saçılmasını büyük ölçüde azaltarak doku yüzeyinin daha derinlerinde daha iyi görüntüleme yapılmasına yardımcı olur.

Batta ve ark. tarafından sağlanan görüntüler, bu tekniğin içsel floresans ve ikinci harmonik üretimi kullanılarak farklı fare organlarının histolojisini görüntülemek için nasıl uygulanabileceğini göstermektedir. Bu ilk görüntü, doku yüzeyinin 1,4 milimetre altından alınmış fare testisidir. Çok fotonlu mikroskobinin yüksek çözünürlük özelliği, yakınlaştırma yapmamıza ve seminifer tübüllerde oluşan bireysel sperm hücrelerini net bir şekilde görmemize olanak tanır.

En sağda görüldüğü üzere, doku yüzeyinin 1,4 milimetre altından alınan fare akciğerine ait bir görüntü sunuyoruz. Bu görüntü; elastin bileşenlerinin kırmızıyla, kollajenin ise yeşille etiketlendiği iki kanallı multifoton görüntülemenin bir gösterimidir ve yakınlaştırıldığında bireysel lifler kolayca ayırt edilebilmektedir. Son olarak, doku yüzeyinin 850 mikron altından alınan fare beyninin iç bölgelerine ait yüksek çözünürlüklü görüntüler gösteriyoruz. Beynin neokorteks ve hipokampus bölgeleri yakınlaştırıldığında, tekil astrositler ve nöron hücre gövdeleri net bir şekilde görülebilmektedir.

Buna rağmen, YFP gibi floresan proteinler içerebilen optik olarak berraklaştırılmış organlarda, badra'nın optik berraklaştırma protokolü bu floresan proteinlerin floresan sinyalini hiç korumamaktadır. Burada sunulan protokol, beyni etanol dereceli bir seri ileye kurutup, BAB olarak da bilinen benzo alkol benzoatın bir ila iki çözeltisiyle berraklaştırarak YFP ve nöronların floresan sinyalini korurken fare beyninin tüm organ optik berraklaştırmasını ve görüntülemesini gerçekleştirmenin yeni bir yoludur. Çok fotonlu görüntüleme için, YFP fareleri önce tartılır ve ardından ketamin xylazine'in intraperitonal enjeksiyonu ile anesteziye alınır.

Cerrahi işleme geçmeden önce anestezi düzleminin onaylanması gerekir. Hayvanın, parmak veya kuyrukten sıkıştırma uygulamasına tepki verip vermediği her beş dakikada bir kontrol edilmelidir. Hayvan tepki verirse, ek doz ketamine xylazine uygulanması gerekir.

Anestezi uygulandıktan sonra, farelerin göğüs bölgesi cerrahi müdahale için açık olacak şekilde sırtüstü pozisyonda kalmaları için her bir ekstremite laboratuvar bandı ile cerrahi yatağa sabitlenir. İşleme başlamak için, kılıç şeklindeki çıkıntının (xiphoid process) altından bir insizyon yapılır; kesim sırasında deri makas ve cımbız yardımıyla geri çekilerek göğüs kafesinin tabanı boyunca bir kesi oluşturulur. Ardından, farenin sternumunun her iki yanına iki kesi yapılarak bir doku flebi oluşturulur ve kalp açıkta kalacak şekilde bu flep bir hemostat ile göğüs boşluğundan uzak tutulur. Sonrasında, kalbin sol ventrikülüne 23 gauge bir iğne yerleştirilir ve kanın tahliye edilmesini sağlamak için sağ atriumun kas duvarında küçük bir insizyon yapılır. Sağ atrium kesildikten hemen sonra, sağ atriumdan artık kan gelmeyene kadar 4 °C fosfat tamponlu salin ile perfüzyona başlanır.

Perfüzyon sırasında peristaltik bir pompa kullanılır ve sıvı, iğne ucundan 1.5 ila iki inç uzağa püskürtecek bir pompalama gücüne ayarlanır. Tüm kan boşaltıldıktan sonra, farenin vücudu belirgin şekilde katılaşıp sertleşene kadar perfüzyon ortamı, dört °C'deki %4'lük paraformaldehit çözeltisi ile değiştirilir. Perfüzyondan sonra fare cerrahi masadan alınır ve pens ile iris makası kullanılarak beynin çıkarılması işlemine başlamak için kafası kesilir.

Kafatası, arka kısımdan başlayarak öne doğru küçük bölümler halinde çıkarılır. Makasla kafatası boyunca her iki ila dört milimetrede bir küçük kesikler atılırken, pens yardımıyla kemik beyinden küçük parçalar halinde dikkatlice uzaklaştırılır; bu işlem beynin tüm üst yüzeyi açığa çıkana kadar devam eder. Ardından beyin, cerrahi bir spatula kullanılarak kafatasından çıkarılır ve altı saat boyunca fikse edilmek üzere %4 paraformaldehit içeren bir cam şişeye yerleştirilir.

Bu gösterimde öncelikle YFP eksprese eden fare beyninin görüntülenmesine odaklansak da, bu prosedürün berraklaştırma yeteneklerini en iyi şekilde göstermek için bir fareyi, arka bacağı ve ince bağırsak kesitini de optik olarak berraklaştıracağız. Sabitleme işleminden sonra, beyin ve diğer dokular PBS ile iki kez yıkanır. Ardından doku örnekleri, oda sıcaklığında %50, %70, %90 ve %100 konsantrasyonlardaki bir dizi etanol inkübasyonu ileydehidre edilir.

