Name: Akım Sitometri ve Otomatik Manyetik Aktif Hücre Sıralama (AutoMACS) kullanarak Naive ve Pankreas Tümör taşıyan fareler ile myeloid türevi bastırıcı hücreler (MDSC) hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: Öğrenin fare dalaklarından myeloid türevi bastırıcı hücreleri (MDSC) izole etmek için akım sitometri ve AutoMACS hücre sıralama yöntemlerini. Bu teknik canlı Gr-1+ lökositleri hızla zenginleştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz USF Akım Sitometri Çekirdek Tesisi kabul ediyorsunuz. Biz kaynaklarının paylaşımı için Dr Denise Cooper teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca kurma ve bu video filme kendi yardım için Maya Cohen, Laura Pendleton ve Diana Latour teşekkür etmek istiyorum. NN Doktora Bursu HRD # 0929435 NSF FG-LSAMP Köprüsü tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma TG verilen Amerikan Kanser Derneği Kurumsal Araştırma Bursu # 93-032-13/Moffitt Kanser Merkezi tarafından finanse edildi.

Başlamadan önce, aşağıdaki çözümleri hazırlamak: % 3 Boyama Media (SM): 1X Phosphate Buffer Saline -3% Fetal Bovine Serum (FBS) (PBS) MACS Buffer (MB): - 1XPBS içinde Bovine Serum (BSA) 0.5% Albumin 1. Fare ile Hasat dalak <ol><li> (; TB tümör taşıyan) subkutan 1.5 x Panc02 10 5 fare hücrelerini 100 ul 1x PBS asılı olan yaş C57BL 6-8 hafta / 6 fareleri (Harlan) enjekte edilir. Kontrol fareler (naif) 100 ul 1XPBS alırsınız. </li><li> Yaklaşık 4 hafta sonra enjeksiyon, karbon dioksit asfiksisi ile farelerde euthanize. </li><li> Forseps ve makas kullanılarak künt diseksiyon ile farelerin Hasat dalak sonra denge ağırlıklarından yararlanılarak. Ayrı yerde dalak, 1 x PBS içeren 50 ml&#39;lik konik tüpler etiketli. </li></ol> 2. Tek hücreli Suspensio üretdalak gelen lökositler n Tüm işlemler bir Biyolojik Güvenlik Hood ve buz üzerinde tutulmalıdır hücreleri ve antikorların altında steril bir ortamda yapılmalıdır. <ol><li> Dibe doğru bardağı ağzına örgü ekran ekleyerek hücre ayrışma elek birleştirin. Sonra, oluklu tarafı dişli alana istinat halkası eklemek ve böylece yerinde ekranı tutan istinat bileziğini sıkmak için halka tuşunu kullanın. 10 ml 1 x PBS içeren Petri içinde monte elek yerleştirin. </li><li> Havuz dalak ve kullanım cam havaneli hücre ayrışma elek mesh ekrana ve Petri kabına dalak öğütmek için. Farelerin her tedavi grubu için tekrarlayın. </li><li> Bir 70 um hücre süzgecinden ve 5 ml serolojik pipet kullanılarak bir 50 ml konik tüpe Filtre hücre süspansiyonu. 5 dakika 12.000 rpm (250-300 xg) santrifüjleyin. </li><li> Dalak başına 5 ml 1 x RBC parçalama tamponunda süpernatan ve Pastör pipetiyle pelet Kaldır. Pipet yukarı ve aşağı şiddetle. 5 dk için oda sıcaklığında inkübe edilir. 1 x 20 ml PBS ilave edilerek reaksiyon durdur. Pipet yukarı ve aşağı şiddetle. 5 dakika 12.000 rpm (250-300 xg) santrifüjleyin. </li><li> 20 ml steril 1 x PBS süpernatan ve Pastör pipetiyle pelet çıkarın. Pipet yukarı ve aşağı şiddetle. </li><li> 50 ul 5x10 5-1x10 6 hücreleri (- 2x10 7 hücre / ml 1x10 7 hücre / ml) &#39;e denk olacak şekilde tripan mavi ve% 3 SM istenen konsantrasyonda bir hemasitometre ile Pastör pipetiyle kullanılarak hücreleri hesaplama. </li></ol> 3. Akım Sitometri kullanarak MDSC Hücre yüzey Boyama / İmmünofenotipleme <ol><li> (; Mac-1-FITC; Gr-1-APC ve DAPI No Leke, NS) kontrolü ve dengeleme kontroller için deneysel örnekleri ve tek bir leke için bir 96-kuyucuklu V alt levhanın kuyuları etiketlemek. </li><li> 96-kuyulu plakalı V-altlı in / kuyu kendi kuyucuklara splenositlerin 50 ul eşdeğer 5x10 5-1x10 6 hücreleri ekleyin. Santrifüj5 dakika 12.000 rpm (250-300 xg) plakası. </li><li> Buz üzerinde 1.5 ml mikrosantrifüj tüp,% 3 SM inceltilmiş Fare BD Fc Bloğu (Sıçan anti-fare CD16/32 monoklonal antikor) ve &quot;Master Mix&quot; (MM) hazırlayın. Bir başlangıç ​​noktası olarak, başına iyi, 50 ul son bir birim için% 3 SM 1 mikrogram Fc Blok kullanın. </li><li> Dikkatle hücre peletlerin kesinti olmadan bir atık konteyner veya lavabo üzerinde, üzerinde hızla geri ters plakası tarafından 96-kuyucuklu V-altlı plakanın her gelen süpernatan kaldırmak ve. </li><li> Vortex, kısaca 5 saniye Fc Blok MM santrifüj ve 96-V-alt plaka tüm peletlerine 50 ul ekleyin. Yavaşça kendi kuyularında örnekler bırakarak, aşağı yukarı pipetleme tarafından iyice karıştırınız. Buz üzerinde karanlıkta 15 dakika süreyle plaka inkübe. 5 dakika 12.000 rpm (250-300 xg) plakası santrifüjleyin. </li><li> Örnekleri Fc Blok ile inkübe ise, buz üzerinde bir 1.5ml mikrosantrifüj tüp içinde% 3 SM inceltilmiş florokrom-konjuge antikor &quot;Master Mix&quot; (MM) hazırlayın. Antikorlar titre edilmelidirboyama işlemleri için optimal seyreltme belirlemek için. Bir başlangıç ​​noktası olarak, iyi örnek başına 50 ul son hacim% 3 SM bir 1:25 Mac-1-FITC seyreltme ve Gr-1-APC 01:20 seyreltme birleştirir. </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi dikkatli bir şekilde 96-kuyucuklu V-altlı her bir yanı ile süpernatan kaldırın. </li><li> Vortex, kısaca 5 saniye için floresan-konjuge antikor boyama MM santrifüj ve kontrol ve deney peletlerine 50 ul ekleyin. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın. Tek-leke tazminatlar için, oyuk başına 50 ul son hacim% 3 SM yağmurluk-1-FITC ile 1:25 seyreltme, Gr-1-APC ve 75 ng / ml &#39;lik DAPI 01:20 seyreltme, ekleme kendi kuyucuklara. (Hayır Leke) iyi lekesiz için 50 ul% 3 SM ekleyin. İyice karıştırılır ve buz üzerinde koyu içinde 30 dakika süreyle 96-kuyulu plakalı V-altlı hücreleri inkübe edilir. </li><li> Etiket FACS borular (5 ml, 12 mm x 75 mm polistiren tabanı yuvarlak bir tüp) 96-kuyulu plakalı V-altlı her bir kuyucuğa karşılık. Her FACS üzere 200 ul% 3 SM eklemetüp. </li><li> 5 dakika 12.000 rpm (250-300 xg) plakası santrifüjleyin ve süpernatantlar çıkarın. Her pelet için 100 ul% 3 SM ekleyerek pelet yıkayın ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın. 5 dakika 12.000 rpm (250-300 xg) plakası santrifüjleyin. Bir kez daha adım yıkayın tekrarlayın. </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi dikkatli bir şekilde 96-kuyucuklu V-altlı her bir yanı ile süpernatan kaldırın. 