Karşı Antibiyotik Etkinlik Test Yapay Balgam Orta Kullanımı

Bu deneyin amacı, tanımlanmış bir yapay balgam ortamı kullanılarak kistik fibrozis akciğerindeki kronik enfeksiyonları temsil eden koşullar altında, pseudomonas Aerogen biyofilmlerine karşı antibiyotiklerin etkinliğini değerlendirmektir. Bakteriyel biyofilmler 24 kuyucuklu mikrotitre plakalarda büyütülür.

Biyofilmler daha sonra antibiyotiklere maruz bırakılır. Ardından, antibiyotikle işlem görmüş kültürler sellülaz kullanılarak parçalanır ve canlı hücreler tarafından maviden pembeye indirgenen metabolik bir boya olan srin ile inkübe edilir. Kuyucukların absorbansının ölçülmesiyle, fizyolojik koşullara yakın şartlar altında antibiyotik duyarlılığını nicelleştirmek için biyofilm hücre minimum inhibitör konsantrasyonu (B-S-M-I-C) belirlenebilir.

Bu tekniğin, planktonik kültüre dayalı minimum inhibitör konsantrasyonlarının belirlenmesi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bakterilerin balgamın tüm bileşenlerini içeren özel bir besiyerinde büyütülerek biyofilm oluşumunun teşvik edilmesidir. Bu biyofilmler antibiyotiklere karşı çok daha dirençlidir. Besiyerini hazırlamak için öncelikle, ilk şişede 250 mililitre steril su içeren iki şişe hazırlayın.

Karıştırarak yavaşça ekleyin ve ardından 250 mililitre steril suyun içine dört gram balık spermi DNA'sı ilave edin. Çözeltiyi oda sıcaklığında karıştırın ve DNA'nın çözünmesini sağlayarak ikinci şişeye aktarın. Yavaşça beş gram porcine stomach tip 2 müsin ekleyin ve karıştırın.

DNA ve müsin çözeltileri hazır olduğunda, sırasıyla 25 mililitre su veya 25 mililitre 0.5 molar potasyum hidroksit içinde çözünmesi gereken L tyrosine ve L cysteine hariç, amino asitleri 100 mililitre steril su içinde çözün. Ardından, 100 mililitre su içerisinde 5.9 miligram DTPA, beş gram sodyum klorür ve 2.2 gram potasyum klorür hazırlayın. Tüm farklı çözeltileri bir litrelik bir şişede birleştirin, ardından beş mililitre yumurta sarısı emülsiyonu ekleyin ve karışımı su ile 850 mililitreye tamamlayın.

Bir molar triss kullanarak pH'ı 6.9'a ayarlayın ve ortamı sterilize etmek için final hacmini su ile bir litreye tamamlayın; ardından bir vacuum marka ME iki diyaframlı vakum pompası ve 45 mm boyunlu, 0.2 µm gözenek boyutuna sahip bir Millipore stereo top filtre ünitesi kullanarak filtreleyin. Filtrasyon işlemi iki güne yayılabilir. A SM ortamı, dört °C'de bir aya kadar saklanabilir.

Gece boyu inkübe edilmiş pseudomona arosa kültürlerini, 0.05 OD değeri elde edecek şekilde LB besiyeri ile seyrelterek başlayın. Ardından, bakterileri bir SM besiyeri plakasında 1/100 oranında tekrar seyreltin; 24 kuyucuklu bir doku kültürü plağının 21 kuyucuğuna, kuyucuk başına 1.8 milliliters seyreltilmiş bakteri kültürü ekleyin. Kalan üç kuyucuğa, boş negatif kontroller olarak hizmet edecek olan aynı hacimde SM besiyeri ekleyin. 24 kuyucuklu plağı biyofilm ile sabitleyin ve biyofilmlerin oluşmasına izin vermek için, büyük anaerobik kavanozlarda campi gen gaz üretim paketleri kullanılarak sağlanabilen mikro aerobik koşullar altına yerleştirin.

Kültürü, 37 °C'de üç gün boyunca 75 RPM'e ayarlanmış bir çalkalayıcıda inkübe edin; üç gün sonra biyofilmler, bakteriyel hücreler içeren jelatinimsi bir kütle şeklinde görünecek ve pipetleme ile dağıtılamayacaktır. Biyofilmler oluştuktan sonra, her kuyucuğa seri dilüsyonla hazırlanmış farklı konsantrasyonlarda 200 µL antibiyotik ekleyin. Test edilecek her ilaç konsantrasyonu için en az dört tekerrür hazırladığınızdan ve negatif kontrol olarak kullanılmak üzere biyofilm içeren dört kuyucuğu işlem görmemiş halde bıraktığınızdan emin olun.

Ardından, antibiyotiklerle inkübasyondan sonra plakları 24 saat daha inkübe edin. Biyofilmleri bozmak için, sitrat tamponunda 100 mg/mL konsantrasyonuna seyreltilmiş sellulazdan kuyuk başına 100 µL kullanın ve plakları aerobik koşullar altında, 37 °C'de, 150 RPM'e ayarlanmış bir çalkalayıcıda bir saat boyunca inkübe edin. Bu inkübasyonun ardından, eğer ortamda hücre kümeleri görülüyorsa, biyofilmleri daha fazla ayrıştırmak için manuel pipetleme yapılabilir.

Ardından, biyofilmlerden salınan hücrelerin canlılığını belirlemek için her kuyucuğa 100 µL rezin ekleyin ve hücreleri bir ila iki saat boyunca inkübe edin. 37 °C'de, yalnızca canlı hücreler mavi zarin boyasını pembe floresan formuna metabolize edebilir. İnkübasyonun ardından numuneleri 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın ve kuyucukların floresansını 540 nm eksitasyon dalga boyu ve 590 nm emisyon dalga boyu kullanarak ölçün.

Bakteriyel canlılığı ve ilaç duyarlılığını nicelleştirmek için öncelikle, boş kontrolün arka plan floresansını diğer kuyucuklardan çıkarın. Ardından, her konsantrasyon için ortalama floresansı, işlem görmemiş kontrollerin ortalama floresansına bölüp 100 ile çarparak inhibisyon yüzdesini hesaplayın. B-S-M-Y-C, metabolik aktivitenin %90 inhibisyonuna neden olan antibiyotik konsantrasyonu olarak tanımlanır; bu elektron mikrograflarında gösterildiği üzere, biyofilmlerde büyüyen hücreler, planktonik kültürlerde büyüyen bakterilerden önemli ölçüde farklılık gösterir.

Özellikle, yeşil renkle gösterilen biyofilmin içindeki hücreleri çevreleyen sarı renkteki büyük miktarlardaki hücre dışı matriks, planktonik kolonilerde görülmemektedir. Ayrıca, bu deneyde biyofilmlerdeki bakteriler tipik olarak antibiyotiklere karşı daha dirençlidir. Mavi renkle gösterilen pseudomonas aerogen planktonik kültürü için tobramisinin minimum inhibisyon konsantrasyonunun yaklaşık olarak 4 µg/mL olduğu belirlenmiştir.

Buna karşılık, kırmızıyla gösterildiği üzere, biyofilmlerdeki bakterilerin %100'ü mililitre başına 512 mikrogram antibiyotiğe kadar hayatta kalmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, tanımlanmış yapay bir balgam ortamında bakterilerin nasıl kültüre edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Ayrıca, kistik fibrozis akciğerine daha gerçekçi bir ortamda bakteriyel büyümeyi engellemek için gereken minimum inhibitör konsantrasyonunu belirlemek amacıyla bir antibiyotik duyarlılık testi gerçekleştirebilmelisiniz.