Her bir inkübasyon iki saat sürer ve ardından fikslemiş dokudan suyu etkili bir şekilde uzaklaştırmak için 12 saatlik ikinci bir %100 etanol inkübasyonu gerçekleştirilir. Dehidrasyon işleminden sonra, son %100 etanol çözeltisi dökülür ve doku örnekleri, %100 BAB berraklaştırma çözeltisine daldırılmadan önce iki saat boyunca bir bir oranında etanol ve BAB çözeltisi içinde bekletilir.

BAB içerisine alındıktan sonra, beyin ve diğer doku örnekleri dört ila beş saat içinde belirgin şekilde şeffaflaşacaktır. Burada, optik berraklaştırma işleminin ilk altı saatini gösteren bir hızlandırılmış video sunuyoruz. Atlama noktası, etanol ve BAB'den oluşan bire bir çözeltinin %100 BAB çözeltisi ile değiştirildiği anı işaret etmektedir.

Altı saatin sonunda, tüm organlar şeffaflaşma belirtileri gösterir; örneğin, en iyi berraklaştırma sonuçları için farenin arka bacağındaki kemik artık net bir şekilde görünür durumdadır. Beyin, parlak ışıktan korunarak oda sıcaklığında altı gün boyunca berraklaşmaya bırakılmalıdır. Beyin berraklaştığında ve görüntülemeye hazır olduğunda, Sano akrilik veya hızlı yapıştırıcı kullanılarak Petri kabının altına sabitlenir.

Yapıştırıcı kuruduktan sonra beyin BAB içine daldırılır ve görüntüleme için Petri kabı objektifin altına yerleştirilir. Görüntüleme için, 710 ila 990 nanometre arasında ayarlanabilir bir uyarım dalga boyuna sahip olan MI tie titanyum safir lazer içeren bir çokfotonlu mikroskop kullanıyoruz. YFP sinyalleri oluşturmak için kullandığımız uyarım dalga boyu 886 nanometredir.

Yansıtıcı floresan sinyali, ardından geniş görüş alanlı görüntülemeye olanak tanıyan NIK icon beş x objektif kullanılarak yakalanır. Yansıtıcı floresan sinyali, 5 35 50 bant geçiren filtre kullanılarak filtrelenir ve yüksek kuantum verimliliğine sahip bir folder. Multiplier two OMA Matsu ile toplanır. Yüksek çözünürlüklü YFP görüntüleri oluşturmak için görüntüler, hat başına iki milisaniye tarama hızıyla, 2048 x 2048 piksel çözünürlükte scan image yazılımı kullanılarak işlenir.

Görüntüleme tamamlandığında, beyin P two kabından çıkarılır, BAB içinde saklanır ve gelecek görüntülemeler için ışıktan korunur. Burada gösterilen temsili görüntüler ve videolar, optik berraklaştırma sayesinde mümkün olan yüksek çözünürlüklü çok fotonlu görüntüleme yeteneğini kanıtlamaktadır. Tüm beyin görüntüleme, hipokampüs ve neokorteksin farklı katmanlarındaki YFP etiketli nöronların, doku yüzeyinin iki milimetre derinliğine kadar net bir şekilde görünür olmasını sağlar.

Burada, hipokampüsün farklı anatomik katmanlarını ortaya çıkarmak için beynin 0,8 ila 2 mm derinliğinden alınan, tüm ağız bölgesinin 1,2 milimetrelik görüntü yığınını gösteren bir video sunuyoruz. Aşağıdaki, 2 mm derinliğindeki görüntü yığınından alınan ve hipokampüsün farklı katmanlarının etiketlendiği, Bergman olarak adlandırılan 1,94 mm'lik koronal kesitin temsili bir görüntüsüdür. Neokortekse yakınlaşıldığında, neokorteks katman beş piramidal nöronlarının bireysel aksonları ve nöron hücre gövdeleri, doku yüzeyinin 1,02 mm altına kadar net bir şekilde ayırt edilebilmektedir.

Burada, doku yüzeyinin 700 ile 1020 mikron altından alınan beşinci katman nöronlarının görüntü yığınını gösteriyoruz. Aşağıdaki, bu yığından beyinde 774 mikron derinlikten alınmış temsilci bir görüntüdür. Aynı görüntü yığını kullanılarak, Image J yazılımı ile nöron bölgesinin 3 boyutlu bir rekonstrüksiyonu yapılmıştır.

Çok bot mikroskobisinin yüksek çözünürlük yeteneği, tekil nöronların tamamının görüntülerini sunmamıza da olanak tanır. Burada, D genetik süreçlerinin açıkça görüldüğü neokortekse ait bir beşinci katman nöronunun rekonstrüksiyonunu gösteriyoruz. Bu, YFP eksprese eden tüm fare beyninde optik berraklaştırma sunumumuzu sonlandırmaktadır.

Bu tekniğin uygulanması nispeten basittir ve gösterdiğimiz üzere, fare beyninin birçok farklı bölgesinin ve yapısının görüntülenmesi ve görüntülenmesi için kullanılabilir. İzlediğiniz için teşekkürler ve başarılar dileriz.