100 ul% 3 SM her pelletini ve iyice karıştırın. </li><li> Bunların sırasıyla etiketli FACS tüpe 96-kuyucuklu V-altlı plakanın her 100 ul tekrar süspanse pelet transfer edin. </li><li> Flow sitometri analizi öncesinde, 75 ng / ml DAPI kontrol etmek ve deneysel örnekler ve DAPI tek bir leke kompanzasyon kontrolü ekleyin. </li><li> MDSC yüzdeleri flow sitometri veri toplama gerçekleştirin. Negatif (hiç leke kontrol) ve tek pozitif kontrolleri kullanarak tazminat gerçekleştirin. Böylece günlük ölçekte ileri (FSC) karşı tarafında dağılım (SSC) görüntüleyen bir nokta komplo kurmak ve lökositilgi tespit edilebilir. Enkaz ve en ileri ve yana yayılım ile topaklar hariç tüm lökositlerin büyük bir kapı çizin. Bu ana kapıdan, DAPI-(canlı) hücreleri üzerine SSC karşı DAPI ve kapı görüntüleyen yeni bir nokta arsa oluşturun. Bu yeni bağımlı nüfus seçin ve çift pozitif Mac-1 karşı Gr-1 ve kapı görüntüleyen bir nokta komplo oluşturmak (Mac-1 + Gr-1 +) MDSC. </li></ol> 4. Gr-1 + Lökosit Manyetik Zenginleştirme <ol><li> 5 dakika 12.000 rpm (250-300 xg) de uygun şekilde etiketlenmiş FACS tüpleri ve santrifüj içine tablet 1x10 7 kalan boyasız lökositlerin. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüp Gr-1-PE antikor MM hazırlayın. 10 7 hücre için, numune başına, 50 ul MB Gr-1-PE antikor 1:10 seyreltme kullanın. Daha fazla hücre sayıları için, buna göre hacimleri büyütmek. Kısaca, 5 saniye süreyle santrifüj FACS tüpler lökositlerin eklemek ve 4 15 dakika ° C&#39;de karanlıkta inkübe edin. </li&gt; <li> 5 dakika 12.000 rpm (250-300 xg) de FACS tüpleri, santrifüj MB 2 ml ekleyin ve supernatant atın. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü Anti-PE mikroboncuk MM hazırlayın. 10 7 hücre için, numune başına, 200 ul MB anti-PE mikroboncuk bir 1:4 dilüsyonu kullanın. Daha fazla hücre sayıları için, buna göre hacimleri büyütmek. Kısaca, 5 saniye süreyle santrifüj FACS tüpler lökositlerin eklemek ve 4 15 dakika ° C&#39;de karanlıkta inkübe edin. </li><li> 5 dakika 12.000 rpm (250-300 xg) de FACS tüpleri, santrifüj MB 2 ml ekleyin ve supernatant atın. SB 3 ml Pastör pipetiyle pelet. Yeni, etiketli 50 ml konik bir tüpe 70 mikron süzgeç süzülür. </li><li> Hazırlayın ve prime Otomatik MACS Pro Separator. Uygun çözümler ve boş atık şişe ile Dolum tüm şişeler, gerekirse. Enstrüman açın ve sıvı kapları ve başlatmasından sonra kolon (lar) ın durumunu incelemek. Bütün semboller yeşil renkte olmalıdır. Menüsünde, üst gelen &quot;Ayrılık&quot; ı seçinardından menü çubuğu alt menü çubuğundan &quot;Şimdi yıkayın&quot;. Astarlama işlemini başlatmak için &quot;Çalıştır&quot; ardından pop-up seçeneği &quot;yıkayın&quot; seçeneğini seçin. Çimlendirme süreci başarıyla tamamlandığında, cihaz o Durum menüsü altında &quot;Ayrılık için hazır&quot; olduğunu gösterecektir. </li><li> Satır B negatif fraksiyon toplama ve satır C. pozitif fraksiyon toplanması için 15 ml konik tüp için bir satır, 50 ml konik tüp manyetik etiketli hücreleri ile tüp boyutları ve yeri için uygun soğutulmuş tüpü rakı 50 ml konik tüp seçin </li><li> Örneklerinden duyarlı modda etiketli hedef hücrelerin pozitif seçimi için &quot;POSSEL_S&quot; hücre ayırma programı seçin. Manyetik etiketli hedef hücreler otomatları sütun üzerinde korunur; etiketsiz hücrelerin mıknatısın otomatik çekilmesi üzerine satır B&#39;de negatif fraksiyon toplama tüpüne bırakılır, etiketli hedef hücreler tüp satır C pozitif toplama tüpüne çıkacak raf. </li></ol>+ Zenginleştirilmiş Lökositler Post-Sıralama Analizi <ol><li> Gr-1 Recount + ve Gr-1 - tripan mavi ve hemasitometre kullanarak kesirler. % 3 boyama ortam içinde istenen konsantrasyonda Pastör pipetiyle hücreleri 50 ul 5x10 5-1x10 6 hücreleri (1x10 7 hücre / ml - 2x10 7 hücre / ml) &#39;e denk olacak şekilde ve buna uygun olarak etiketlenmiş FACS tüpler 50 ul transfer. </li><li> Örnek başına 50 ul&#39;lik bir son hacim% 3 SM bir 01:25 seyreltildiğinde, sadece Mac-1 bir MM hazırlayın. Hücreleri Leke ve akım sitometri analizi için Gr-PE, Mac-1 FITC ve DAPI tek leke tazminatlar hazırlamak. 200 ul% 3 SM ve DAPI canlılığı boya maddesi olarak daha önce tarif ekleyin. </li><li> Yüzdeler ve ayrıca pre ve post-autoMACS zenginleştirme MDSC yüzdeleri karşılaştırmak için - Gr-1 + ve Gr-1 belirlemek için akım sitometri veri toplama gerçekleştirin. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Burada r göstermek<html> MDSC (Şekil 1) sıralama sonraki FACS için toplandı, naif dalak gelen Gr-1 + lökositlerin autoMACS zenginleşmesi için epresentative sonuçlar. 1x10 6 naif lökositlerin önce autoMACS sıralama, BD LSRII alet kullanarak MDSC yüzdeleri tespit etmek Mac-1-FITC ve Gr-1-APC antikorları ile boyandı. 1x10 7 naif lökositlerin sonra bir autoMACS Pro Ayırıcı kullanarak Gr-1 + lökositlerin zenginleştirilmesi için anti-Gr-1-PE antikorlar ve PE-mikro ile boyandı. Post-autoMACS zenginleştirme, Gr-1 Gr-1 yüzdeleri + ve Gr-1 - Toplanan kesirler akım sitometri kullanılarak değerlendirildi. 1x10 6 Gr-1 + lökositleri akım sitometri ile tümör taşıyan lökositlerin toplanmış olmayan zenginleştirilmiş için naif lökositlerin toplanmış zenginleştirilmiş MDSC yüzdeleri, analiz etmek ve karşılaştırmak için Mac-1-FITC antikoru ile çıkarıldı ve boyandı. fig1.jpg &quot;/&gt; Sıralama MDSC FACS için naif Gr-1 + lökositlerin Şekil 1. AutoMACS zenginleştirme. Dalak pankreas tümörü taşıyan ve naif farelerin hasat ve tek hücre süspansiyonları içine işlendi. Naif lökosit yüzey Flow sitometri analizi öncesinde autoMACS zenginleştirme (A), Mac-1 ve Gr-1 floresan-konjuge antikor ile boyandı. Akış sitometrisi Gr-1 analizi + (B) ve Gr-1 - Gr-1-PE antikor ve anti-PE mikro-küreler ile boyanmış havuzlanmış saf leuckocytes gelen Gr-1 + hücrelerinin (C) fraksiyonlar post-autoMACS zenginleştirme. MDSC ve Gr-1 Flow sitometri analizi Gr-1 + yüzdeleri sonrası autoMACS zenginleştirme Tümör taşıyan farelere (E) olmayan zenginleştirilmiş toplanmış lökosit (naif fareler, n = 5 göre toplanmış naif lökosit (D) + hücre ; tümörü taşıyan farelere, n = 3). MDSC ve Gr-1 yüzdeleri temsilcisi kontur araziler ve histogramları ortasında korunaklı vardır.

