YFP ifade Temizlendi Fare Beyin Multiphoton Mikroskopi

Tüm fare organların Multiphoton mikroskobu optik görüntüleme öncesi organı temizleyerek mümkün değil, tüm protokolleri floresan proteinlerin floresan sinyal korumak. Etanol bazlı dehidratasyon ve benzil alkol ile optik temizleme yöntemi: benzil benzoat takas, biz bütün fare beyin YFP ifade yüksek çözünürlüklü multiphoton görüntüleri göstermek.

Sabit dokunun çoklu foton mikroskobu normalde sadece birkaç yüz mikronluk sığ penetrasyon derinlikleri ile sınırlıdır. Yakın zamanda, benzo alkol ve benzoil benzoat çözeltisi ile optik temizleme kullanarak sabit fare organlarına birkaç milimetre derinliğe kadar multifoton mikroskobunun ilk kullanımını gösterdik. İlk gösterimizde, teknik intrinsik doku floresansını görüntüledi.

Bununla birlikte, GFP gibi doku eksprese eden floresan proteinleri ile optik temizleme yöntemlerinin kullanılmasına artan bir ilgi vardır. Burada, uyluk tarafından eksprese edilen sarı floresan proteinin floresansını koruyan aynı benzo alkol çözeltisi ile temizlenmiş beyin dokusunun multifoton mikroskobu için bir protokol sunuyoruz. Fare beyninde bir promotör Multifoton mikroskobu kullanılarak yüksek çözünürlüklü tüm fare organı görüntüleme, görüntülemeden önce organın optik olarak temizlenmesiyle mümkün olur. Çoklu foton.

Beynin görüntülemesi, suyun ve beyin dokusunu oluşturan proteinlerin kırılma indislerindeki farklılıkların yarattığı belirgin saçılma etkileri nedeniyle doku yüzeyinin altında 300 mikron ile sınırlıdır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için organ susuz bırakılır ve su, dokuyu oluşturan proteinlerle benzer bir kırılma indisine sahip bir sıvı ile değiştirilir. Bu optik temizleme işlemi, doku yüzeyinin daha altında daha iyi görüntüleme sağlamak için ışık saçılımını büyük ölçüde azaltmaya yardımcı olur.

Batta ve arkadaşlarından alınan görüntüler, bu tekniğin, içsel floresan ve ikinci harmonik nesil kullanarak farklı fare organlarının histolojisini görüntülemek için nasıl uygulanabileceğini göstermektedir. Bu ilk görüntü, doku yüzeyinin 1,4 milimetre altında alınan fare testisine aittir. Multifoton mikroskobunun yüksek çözünürlüklü özelliği, seminifer tübülerlerde oluşan tek tek sperm hücrelerini yakınlaştırmamızı ve net bir şekilde görmemizi sağlar.

Burada en sağda görüldüğü gibi, doku yüzeyinin 1.4 milimetre altında alınan fare akciğerinin bir görüntüsünü gösteriyoruz. Bu görüntü, elastin bileşenlerinin kırmızı ile etiketlendiği, kollajenin yeşil ile etiketlendiği, tek tek olilerin yakınlaştırılmasının kolayca ayırt edilebildiği iki kanallı multifoton görüntülemenin bir gösterimidir. Son olarak, doku yüzeyinin 850 mikron altında yer alan fare beyninin iç bölgelerinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini gösteriyoruz Beynin neokorteks ve hipokampusunu yakınlaştırarak, bireysel astrositler ve nöron hücre gövdeleri net bir şekilde görülebilir.

Bununla birlikte, YFP gibi floresan proteinleri içerebilen optik olarak temizlenmiş organlar, badra'nın optik temizleme protokolü, bu floresan proteinlerin floresan sinyalini hiç korumaz. Burada sunulan protokol, YFP'nin floresan sinyalini korurken ve nöronların etanol dereceli bir seri kullanarak beyni dehidre ederken ve bir ila iki benzo alkol benzoat çözeltisi ile temizlerken, fare burkulmasının tüm organ optik temizliğini ve görüntülemesini gerçekleştirmenin yeni bir yoludur, aksi takdirde BAB olarak bilinir, floresan proteinlere verilen hasarı azalttığı ve floresan sinyallerini koruduğu bulunmuştur. Çoklu foton görüntüleme için, YFP fareleri önce tartılır ve daha sonra intraperitoneal ketamin ksilazin enjeksiyonu ile anestezi altına alınır.

