Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) tarafından Prostat tümörlerinde mikroRNA Algılama

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanarak prostat kanseri ve normal prostat dokusundaki mikro RNA moleküllerinin ekspresyon seviyelerini belirlemektir. Bu işlem, öncelikle prostat dokularından toplam RNA ekstre edilerek gerçekleştirilir. Bu işlem mRNA, mikro RNA ve diğer küçük RNA'ları kapsar.

Ardından, cDNA üretmek için RNA'ya ters transkripsiyon uygulanır. Daha sonra, mikroRNA ekspresyonunu gerçek zamanlı olarak amplifiye etmek ve nicelendirmek için cDNA şablon olarak kullanılarak SYBR Green tabanlı gerçek zamanlı PCR gerçekleştirilir. Kantitatif gerçek zamanlı PCR'a dayanarak çeşitli prostat örneklerindeki mikroRNA'ların göreceli ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilir.

Bu tekniğin diğer yöntemlere göre temel avantajı; yüksek hassasiyet, doğruluk ve tekrarlanabilirlik sunması ile hızlı ve maliyet etkin olmasıdır. mikroRNA ekspresyonu genellikle kanser süreciyle yoğun şekilde ilişkili genlerle korelasyon gösterdiğinden, bu yöntem kanser biyolojisi alanındaki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu nedenle, mikroRNA'ların ekspresyonunu değerlendirmek ve bunun klinik değişkenlerle nasıl bir korelasyon gösterdiğini görmek için QPCR kullanabiliriz.

Bu biyobelirteçler, potansiyel olarak hem tanısal hem de prognostik araçlar olarak kullanılabilir. Prostat kanserini teşhis etmemize yardımcı olabildikleri gibi, hangi prostat kanserlerinin agresif olduğunu belirlememize de yardımcı olabilirler. Ayrıca, bu biyobelirteçlerin terapötik ajanlar olma potansiyeli bulunmaktadır.

Bu yöntem sadece prostat tümör oluşumu hakkında bilgi sağlamakla kalmaz, aynı zamanda diğer kanser ve hastalıklara da uygulanabilir. Ektomi sırasında prostat örneklerini toplayın ve örneği anatomik işaret noktalarını kullanarak yönlendirin. Prostatı ve seminal vezikülleri şu şekilde boyayın: sağ taraf yeşil, sol taraf mavi.

Rektal yüzeye dik olacak şekilde dokunun rastgele bir transvers orta kesitini alın, örneği dondurun ve -80 °C'de saklayın. Örnek dilimlerin bir fotokopisini çekip yönlendirin ve bunları dört eşit parçaya bölün. Karşılık gelen görüntü üzerindeki tümörlü ve normal alanları belirlemek için bir patoloğa danışın.

RNA izolasyonu için RNA ekstraksiyonuna yönelik tümör dokusunu belirlemek amacıyla işaretli alanları kılavuz olarak kullanın. Dondurulmuş prostat örneklerini kuru buz üzerine yerleştirerek ve belirlenmiş fotokopiye başvurarak işleme başlayın. Prostat tümörünün küçük bir kısmını kesin.

Prostat tümör dokusunu bir mililitre triol reaktifi içinde homojenize edin. Homojenize edilmiş örnekleri beş dakika inkübe edin. Oda sıcaklığında, örneklere 0,2 mililitre kloroform ekleyin ve 15 saniye boyunca kuvvetlice çalkalayın.

Numuneleri oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin, ardından 4 °C'de 15 dakika boyunca 12,000 ×g'de santrifüjleyin. Renksiz üst sulu fazı yeni tüplere aktarın ve 0.5 mL izopropil alkol ekleyin. Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin, ardından 4 °C'de 10 dakika boyunca 12,000 ×g'de santrifüjleyin.

RNA içeren peleti rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice aspire edin. RNA peletine bir mililitre %75 ethanol ekleyin, örneği vorteksleyin ve 4 °C'de 7.500 ×g'de beş dakika santrifüjleyerek çöktürün. Süpernatantı tekrar aspire edin ve RNA peletinin tamamen kurumasını önleyerek beş ila 10 dakika boyunca kurutun.

