Emme Pipet Tekniği kullanılarak Olfaktör Reseptör Nöronlar Kaydedilmiş odorant bağlı Cevapları

Bu prosedürün genel amacı, fare koku alma reseptör nöronlarından gelen koku kaynaklı tepkileri kaydetmektir. Bu, önce koku alma epitelinin diseksiyonu ve fare koku alma reseptörü nöronlarının izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, izole edilmiş koku alma reseptörü nöronlarını ters çevrilmiş bir mikroskop üzerine monte edilmiş bir kayıt odasına yerleştirmektir.

Mikro manipülatörler kayıt elektrodunu ve bir çözelti değiştiriciyi tutar. Daha sonra, tanımlanmış bir koku alma reseptörü nöronunu bir emme pipeti elektrodunun ucuna emdirin. Son adım, nöronu koku maddelerine maruz bırakmak için pipeti emilen hücre ucunda olacak şekilde bir çözelti değiştiricinin önüne yerleştirmektir.

Sonuç olarak, koku alma reseptörü nöron fonksiyonunu araştırmak için emme pipeti kayıt yöntemi kullanılır. Bu tekniğin tüm hücre voltaj kelepçesi tekniği gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, hızlı ve hassas çözelti değişiklikleri kullanarak uzun kayıt sürelerine izin vermesidir. Kayıt pipetinin şekli önemli olduğundan ve soket hücrelerini pipetin ucuna sabit bir şekilde yerleştirmeyi öğrenmek zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik

Bu prosedüre, uzun bir konikliğe sahip bir mikro pipet çektirmede UNFI ağıtlı bo silikat cam kılcal damarlı bir mikro pipet çekerek başlayın. Ardından pipeti, dik bir mikroskop üzerine monte edilmiş özel yapım bir mikro pipet tutucusuna aktarın. Mikroskobun göz merceğinde bir kırmızı ve sahneye monte edilmiş hareketli bir elmas bıçak vardır.

Ardından, 20 x objektifin altındaki pipetin ucunu gözlemleyin. Redle'ı kılavuz olarak kullanın. Pipetin 10 mikrometrelik dış çapında özel yapım elmas bıçağı kullanarak pipeti 90 derecelik bir açıyla nazikçe çizin.

Elmas bıçağı uca doğru hareket ettirin. Yavaş yavaş üzerine baskı uygulayın. Pipet ucu, çizildiği noktada temiz bir şekilde kırılmalıdır.

Daha sonra 40 x objektif ateş altında, elektrikle ısıtılan bir filament kullanarak pipetin ucunu beş mikrometre iç çapa kadar parlatın. Tamamlandığında, mikro pipet fare ornlarından gelen akımları kaydetmek için kullanılmaya hazırdır. Bir sonraki adımda, bir fareyi feda edin ve kafasını çıkarın.

Daha sonra kafatasının üzerindeki cildi soyun, ardından kafayı orta hat boyunca ikiye bölün. Ardından, iki Hemi kafasını diseksiyon yapan bir stereo mikroskoba aktarın. Nazal septumu çekin ve koku alma konkalarını çıkarın.

Dokuyu glikoz içeren memeli zil çözeltisi içeren bir Petri kabına yerleştirin. Bundan sonra, koku alma epitelini alttaki kıkırdaktan iki konkadan soyun. Dokuyu 250 mikrolitre zil içeren bir einor tüpüne aktarın.

Daha sonra kalan dokuyu daha sonra kullanmak üzere dört santigrat derecede saklayın. Koku alma epitelini içeren EOR tüpünü orta hızda bir saniye boyunca iki kez kısaca vorteks kullanın. Bu adım, NS'nin epitelden mekanik olarak ayrılmasına yol açar.

Daha sonra, ayrışmış ornları içeren zil çözeltisini mikroskop üzerine monte edilmiş kayıt odasına yerleştirin, bir çift ince forseps kullanarak süspansiyondaki büyük doku parçalarını çıkarın. Zil çözeltisi ile sürekli perfüzyona başlamadan önce ORN'nin 20 dakika oturmasına izin verin ve bu prosedürdeki kayıtlara devam edin, pipeti zil çözeltisi ile doldurun. Pipeti pipet tutucusuna yerleştirin ve tutucuyu yama kelepçesi amplifikatör kafası aşamasına takın.