Ameliyata devam etmeden önce bir cerrahi anestezi plakası onaylanmalıdır. Hayvan, sert bir ayak parmağına veya kuyruk tutamına tepki verip vermediğini görmek için her beş dakikada bir kontrol edilmelidir. Hayvan reaksiyona girerse, ek bir S dozu ketamin ksilazin gereklidir.

Anestezi uygulandıktan sonra, fareler laboratuvar bandı kullanarak her bir uzvu bir cerrahi yatağa yapıştırarak kalıyorlar, böylece fare sırtüstü pozisyonda oluyor ve göğsünü ameliyat için açığa çıkarıyor Başlamak için, göğüs kafesinin tabanı boyunca bir kesi yapmak için ksifoid işleminin altında bir kesi yapılır Makas ve cımbız kullanarak kesi yapılırken cildi geri çekmek için, Daha sonra, kalbi açıkta bırakmak için bir hemostat kullanılarak göğüs boşluğundan uzak tutulan bir doku flebi oluşturmak için fare sternumunun her iki yanında iki kesi yapılır. Daha sonra, kalbin sol ventrikülüne 23 gauge bir iğne yerleştirilir ve kanın kaçmasına izin vermek için sağ atriyumun kas duvarında küçük bir kesi yapılır. Sağ atriyum kesildikten hemen sonra, sağ atriyumdan daha fazla kan akmayana kadar dört santigrat derece fosfat tamponlu salin ile perfüzyona başlanır.

Perfüzyon sırasında, bir epistolik pompa kullanılır ve sıvıyı iğnenin ucundan 1,5 ila iki inç uzağa atan bir pompalama gücüne ayarlanır. Tüm kan boşaltıldıktan sonra, perfüzyon ortamı, farenin vücudu gözle görülür şekilde sertleşene ve sertleşene kadar dört santigrat derecede% 4'lük bir paraform aldehit çözeltisine geçirilir. Perfüzyondan sonra, fare cerrahi yataktan çıkarılır ve forseps ve iris makası kullanılarak beynin eksizyonuna başlamak için kafası kesilir.

Kafatası, kafatasının arkasından başlayarak ileriye doğru ilerleyen küçük bölümler halinde çıkarılır. Kafatası boyunca makasla her iki ila dört milimetrede bir küçük kesikler yapılırken, forseps kemiği küçük bölümler halinde beyinden dikkatlice çekmek için kullanılır, bu beynin tüm üst yüzeyi açığa çıkana kadar yapılır. Beyin daha sonra cerrahi bir spatula kullanılarak kafatasından çıkarılır ve altı saat boyunca sabitlemek için% 4 paraform aldehitin cam şişesini alacak şekilde yerleştirilir.

Bu gösteri için öncelikle YFP'yi ifade eden fare beyninin görüntülenmesine odaklanırken, bu prosedürün temizleme yeteneklerini en iyi şekilde göstermek için bir fareyi, arka bacağını ve ince bir bağırsağı optik olarak temizleyeceğiz. Post fiksasyondan sonra, beyin ve diğer dokular PBS'de iki kez yıkanır. Doku örnekleri daha sonra oda sıcaklığında %50, %70, %90 ve %100 etanol konsantrasyonlarında bir dizi etanol inkübasyonu ile kurutulur.

Her inkübasyon iki saat sürer ve sonra bir saniye sürer. Suyu sabit dokudan verimli bir şekilde çıkarmak için 12 saatlik %100 etanol inkübasyonu yapılır. Dehidrasyondan sonra, son %100'lük etanol çözeltisi dökülür ve doku örnekleri, %100 BAB temizleme çözeltisine daldırılmadan önce iki saat boyunca bire bir etanol çözeltisine batırılır.

Bab'a girdikten sonra, beyin ve diğer doku örnekleri dört ila beş saat içinde gözle görülür şekilde şeffaf hale gelecektir. Burada, optik temizleme işleminin ilk altı saatinin hızlandırılmış bir videosunu gösteriyoruz. Atlama, etanolün BAB'a bire bir çözeltisinin %100 BAB çözeltisi ile değiştirildiği zamanı işaretler.