<ol><li>Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+during+acute+Trypanosoma+cruzi+infection%3A+involvement+of+Ly6G+%28Gr1%28%2B%29%29CD11b%28%2B%29+immature+myeloid+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells.</a> Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).</li>
<li>Zhu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11b%2BLy-6C%28hi%29+suppressive+monocytes+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD11b+Ly-6C(hi) suppressive monocytes in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J. Immunol. 179, 5228-5237 (2007).</li>
<li>Makarenkova, V. P., Bansal, V., Matta, B. M., Perez, L. A., Ochoa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11b%2B%2FGr-1%2B+myeloid+suppressor+cells+cause+T+cell+dysfunction+after+traumatic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD11b+/Gr-1+ myeloid suppressor cells cause T cell dysfunction after traumatic stress.</a> J. Immunol. 176, 2085-2094 (2006).</li>
<li>Ghansah, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+myeloid+suppressor+cells+in+SHIP-deficient+mice+represses+allogeneic+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expansion of myeloid suppressor cells in SHIP-deficient mice represses allogeneic T cell responses.</a> J. Immunol. 173, 7324-7330 (2004).</li>
<li>Paraiso, K. H., Ghansah, T., Costello, A., Engelman, R. W., Kerr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+SHIP+deficiency+expands+myeloid+regulatory+cells+and+abrogates+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induced SHIP deficiency expands myeloid regulatory cells and abrogates graft-versus-host disease.</a> J. Immunol. 178, 2893-2900 (2007).</li>
<li>Yin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+prevent+type+1+diabetes+in+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells prevent type 1 diabetes in murine models.</a> J. Immunol. 185, 5828-5834 (2010).</li>
<li>Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 162-174 (2009).</li>
<li>Gallina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+induce+a+subset+of+inflammatory+monocytes+with+immunosuppressive+activity+on+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells.</a> J. Clin. Invest. 116, 2777-2790 (2006).</li>
<li>Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+frequency+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+mice+with+spontaneous+pancreatic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Increase in frequency of myeloid-derived suppressor cells in mice with spontaneous pancreatic carcinoma.</a> Immunology. 128, 141-149 (2009).</li>
<li>Greten, T. F., Manns, M. P., Korangy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+derived+suppressor+cells+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Myeloid derived suppressor cells in human diseases.</a> Int Immunopharmacol. 11, 802-806 (2011).</li>
<li>Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Immunol. 181, 5791-5802 (2008).</li>
<li>Ribechini, E., Greifenberg, V., Sandwick, S., Lutz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets%2C+expansion+and+activation+of+myeloid-derived+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subsets, expansion and activation of myeloid-derived suppressor cells.</a> Med. Microbiol. Immunol. 199, 273-281 (2010).</li>
<li>Pilon-Thomas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Pancreatic+Adenocarcinoma+Dampens+SHIP-1+Expression+and+Alters+MDSC+Homeostasis+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Murine Pancreatic Adenocarcinoma Dampens SHIP-1 Expression and Alters MDSC Homeostasis and Function.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Panopoulos, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+governs+distinct+pathways+in+emergency+granulopoiesis+and+mature+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">STAT3 governs distinct pathways in emergency granulopoiesis and mature neutrophils.</a> Blood. 108, 3682-3690 (2006).</li>
<li>Preynat-Seauve, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extralymphatic+tumors+prepare+draining+lymph+nodes+to+invasion+via+a+T-cell+cross-tolerance+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Extralymphatic tumors prepare draining lymph nodes to invasion via a T-cell cross-tolerance process.</a> Cancer Res. 67, 5009-5016 (2007).</li>
<li>Davies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separations+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Cell separations by flow cytometry.</a> Methods Mol. Med. 58, 3-15 (2001).</li>
<li>Maecker, H., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+reagents+for+multicolor+BD+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Postepy+Biochem%22%5BJournal%5D)">Selecting reagents for multicolor BD flow cytometry.</a> Postepy Biochem. 55, 461-467 (2009).</li>
<li>Bagwell, C. B., Adams, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Spectral+Overlap+Compensation+for+Any+Number+of+Flow+Cytometry+Parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Spectral Overlap Compensation for Any Number of Flow Cytometry Parameters.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 677, 167-184 (1993).</li>
<li>Perfetto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+reactive+dyes%3A+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).</li>
<li>Safarik, I., Safarikova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+magnetic+techniques+for+the+isolation+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B.+Biomed.+Sci.+Appl%22%5BJournal%5D)">Use of magnetic techniques for the isolation of cells.</a> J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 722, 33-53 (1999).</li>
<li>Collazo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHIP+limits+immunoregulatory+capacity+in+the+T-cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">SHIP limits immunoregulatory capacity in the T-cell compartment.</a> Blood. 113, 2934-2944 (2009).</li>
<li>Mack, E., Neubauer, A., Brendel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA+yield+from+small+cell+populations+sorted+by+flow+cytometry+applying+different+isolation+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+A%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA yield from small cell populations sorted by flow cytometry applying different isolation procedures.</a> Cytometry. A. 71, 404-409 (2007).</li>
<li>Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+responses+of+human+regulatory+T+cells+%28Treg%29+and+effector+T+cells+to+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin.</a> PLoS One. 4, e5994(2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu, çeşitli hayvan modellerinde farklı lenf dokuları için de geçerlidir MDSC popülasyonlarının işleme ve immunophentyping için ayrıntılı bir yöntemdir. Özellikle, autoMACS zenginleştirme splenositlerin 4 Gr-1 azalması, dalak ve lenf düğümleri 5 ila myeloid alt saflaştırılması, CD8 kemik iliği nötrofiller 14 izolasyonu ve saflaştırılması + dalak den T hücreleri dahil olmak üzere çeşitli lökosit izolasyonu için kullanılabilir ve lenf düğümleri 15. Bağımsız olarak ilgi...

