Akım Sitometri ve Otomatik Manyetik Aktif Hücre Sıralama (AutoMACS) kullanarak Naive ve Pankreas Tümör taşıyan fareler ile myeloid türevi bastırıcı hücreler (MDSC) hazırlanması

Aşağıdaki deneyin genel amacı, in vivo ve in vitro analizlerde kullanılmak üzere fare dalaklarından canlı myeloid kaynaklı baskılayıcı hücreler veya mDSC'ler içeren, GR1 pozitif olarak zenginleştirilmiş bir lökosit popülasyonunu hızla oluşturmaktır. İlk olarak, birkaç fareden alınan dalaklar birleştirilir ve tek hücre süspansiyonu oluşturmak için işlenir. Zenginleştirme öncesindeki mDSC yüzdesini belirlemek için, birleştirilen hücrelerin küçük bir alikotu 96 kuyuklu V tabanlı bir plakaya aktarılır.

MAC-1 ve GR-1 yüzey antijenleri işaretlenir ve işaretli hücreler akış sitometrik analiz için faks tüplerine aktarılır. Geriye kalan havuzlanmış lökositler, GR-1'e karşı florokrom konjuge bir antikorla boyanır ve anti-GR-1 antikorundaki florokroma bağlanan manyetik mikroboncuklarla inkübe edilir. Ardından, popülasyonun GR-1 zenginleştirme başarısını değerlendirmek için bir AutoMax pro separatör kullanılarak GR-1 pozitif ve GR-1 negatif popülasyonlar birbirinden ayrılır.

MDSC yüzdelerini değerlendirmek için küçük bir alikot alınır ve GR one ile MAC one ekspresyonu açısından analiz edilir. Elde edilen immünofenotipleme verilerinin karşılaştırılması, GR one ile zenginleştirilmiş lökosit popülasyonunda, zenginleştirilmemiş popülasyona kıyasla MDSC yüzdelerinde bir artış olduğunu göstermektedir. Ek olarak, naive MDSC'lerde meydana gelen artış, tümör taşıyan MDSC'lerle karşılaştırılabilir bir popülasyon oluşturmaktadır.

Bu tekniğin, konvansiyonel akış boyama ve lenfoid dokulardan mDSC'lerin yüksek hızlı akış sitometrisi tabanlı ayrıştırılması gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, master mix tekniğimizin havuzlanmış lökositlerin eşit yüzey boyamasını, sırasıyla fenotiplemeyi ve mDSC'ler ile GR1 pozitif hücrelerin AutoMax ile ayrıştırılmasını sağlayarak sonuçlarımızdaki önemli varyasyonları önlemesidir. Prosedürleri, laboratuvarımızdan lisansüstü öğrencisi Nadine Nelson ve USF akış sitometrisi merkez tesisi direktörü Dr. Haw srale gösterecektir. Aşağıdaki prosedür, hücreler ve antikorlar buz üzerinde tutularak, biyolojik güvenlik kabini altında steril bir ortamda gerçekleştirilmelidir.

Mümkün olduğunda, hücre ayrıştırma eleğini, gözenekli ekranı kabın alt kısmına doğru olan açıklığına yerleştirerek monte edin. Ardından, sabitleme halkasını, yuvalı tarafı yukarı bakacak şekilde dişli bölgeye yerleştirin ve ekranı sabitlemek için halka anahtarını kullanarak sabitleme halkasını sıkın. Monte edilen eleği, 10 milliliters XPBS havuzu içeren bir Petri kabına yerleştirin.

Altı ila sekiz haftalık tümör taşıyan veya naif kontrol C 57 black six farelerinden alınan dalakları hücre ayrıştırma eleğinin gözenekli ekranına yerleştirin. Ardından, dalakları cam havan eli kullanarak gözenekli ekran üzerinden petri kabına ezerek geçirin. Bu işlemi her fare tedavi grubu için tekrarlayın.