Ardından, yağ hattını pipet tutucunun yan bağlantı noktasına bağlayın. Ardından pipeti kayıt odasına indirin. Pipet ucunda hafif pozitif bir basınç oluşturmak için yağ haznesinin yüksekliğini düzenleyin.

Bu, hücre kalıntılarının pipetten uzaklaştığını veya pipete doğru hareket ettiğini gözlemleyerek yapılabilir. Pipetin ucunu hücre kalıntıları ile kirletmemeye çalışın. Daha sonra, 20 ila 40 x büyütme kullanarak tipik bipolar morfolojisi ile tanınabilen izole bir ORN için kayıt odasını tarayın.

Ardından kayıt elektrodunu ORN hücre gövdesinin yakınına getirin. Hücre gövdesi pipetin ucuna girecek şekilde yağ haznesine bağlı hava yolunu nazikçe emdirin. Tüm hücre gövdesi emme pipetinin ucuna çekilene kadar dikkatli ve yavaş bir şekilde emme uygulamaya devam edin, dendrit ve kirpikleri banyo solüsyonuna maruz bırakın.

Emme pipetini, yerleşmiş ornları içeren bölümden haznenin kayıt bölümüne taşıyın. Çözelti değişimi için emme pipetini üç namlulu tüpün önüne dikkatlice yerleştirin. Emme pipeti, ORN'nin laminer akışa maruz kalması ve böylece karışım türbülansından kaçınılması için üç namlulu tüpün açıklığına yeterince yakın yerleştirilmelidir Çözelti değişimini sağlamak için, çözelti değişiminin kalitesini ve güvenilirliğini izlemek için çözelti değiştiricinin üç namlulu borusundan akan çözeltinin paralel akışları arasındaki sınırı emme pipetinin ucu boyunca hareket ettirin.

Hücrenin farklı iyonik bileşime sahip çözeltiler arasında hareket ettirilmesiyle uyandırılan bağlantı akımı ölçülebilir. Çözüm değişiminin zaman seyri genellikle yaklaşık 20 milisaniyedir. Koku alma reseptörü nöronu bir koku çözeltisine basıldığında, burada koku uyandıran bir yanıt ortaya çıkabilir.

Bir ORN, kaydın üzerindeki çubukla gösterildiği gibi bir saniye boyunca yüz mikro azı dişi öjenole maruz bırakıldı. Üst panelde, alıcı akımı, alıcı akımını görüntülemek için sıfır ila 50 hertz arasında bir bant genişliğinde filtrelendi Yalnızca alt panel, aksiyon potansiyellerini de görüntülemek için sıfır ila 5.000 hertz arasındaki geniş bant genişliğinde filtrelenmiş aynı kaydı gösterir. İşte bir öjenol duyarlı ORN'nin doz yanıtları: Öjenol, 0.3 mikromolar ila yüz mikromolar arasında değişen konsantrasyonlarda kullanıldı.

Uyaran süresi bir saniyeydi ve izler sıfır ila 50 hertz arasında filtrelendi. Koku konsantrasyonundaki ilerleyici bir artış, daha büyük ve daha hızlı yükselen bir tepkiye yol açtı ve bu da daha yavaş sona erdi. Koku maruziyeti sona erdikten sonra, ORNS, orta koku verici konsantrasyonlarında uzun stimülasyonlar sırasında salınımlı bir yanıt modeli gösterebilir.

Burada, asetofenona duyarlı bir ORN, stimülasyonun başlangıcında hızlı ve geçici bir tepe tepkisinden sonra sekiz saniye boyunca uyarıldı. Bu prosedür denenirken bir dizi daha küçük tekrarlayan yanıt gözlenir. Koku alma reseptör nöronlarını dikkatli bir şekilde kullanmayı ve çok sabırlı olmayı unutmamak önemlidir.

İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.