<table border="1"><tbody><tr><td> REAKTİF </td><td> ŞİRKET </td><td> # KATALOG </td><td> YORUMLAR </td></tr><tr><td> 1X Fosfat Tamponlu Salin </td><td> Thermo Scientific Hyclone </td><td> SH30028.02 </td><td> Ca 2 + / Mg 2 + / Fenol Kırmızı-free </td></tr><tr><td> Bovine Serum (BSA) ile Albümin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td> BSA PBS içinde rahatsız edilmeden çözmek edelim; Steril Çevre </td></tr><tr><td> Fetal bovin serumu (FBS) </td><td> Thermo Scientific Hyclone </td><td> SV3001403HI </td><td> İnaktive Isı; Steril Çevre </td></tr><tr><td> Sıçan anti-fare monoklonal antikor CD16/32 (Fc Blok) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553142 </td><td> Steril Ortam </td></tr><tr><td> Anti-fare CD11b (Mac-1) FITC </td><td> eBiosciences </td><td> 11-0112 </td><td> SterilÇevre </td></tr><tr><td> Anti-fare Ly6G (Gr-1) APC </td><td> eBiosciences </td><td> 17-5931 </td><td> Steril Ortam </td></tr><tr><td> Anti-fare Ly6G (Gr-1) PE </td><td> eBiosciences </td><td> 12-5931 </td><td> Steril Ortam </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D1306 </td><td> Seri Seyreltme Steril Ortam </td></tr><tr><td> Hücre Ayrılma Elek </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CD1-1KT </td><td> Kullanmadan önce Otoklav </td></tr><tr><td> 70-mikron süzgeç </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> Steril Ortam </td></tr><tr><td> 1X RBC Lizis Tamponu </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td> Steril ortam; kullanımdan önce oda sıcaklığına ısınmaya </td></tr><tr><td> Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-12 </td><td> Steril Ortam </td></tr><tr><td> 50ml conical tüpler </td><td> Thermo Scientific </td><td> 339652 </td><td> Steril Ortam </td></tr><tr><td> 5ml 12X75mm polistiren tabanı yuvarlak tüpler </td><td> BD Biosciences </td><td> 352054 </td><td> FACS tüpleri olarak da bilinen; Steril Çevre </td></tr><tr><td> 96-kuyucuklu plaklar V-altlı </td><td> Corning </td><td> 3897 </td><td> Steril Ortam </td></tr><tr><td> Tripan Mavi </td><td> Cellgro </td><td> 25-900-CI </td><td> Steril Ortam </td></tr><tr><td> PE mikroküreler </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-048-801 </td><td> Steril Ortam </td></tr><tr><td> AutoMACS Pro Ayırıcı </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-092-545 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS Sütunlar </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-021-101 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon Koşu AutoMACS </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-091-221 </td><td&gt; </td></tr></tbody></table>

akım sitometri ve otomatik manyetik aktif hücre sıralama (automacs) kullanarak naive ve pankreas tümör taşıyan fareler ile myeloid türevi bastırıcı hücreler (mdsc) hazırlanması