Altı saatin sonunda, tüm organlar şeffaflık belirtisi gösterir, örneğin, farenin arka bacağındaki kemik, en iyi temizleme sonuçları için artık açıkça görülebilir. Beyin, parlak ışıktan korunurken oda sıcaklığında altı gün boyunca temizlenmeye bırakılmalıdır. Beyin temizlendikten ve görüntüleme için hazır hale geldikten sonra, Sano akrilik veya süper yapıştırıcı kullanılarak Petri kabınızın altına yapıştırılır.

Yapıştırıcı kuruduktan sonra beyin BAB'da ortaya çıkar ve Petri kabı görüntüleme için hedefin altına yerleştirilir. Görüntüleme için, 710 ila 990 nanometre uyarma dalga boyu arasında ayarlanabilen bir MI bağı titanyum safir lazer içeren bir çoklu foton mikroskobu kullanıyoruz. YFP sinyallerini üretmek için kullandığımız uyarma dalga boyu 886 nanometredir.

Yansıtıcı floresan sinyali daha sonra geniş görüş alanı görüntülemesine olanak tanıyan bir NIK simgesi beş x objektif kullanılarak yakalanır. Yansıtıcı floresan sinyali, 5 35 50 bant geçiren bir filtre kullanılarak filtrelenir ve yüksek kuantum verimliliği klasörü kullanılarak toplanır. OMA'dan çarpan iki, Matsu görüntüleri, yüksek çözünürlüklü YFP görüntüleri oluşturmak için satır başına iki milisaniyelik bir tarama hızı kullanılarak 2048 x 2048 piksel çözünürlükte tarama görüntüsü yazılımı kullanılarak işlenir.

Görüntüleme tamamlandıktan sonra, beyin P two kabından çıkarılır ve BAB'da saklanır ve gelecekteki görüntüleme için ışıktan korunur. Burada gösterilen temsili görüntüler ve videolar, optik temizlemenin mümkün kıldığı yüksek çözünürlüklü çoklu foton görüntüleme yeteneğini göstermektedir. Tüm beyin görüntüleme, hipokampus ve neokorteksin farklı katmanlarındaki YFP etiketli nöronların, doku yüzeyinin iki milimetre altına kadar net bir şekilde görülebilmesini sağlar.

Burada, hipokampusun farklı anatomik katmanlarını ortaya çıkarmak için beynin 0,8 ila iki milimetre içine alınan 1,2 milimetrelik bir tüm ağız burkulması görüntü yığınının videosunu gösteriyoruz. Aşağıda, hipokampusun farklı katmanlarının etiketlendiği iki milimetre derinliğindeki görüntüden alınan, Bergman'a çağrılan 1.94 milimetrelik bir koronal bölümün temsili bir görüntüsü yer almaktadır. Neokorteksi yakınlaştırarak, neokorteksin beşinci katman peral nöronlarının bireysel aksonları ve nöron hücre gövdeleri, doku yüzeyinin 1.02 milimetre altına kadar açıkça ayırt edilebilir.

Burada, doku yüzeyinin 700 ila 1020 mikron altında alınan beşinci katman nöronlarının sıkışmış bir görüntüsünü gösteriyoruz. Aşağıdakiler, beyne 774 mikron ile alınan bu yığından temsili bir görüntüdür. Aynı görüntü yığını kullanılarak, Image J yazılımı kullanılarak nöron bölgesinin 3 boyutlu bir rekonstrüksiyonu yapıldı.

Çoklu bot mikroskobunun yüksek çözünürlük yeteneği, tüm bireysel nöronların görüntülerini sunmamıza da olanak tanır. Burada, D genetik süreçlerinin açıkça görülebildiği neokorteksin beşinci katman nöronunun yeniden inşasını gösteriyoruz. Bu, optik temizleme, YFP'yi ifade eden tüm fare burkulması sunumumuzu sonlandırıyor.

Bu tekniği uygulamak nispeten basittir ve gösterdiğimiz gibi, fare burkulmasının birçok farklı bölgesini ve yapısını görüntülemek ve görüntülemek için kullanılabilir. İzlediğiniz için teşekkürler ve iyi şanslar.