Ardından, beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak hücre süspansiyonunu 70 mikronluk bir hücre süzgecine uygulayın ve 50 mililitrelik konik bir tüpe filtrelenmesini sağlayın. 250 ile 300 ×g arasında beş dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı uzaklaştırın ve dalak başına beş mililitre RBC lizis tamponu ekleyip kuvvetlice pipetleyerek peleti yeniden süspande edin; oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, 20 mililitre PBS ekleyip kuvvetlice pipetleyerek reaksiyonu durdurun.

Ardından, süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra 250 ila 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin, peleti 20 mL steril PBS içerisinde çözün ve hücreleri sayın. Trian blue ve bir hemositometre kullanarak hücreleri %3'lük boyama ortamında 1 × 10⁷ ile 2 × 10⁷ hücre/mL konsantrasyonda resüspande edin. Optimal boyamanın sağlanması, bu prosedürün en zor kısmıdır.

Bu işlem, antikorların önceden titre edilmesiyle başarıyla gerçekleştirilebilir. Bu protokolde açıklandığı üzere, master mix hazırlama ve yüzey boyama işlemlerini küçük hacimlerde uygulayın. Hücreleri akış sitometrik analiz için boyamak amacıyla, bir 96 kuyucuklu vbo plakasının kuyucuklarını kontrol ve deney örnekleri ile tekli boyamalar için etiketleyin.

Kompanzasyon kontrolleri için, etiketli kuyucukların her birine 50 µL hacimde 5 × 10⁵ ile 1 × 10⁶ arası hücre ekleyin. Ardından plakayı 250 ila 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve santrifüj işleminden sonra plakayı alttan görüntüleyin.

Kuyucuklarda pelletlerin bulunduğundan emin olmak için kontrol ederek, buz üzerinde 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde, %3'lük boyama ortamında seyreltilmiş sıçan anti-mouse CD163 monoklonal antikor içeren bir mouse BDFC blok ana karışımı hazırlayın ve vorteksleyin. Ardından, 96 kuyucuklu V tabanlı plakayı bir atık kabı veya lavabo üzerinde tutarak beş saniye boyunca kısa süreliğine santrifüjleyin. Hücre pelletlerini bozmadan süpernatantı uzaklaştırmak için plakayı hızlıca ters çevirip tekrar düzeltin.

Ardından, 96 kuyucuklu V tabanlı plakadaki tüm peletlere 50 µL FC blok master mix ekleyin ve nazikçe pipetleyerek karıştırın. Plakayı buza yerleştirin ve karanlıkta 15 dakika inkübe edin, ardından plakayı 250 ila 300 ×g'de beş dakika santrifüjleyin. Buz üzerinde 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü içerisinde, %3'lük boyama ortamında seyreltilmiş Mac one fitzy ve GR one A PC antikorlarından oluşan bir master mix hazırlayın.

Beş saniye boyunca kısaca vorteksleyerek santrifüjleyin. Santrifüj sonrası, her kuyucuktaki süpernatantı uzaklaştırmak için plağı ters çevirin, ardından kontrol veya deney pelletlerine 50 µL antikor karışımı ekleyin. Tekli boyama kompanzasyonları için, uygun kuyucuklara %3'lük boyama ortamında dilüe edilmiş 50 µL MAC1-FITC, GR1-APC veya DPI ekleyin ve nazikçe pipetleme yaparak iyice karıştırın. Boyanmamış kontrol için, uygun kuyucuğa 50 µL %3'lük boyama ortamı ekleyin ve karıştırın.

Ardından plakayı buz üzerinde, karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sırasında, plakanın her bir kuyuna karşılık gelecek şekilde fax tüplerini etiketleyin ve her bir fax tüpüne 200 µL %3'lük boyama ortamı ekleyin. 30 dakikalık inkübasyon süresi dolduğunda, plakayı 250 ila 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Santrifüjden sonra, süpernatanları önceki gibi uzaklaştırın. Ardından, her bir pelete 100 µL %3'lük boyama ortamı ekleyerek peletleri yıkayın. Nazikçe pipetle yukarı-aşağı çekerek iyice karıştırın.