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

MDSC olgunlaşmamış makrofajlar, dendritik hücreler ve paraziter enfeksiyon, inflamasyon, travmatik stres, Graft-versus-host hastalığı, diyabet ve kanser de dahil olmak üzere 1-7 patolojik durumlarda lenfoid organlarda birikir granülosit heterojen bir nüfus vardır. Farelerde, MDSC ekspres Mac-1 (CD11b) ve Gr-1 (Ly6G ve Ly6C) yüzey antijeni 7. Bu MDSC de önemli ölçüde genişletilmiş, çeşitli tümör taşıyan konaklar incelenmektedir dikkat ve 7-10 naif muadillerine göre anti-tümör immün yanıtı bastırmak için önemlidir. Ancak, patolojik durumuna bağlı olarak, bastırma 11,12 ile farklı mekanizmaları ve hedefleri ile MDSC farklı alt nüfusları vardır. Bu nedenle, canlı MDSC popülasyonlarının etkin bir yöntem izole etmek için in vitro ve in vivo bastırma onların farklı moleküler mekanizmalar durulaştırmada önemlidir. Son zamanlarda, Ghansah grubu, bir mürin pankreas kanseri modelinde MDSC genişlemesi rapor etmiştir. Bizim tümör taşıyan MDSC homeostazının kaybı görüntülemek ve naif MDSC 13 oranla baskılayıcı fonksiyonu artmıştır. MDSC yüzdeleri naif vs tümörü taşıyan farelerin lenf bölümlerinde önemli ölçüde azdır. Bu genellikle bu MDSC doğru karşılaştırmalı analizleri engellemektedir büyük bir uyarı vardır. Bu nedenle, önceden Floresans Aktif Hücre Sıralama (FACS) kadar naif farelerden Gr-1 + lökositleri zenginleştiren saflık, canlılığı artırır ve önemli ölçüde sıralama zamanı azaltır. Bu sıralama hızlı FACS için bolca bulunur Ancak, tümör taşıyan farelerin Gr-1 + lökositlerin zenginleştirme isteğe bağlıdır. Bu nedenle, bu protokol, biz MDSC işaretleyicidir ve zamanında MDSC sıralama için naif farelerin dalak gelen Gr-1 + lökositleri zenginleştiren son derece etkili bir yöntem tarif. İmmünokompetent C57BL / 6 fare mürin Panc02 ce ile inoküle edilmiştirLLS subkutan naif fareler 1XPBS alırsınız oysa. Yaklaşık 30 gün aşılama sonrası; dalak hücre ayrışma elek kullanarak tek hücre süspansiyonları içine hasat ve işlenir. Splenositlerin sonra Eritrosit (RBC) parçalanır ve bu lökositlerin bir kısım Akım Sitometri kullanarak immünfenotip MDSC yüzdeleri Mac-1 ve Gr-1 karşı florokrom-konjuge antikor kullanılarak boyandı edilir. Paralel bir deneyde, naif farelerin tüm lökositlerin otomatik Manyetik Aktif Hücre Sıralama (autoMACS) Pro Separator kullanarak PE-mikro inkübe ve olumlu seçilen floresan konjuge Gr-1 antikorları ile boyanan. Sonra, Gr-1 + lökositlerin bir kısım Akım Sitometri kullanarak MDSC oranlarda artış tanımlamak için Mac-1 antikorları ile boyanan. Şimdi, bu Gr1 + zenginleştirilmiş lökositler in vivo ve in vitro (naif vs tümör taşıyan) karşılaştırmalı analizlerde kullanılmak üzere MDSC sıralama FACS hazır </em&gt; deneyleri.

Bu myeloid türevi bastırıcı hücreler (MDSC) işaretleyicidir ve Gr-1 zenginleştirmek için hızlı ve kapsamlı bir yöntemdir<sup&gt; +</supFare dalak gelen&gt; lökositlerin. Bu yöntem uygulanabilir Gr-1 için zenginleştirmek için sıralama akım sitometri ve AutoMACS Hücre kullanır<sup&gt; +</supKullanım için MDSC sıralama FACS önce&gt; lökositlerin<em&gt; In vivo</em&gt; Ve<em&gt; In vitro</em&gt; Deneyleri.

Akım Sitometri ve Otomatik Manyetik Aktif Hücre Sıralama (AutoMACS) kullanarak Naive ve Pankreas Tümör taşıyan fareler ile myeloid türevi bastırıcı hücreler (MDSC) hazırlanması