Pelleti nükleaz içermeyen suda çözün ve RNA konsantrasyonunu ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. RNA örneklerinin kalitesini ve bütünlüğünü kontrol etmek için bir bioanalyzer kullanın. RNA'yı, üreticinin talimatlarına uygun olarak bir ters transkripsiyon kiti kullanarak cDNA'ya ters transkribe edin.

Standart bir eğri oluşturmak için, ilgilenilen genin belirgin bir ekspresyona sahip olduğu bilinen bir örnekten orijinal CD NA'nın bir dizi dilüsyonunu hazırlayın. 20 µL reaksiyon hacminde, two x quant. Detect cyber green PCR master mix, 10 x microscript universal primer, 10 x microscript primer assay ve RN a's free water içeren bir master mix hazırlayarak gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin.

Biri hedef gen, diğeri ise bu durumda referans gen olan RNU six B için iki set primer ekleyin. Her bir CDNA seyreltisinden iki µL'yi ayrı light cycler kapiler tüplerine pipetleyin ve 18 µL master mix ekleyin. Santrifüj etmek için bir kapiler adaptörü kullanın. Kapilerleri kapiler tabanlı bir realtime cycler cihazına yerleştirin ve PCR programını şu şekilde çalıştırın: 15 dakika boyunca 95 °C, ardından 15 saniye boyunca 94 °C şeklinde 50 döngü.

30 saniye boyunca 55 °C ve 30 saniye boyunca 70 °C. Kalibratör olarak kullanılacak bir örnek seçin ve normalize edilmiş hedef miktarını bir olarak ayarlayın. Amplifikasyon eğrilerini oluşturmak için diğer tüm örneklerdeki mikro RNA'nın bağıl ekspresyonunu kalibratör ile karşılaştırın.

PCR reaksiyonları için, molecular biochemicals light cycler yazılımının versiyon 3.5'indeki kantifikasyon sekmesini kullanın. Reaksiyonları kantifiye edin ve verileri bir metin dosyasına aktarın. Kantifikasyon sonuçlarını oluşturmak için verileri REL quant analiz yazılımına aktarın.

Hedef gen, referans gen ve standart eğri verileri için ayrı dosyaları içe aktarın. Hem hedef hem de referans gen için kalibratörün konumunu ve örneklerin konumlarını belirleyin. Veriler, farklı örneklerin hedef/referans oranının, kalibratörün hedef/referans oranına bölünmesi şeklinde ifade edilir.

Belirli bir mikro RNA ve housekeeping geni için önceden oluşturulmuş standart eğriyi, konsantrasyonları bilinmeyen mikro RNA hedefleri için kantitatif verilerin ekstrapolasyonunda referans standart olarak kullanın. Üç örneği bir grup olarak analiz edin ve triplikatin ortalama konsantrasyonlarını ve standart sapmalarını hesaplayın.

Üçlü tekrarlardan biri setin geri kalanıyla tutarsızsa, program bunu hariç tutacaktır. Burada prostat örneklerinin A-Q-P-C-R analizine dair bir örnek gösterilmiştir. Referans gen U six'in ekspresyon seviyelerini gösteren grafikler yaklaşık 20. döngüde eksponansiyel amplifikasyona başlarken, hedef gen MIR 98'in ekspresyonu 25. döngü civarında gecikmiş amplifikasyon göstermiştir.

Bu deneyden elde edilen veriler bir metin dosyası olarak dışa aktarılmış ve analiz yazılımı ile analiz edilmiştir; kalibratör ve numuneleri içeren kapilerlerin konumları belirtilmiştir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığında bir günde tamamlanabilir. Bu tekniğin güvenilirliği, RNA kalitesine bağlıdır.

Bu nedenle, çok kolay bozunabildiği için RNA'nın işlenmesinde ekstra özen göstermek önemlidir.