MDSC'ler; patolojik durumlarda lenfoid organlarda biriken immatür makrofajlar, dendritik hücreler ve granülositlerden oluşan heterojen bir popülasyondur...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, in vivo ve in vitro analizlerde kullanılmak üzere fare dalaklarından canlı myeloid kaynaklı baskılayıcı hücreler veya mDSC'ler içeren, GR1 pozitif olarak zenginleştirilmiş bir lökosit popülasyonunu hızla oluşturmaktır. İlk olarak, birkaç fareden alınan dalaklar birleştirilir ve tek hücre süspansiyonu oluşturmak için işlenir. Zenginleştirme öncesindeki mDSC yüzdesini belirlemek için, birleştirilen hücrelerin küçük bir alikotu 96 kuyuklu V tabanlı bir plakaya aktarılır.MAC-1 ve GR-1 yüzey antijenleri işaretlenir ve işaretli hücreler akış sitometrik analiz için faks tüplerine aktarılır. Geriye kalan havuzlanmış lökositler, GR-1'e karşı florokrom konjuge bir antikorla boyanır ve anti-GR-1 antikorundaki florokroma bağlanan manyetik mikroboncuklarla inkübe edilir. Ardından, popülasyonun GR-1 zenginleştirme başarısını değerlendirmek için bir AutoMax pro separatör kullanılarak GR-1 pozitif ve GR-1 negatif popülasyonlar birbirinden ayrılır.MDSC yüzdelerini değerlendirmek için küçük bir alikot alınır ve GR one ile MAC one ekspresyonu açısından analiz edilir. Elde edilen immünofenotipleme verilerinin karşılaştırılması, GR one ile zenginleştirilmiş lökosit popülasyonunda, zenginleştirilmemiş popülasyona kıyasla MDSC yüzdelerinde bir artış olduğunu göstermektedir. Ek olarak, naive MDSC'lerde meydana gelen artış, tümör taşıyan MDSC'lerle karşılaştırılabilir bir popülasyon oluşturmaktadır.Bu tekniğin, konvansiyonel akış boyama ve lenfoid dokulardan mDSC'lerin yüksek hızlı akış sitometrisi tabanlı ayrıştırılması gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, master mix tekniğimizin havuzlanmış lökositlerin eşit yüzey boyamasını, sırasıyla fenotiplemeyi ve mDSC'ler ile GR1 pozitif hücrelerin AutoMax ile ayrıştırılmasını sağlayarak sonuçlarımızdaki önemli varyasyonları önlemesidir. Prosedürleri, laboratuvarımızdan lisansüstü öğrencisi Nadine Nelson ve USF akış sitometrisi merkez tesisi direktörü Dr. Haw srale gösterecektir. Aşağıdaki prosedür, hücreler ve antikorlar buz üzerinde tutularak, biyolojik güvenlik kabini altında steril bir ortamda gerçekleştirilmelidir.Mümkün olduğunda, hücre ayrıştırma eleğini, gözenekli ekranı kabın alt kısmına doğru olan açıklığına yerleştirerek monte edin. Ardından, sabitleme halkasını, yuvalı tarafı yukarı bakacak şekilde dişli bölgeye yerleştirin ve ekranı sabitlemek için halka anahtarını kullanarak sabitleme halkasını sıkın. Monte edilen eleği, 10 milliliters XPBS havuzu içeren bir Petri kabına yerleştirin.Altı ila sekiz haftalık tümör taşıyan veya naif kontrol C 57 black six farelerinden alınan dalakları hücre ayrıştırma eleğinin gözenekli ekranına yerleştirin. Ardından, dalakları cam havan eli kullanarak gözenekli ekran üzerinden petri kabına ezerek geçirin. Bu işlemi her fare tedavi grubu için tekrarlayın.Ardından, beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak hücre süspansiyonunu 70 mikronluk bir hücre süzgecine uygulayın ve 50 mililitrelik konik bir tüpe filtrelenmesini sağlayın. 250 ile 300 ×g arasında beş dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı uzaklaştırın ve dalak başına beş mililitre RBC lizis tamponu ekleyip kuvvetlice pipetleyerek peleti yeniden süspande edin; oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, 20 mililitre PBS ekleyip kuvvetlice pipetleyerek reaksiyonu durdurun.Ardından, süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra 250 ila 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin, peleti 20 mL steril PBS içerisinde çözün ve hücreleri sayın. Trian blue ve bir hemositometre kullanarak hücreleri %3'lük boyama ortamında 1 × 10⁷ ile 2 × 10⁷ hücre/mL konsantrasyonda resüspande edin. Optimal boyamanın sağlanması, bu prosedürün en zor kısmıdır.Bu işlem, antikorların önceden titre edilmesiyle başarıyla gerçekleştirilebilir. Bu protokolde açıklandığı üzere, master mix hazırlama ve yüzey boyama işlemlerini küçük hacimlerde uygulayın. Hücreleri akış sitometrik analiz için boyamak amacıyla, bir 96 kuyucuklu vbo plakasının kuyucuklarını kontrol ve deney örnekleri ile tekli boyamalar için etiketleyin.Kompanzasyon kontrolleri için, etiketli kuyucukların her birine 50 µL hacimde 5 × 10⁵ ile 1 × 10⁶ arası hücre ekleyin. Ardından plakayı 250 ila 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve santrifüj işleminden sonra plakayı alttan görüntüleyin.Kuyucuklarda pelletlerin bulunduğundan emin olmak için kontrol ederek, buz üzerinde 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde, %3'lük boyama ortamında seyreltilmiş sıçan anti-mouse CD163 monoklonal antikor içeren bir mouse BDFC blok ana karışımı hazırlayın ve vorteksleyin. Ardından, 96 kuyucuklu V tabanlı plakayı bir atık kabı veya lavabo üzerinde tutarak beş saniye boyunca kısa süreliğine santrifüjleyin. Hücre pelletlerini bozmadan süpernatantı uzaklaştırmak için plakayı hızlıca ters çevirip tekrar düzeltin.Ardından, 96 kuyucuklu V tabanlı plakadaki tüm peletlere 50 µL FC blok master mix ekleyin ve nazikçe pipetleyerek karıştırın. Plakayı buza yerleştirin ve karanlıkta 15 dakika inkübe edin, ardından plakayı 250 ila 300 ×g'de beş dakika santrifüjleyin. Buz üzerinde 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü içerisinde, %3'lük boyama ortamında seyreltilmiş Mac one fitzy ve GR one A PC antikorlarından oluşan bir master mix hazırlayın.Beş saniye boyunca kısaca vorteksleyerek santrifüjleyin. Santrifüj sonrası, her kuyucuktaki süpernatantı uzaklaştırmak için plağı ters çevirin, ardından kontrol veya deney pelletlerine 50 µL antikor karışımı ekleyin. Tekli boyama kompanzasyonları için, uygun kuyucuklara %3'lük boyama ortamında dilüe edilmiş 50 µL MAC1-FITC, GR1-APC veya DPI ekleyin ve nazikçe pipetleme yaparak iyice karıştırın. Boyanmamış kontrol için, uygun kuyucuğa 50 µL %3'lük boyama ortamı ekleyin ve karıştırın.Ardından plakayı buz üzerinde, karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sırasında, plakanın her bir kuyuna karşılık gelecek şekilde fax tüplerini etiketleyin ve her bir fax tüpüne 200 µL %3'lük boyama ortamı ekleyin. 30 dakikalık inkübasyon süresi dolduğunda, plakayı 250 ila 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Santrifüjden sonra, süpernatanları önceki gibi uzaklaştırın. Ardından, her bir pelete 100 µL %3'lük boyama ortamı ekleyerek peletleri yıkayın. Nazikçe pipetle yukarı-aşağı çekerek iyice karıştırın.Plakayı beş dakika daha santrifüjleyin. Santrifüjleme sonrası yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın, natini daha önce olduğu gibi uzaklaştırın ve her bir peleti 100 µL %3'lük boyama ortamında yeniden süspande edip iyice karıştırın. Ardından, plakanın her bir kuyusundan yeniden süspande edilen hücrelerden 100 µL'lik kısımları ilgili olarak etiketlenmiş fax tüplerine aktarın.Ardından, kontrol ve deney numuneleri ile DPI tekli boyama kompanzasyon kontrolüne 75 nanograms per milliliter DPI ekleyin. Yanındaki belgede açıklandığı üzere MDSC yüzdelerini belirlemek için sitometrik veri alımını gerçekleştirin; ardından, GR1 pozitif lökositlerin zenginleştirilmiş bir aliquot'unu (kalan boyanmamış lökositlerin 1 times 10 to the seventh katı kadar) uygun şekilde etiketlenmiş FACS tüplerine aktarın ve 250 to 300 times G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Max tamponu içerisinde 1 to 10 dilüsyonunda 50 microliters GR1 PE antikoru ekleyin ve 4 degrees Celsius'te, karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından, her bir faks tüpüne iki mililitre max tamponu ekleyin ve 250 ile 300 ×g arasında beş dakika boyunca santrifüj edin. Santrifüj işleminden sonra süpernatantı uzaklaştırın. Ardından, her tüpe max tamponu içerisinde 1/4 oranında dilüe edilmiş 200 µL anti PE mikroboncuk ekleyin ve 4 °C'de karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin.FAX tüplerine iki mililitre max tamponu ekleyin ve 250 ile 300 ×g arasında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından peleti üç mililitre boyama tamponu içinde yeniden süspande edin ve 70 mikronluk bir süzgeçten geçirerek yeni etiketlenmiş 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Bu protokolde otomatik manyetik ayırma kullanıyoruz.Manyetik ayırma yöntemleri arasında harika bir seçimdir. Çok sayıda hücreyi hızlı, maliyet etkin bir şekilde ve bir yüzey belirtecine dayanarak ayırmanız gerekiyorsa, işlemin sonunda sonuçlarınızı akış sitometrisi ile kontrol ettiğinizden emin olun. AutoMax pro ayırıcıyı hazırlamak ve başlatmak için tüm şişelerin uygun çözeltilerle dolu olduğundan emin olun.Cihazı açın. Ardından, başlatma işlemi tamamlandıktan sonra sıvı kaplarının ve kolonların durumunu inceleyin. Tüm semboller yeşil olmalıdır.Sırada, üst menü çubuğundan separation seçeneğini ve ardından wash seçeneğini belirleyin. Şimdi alt menü çubuğundaki açılır seçeneklerden rinse seçeneğini belirleyin ve hazırlama işlemini başlatmak için run seçeneğine tıklayın. Hazırlama işlemi başarıyla tamamlandığında, cihaz ayrıştırma için hazır olduğunu gösterecektir.Durum menüsü altından, manyetik olarak işaretlenmiş hücreleri içeren 50 mililitrelik konik tüpü uygun boyutlardaki soğutulmuş tüp rafının A sırasına yerleştirin. Ardından, negatif fraksiyon toplama için bir 50 mililitrelik konik tüpü B sırasına ve pozitif fraksiyon toplama için bir 15 mililitrelik konik tüpü C sırasına yerleştirin; örneklerden işaretli hedef hücrelerin hassas modda pozitif seçimi için POS hücre S hücre ayırma programını seçin. Program başladığında, manyetik olarak işaretlenmiş hedef hücreler AutoMax kolonunda tutulurken, işaretlenmemiş hücreler B sırasındaki negatif fraksiyon toplama tüpüne salınacaktır. Daha sonra mıknatıs geri çekilecek ve işaretli hedef hücreler tüp rafının C sırasındaki pozitif toplama tüpüne salınacaktır.Zenginleştirme işleminden sonra, GR1 pozitif ve GR1 negatif fraksiyonlarını yeniden saymak için trypan blue ve bir hemositometre kullanın. Ardından hücreleri, %3'lük boyama ortamında mL başına 1x10⁷ hücre ile 2x10⁷ hücre arasında olacak şekilde yeniden süspande edin ve 50 µL'yi uygun şekilde etiketlenmiş FACS tüplerine aktarın. Akış sitometrisi ve tekli boyama kompanzasyonları için hücreleri MAC-1 ve DPI canlılık boyaları ile boyayın.GR1 pozitif ve GR1 negatif yüzdelerini belirlemek ve ayrıca AutoMax öncesi ve sonrası MDSC yüzdelerini karşılaştırmak için akış sitometrik veri alımı gerçekleştirin. Dalaklar, pankreas tümörlü ve naif farelerden toplandı ve bu video makalesinde açıklandığı gibi tek hücreli süspansiyonlar haline getirildi. Burada gösterildiği gibi, MAC1 ve GR1 floresan konjuge antikorlarla yüzey boyaması yapılmış naif lökositleri incelemek için akış sitometrisi uygulandı; AutoMax zenginleştirmesi öncesinde, naif MAC1 ve GR1 pozitif MDSC'lerin yalnızca çok düşük bir yüzdesi, %1,19 görülmektedir. Ancak, GR1 pozitif popülasyonunun zenginleştirilmesinin ardından, bu hücre alt popülasyonu naif farelerdeki %10,5 ile anlamlı derecede daha büyüktür ve artık tümör taşıyan farelerdeki %25,3 ile kıyaslanabilir düzeydedir.Bu prosedürü takiben, MDSC genişlemesi, migrasyonu ve diferansiyasyonu ile bağışıklık yanıtlarını baskılama özelliklerinden sorumlu moleküler mekanizmalara ilişkin ek soruları yanıtlamak için hızlandırılmış MDSC, akış sitometrisi tabanlı sıralama, in vivo transfer deneyleri, kantitatif gerçek zamanlı PCR ve western blotting dahil olmak üzere diğer yöntemler uygulanabilir.

preparation-myeloid-derived-suppressor-cells-mdsc-from-naive

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu yazıda, tümör infiltre lökositlerin oldukça saflaştırılmış nüfusu izole edilmesi için bir protokol tanımlamaktadır. Bu protokol, karmaşık tümör doku hücreleri izole edilmesi için, verim ve saflıkta geliştirmek için Miltenyi Biotech protokolü uyarlanmıştır.

Primer Tümörler gelen Bağışıklık Hücre İzolasyonu

Farklı dendritik hücre alt kümeleri, lenfoid organlarda nadir popülasyonlar olarak bulunur ve bu nedenle immünolojik deneyler için yeterli sayıda ve saflıkta izole edilmesi zordur. Burada, fare splenik dendritik hücrelerinin şu anda bilinen tüm ana alt kümelerinin izolasyonu için yüksek verimli, yüksek verimli bir yöntem açıklıyoruz.

Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Biz pDC fonksiyonel çalışmalar için, lupus-eğilimli farelerin kemik iliğinden, yüksek saflıkta plazmasitoid dendritik hücreleri (PDC) izole etmek için sıralama floresans ile aktive edilmiş hücre kullanarak bir protokol sunulmuştur.

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Biz nasıl tanımlanmasını ve yalıtılmasını miyeloid ataları fare kemik iliği bir manyetik kombinasyonu ve floresan (MAC'ler ve FACS) sıralama kullanarak üzerinden 6 alt kümelerini göstermek. Bu iletişim kuralı vitro kültürü deneyleri (methylcellulose ya da sıvı kültürleri), in vivo evlat edinen transfer deneyler ve RNA/protein analizleri için kullanılabilir.

Kimlik ve yalıtım Oligopotent ve Lineage için kabul edilen miyeloid ataları fare kemik iliği dan

Hematopoetik kök hücre transplantasyonu (HKHT) genetiği hematopoetik hücrelerin kötü huylu potansiyelini değerlendirmek için nasıl kullanılacağını açıklar. HKHT çeşitli malign hematopoetik hücrelerin vivo içinde değerlendirmek için hem de Roman terapiler değerlendirmek için büyük bir kohort myelodisplastik sendrom (MDS) veya lösemi ile farelerin üreten yararlıdır.

Hematopoetik kök hücre transplantasyonu myelodisplastik sendromu kökeni değerlendirmek için kullanımı

Biz burada pre-harekete geçirmek CD8 sitotoksisite araştırmak için bir protokol tarif+ T hücreleri kanser hücrelerine karşı apoptotik kanser hücreleri aracılığıyla gerçek zamanlı mikroskobu tespit ederek. Bu protokol mekanizmaları myeloid hücre kaynaklı T hücre bastırma arkasında araştırmak ve T hücreleri ile abluka bağışıklık baskılayıcı myeloid hücre yenileyici amaçlı bileşikler değerlendirmek.

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

Burada, kolumnar manyetik aktive hücre sıralamayı kullanarak, demiyelinizan hastalıkların hayvan modellerinde birincil mikrogliayı izole etmek ve saflaştırmak için bir protokol sunuyoruz.

Fare Primer Mikroglia'sının Hayvan Demiyelinasyon Modellerinde Manyetik-Aktif Hücre Sıralama ile İzolasyonu

Evlat edinen hücre transferi için farelerden alınan tümör infiltre lenfositleri (TIL'ler) akış sitometrisi yoluyla kullanmak için bir yöntem tanımladık. Bu protokol, sinjeneik pankreas kanseri fare modelinde tümörlere karşı TIL'lerin spesifik sitotoksisitesini doğrulamayı ve pankreas kanseri için evlat edinen hücre tedavilerinin geliştirilmesine ilişkin içgörüler sağlamayı amaçlamaktadır.

Pankreas Kanserinin Bir Fare Modelinde Tümör İnfiltre Eden Lenfositlerin Flow Sitometri Tabanlı İzolasyonu ve Terapötik Değerlendirmesi

Miyokard dokusunda gerginlik gibi parametreleri ölçmek için doğru ve pratik bir yöntem gösterilmiştir beri, bu zorlanma, sık kullanılan parametre EF daha kontraktil disfonksiyon için daha duyarlı ve daha önceki bir belirteçtir, büyük klinik değeri.

Özellik Takibi Manyetik Rezonans Türetilmiş Miyokard Gerinim Değerlendirmesi

Beyin tümörü başlatan hücreler (BTICs), heterojen bir tümör sahip kök hücre özellikleri içinde nadir hücrelerinin tanımlanması insan beyin tümörü patogenezinde sağlayan yeni anlayışlar içine. Biz BTICs için zenginleştirmek özgü kültür koşullarının rafine var ve biz rutin daha bu popülasyonların zenginleştirmek için flow sitometri kullanın. Tek hücre RT-PCR ile kendini yenileme analizleri ve transkript analiz sonra bu izole hücreler üzerinde de yapılabilir.

Sıralama Kök Hücre Tahliller ve Akış Primer Beyin Tümörü Doku İşleme

Öğrenin fare dalaklarından myeloid türevi bastırıcı hücreleri (MDSC) izole etmek için akım sitometri ve AutoMACS hücre sıralama yöntemlerini. Bu teknik canlı Gr-1+ lökositleri hızla zenginleştirir.

Akım Sitometri ve Otomatik Manyetik Aktif Hücre Sıralama (AutoMACS) kullanarak Naive ve Pankreas Tümör taşıyan fareler ile myeloid türevi bastırıcı hücreler (MDSC) hazırlanması (Video) | JoVE Journal

Akım Sitometri ve Otomatik Manyetik Aktif Hücre Sıralama (AutoMACS) kullanarak Naive ve Pankreas Tümör taşıyan fareler ile myeloid türevi bastırıcı hücreler (MDSC) hazırlanması

Daha fazla video keşfet