Plakayı beş dakika daha santrifüjleyin. Santrifüjleme sonrası yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın, natini daha önce olduğu gibi uzaklaştırın ve her bir peleti 100 µL %3'lük boyama ortamında yeniden süspande edip iyice karıştırın. Ardından, plakanın her bir kuyusundan yeniden süspande edilen hücrelerden 100 µL'lik kısımları ilgili olarak etiketlenmiş fax tüplerine aktarın.

Ardından, kontrol ve deney numuneleri ile DPI tekli boyama kompanzasyon kontrolüne 75 nanograms per milliliter DPI ekleyin. Yanındaki belgede açıklandığı üzere MDSC yüzdelerini belirlemek için sitometrik veri alımını gerçekleştirin; ardından, GR1 pozitif lökositlerin zenginleştirilmiş bir aliquot'unu (kalan boyanmamış lökositlerin 1 times 10 to the seventh katı kadar) uygun şekilde etiketlenmiş FACS tüplerine aktarın ve 250 to 300 times G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Max tamponu içerisinde 1 to 10 dilüsyonunda 50 microliters GR1 PE antikoru ekleyin ve 4 degrees Celsius'te, karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, her bir faks tüpüne iki mililitre max tamponu ekleyin ve 250 ile 300 ×g arasında beş dakika boyunca santrifüj edin. Santrifüj işleminden sonra süpernatantı uzaklaştırın. Ardından, her tüpe max tamponu içerisinde 1/4 oranında dilüe edilmiş 200 µL anti PE mikroboncuk ekleyin ve 4 °C'de karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin.

FAX tüplerine iki mililitre max tamponu ekleyin ve 250 ile 300 ×g arasında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından peleti üç mililitre boyama tamponu içinde yeniden süspande edin ve 70 mikronluk bir süzgeçten geçirerek yeni etiketlenmiş 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Bu protokolde otomatik manyetik ayırma kullanıyoruz.

Manyetik ayırma yöntemleri arasında harika bir seçimdir. Çok sayıda hücreyi hızlı, maliyet etkin bir şekilde ve bir yüzey belirtecine dayanarak ayırmanız gerekiyorsa, işlemin sonunda sonuçlarınızı akış sitometrisi ile kontrol ettiğinizden emin olun. AutoMax pro ayırıcıyı hazırlamak ve başlatmak için tüm şişelerin uygun çözeltilerle dolu olduğundan emin olun.

Cihazı açın. Ardından, başlatma işlemi tamamlandıktan sonra sıvı kaplarının ve kolonların durumunu inceleyin. Tüm semboller yeşil olmalıdır.

Sırada, üst menü çubuğundan separation seçeneğini ve ardından wash seçeneğini belirleyin. Şimdi alt menü çubuğundaki açılır seçeneklerden rinse seçeneğini belirleyin ve hazırlama işlemini başlatmak için run seçeneğine tıklayın. Hazırlama işlemi başarıyla tamamlandığında, cihaz ayrıştırma için hazır olduğunu gösterecektir.

Durum menüsü altından, manyetik olarak işaretlenmiş hücreleri içeren 50 mililitrelik konik tüpü uygun boyutlardaki soğutulmuş tüp rafının A sırasına yerleştirin. Ardından, negatif fraksiyon toplama için bir 50 mililitrelik konik tüpü B sırasına ve pozitif fraksiyon toplama için bir 15 mililitrelik konik tüpü C sırasına yerleştirin; örneklerden işaretli hedef hücrelerin hassas modda pozitif seçimi için POS hücre S hücre ayırma programını seçin. Program başladığında, manyetik olarak işaretlenmiş hedef hücreler AutoMax kolonunda tutulurken, işaretlenmemiş hücreler B sırasındaki negatif fraksiyon toplama tüpüne salınacaktır. Daha sonra mıknatıs geri çekilecek ve işaretli hedef hücreler tüp rafının C sırasındaki pozitif toplama tüpüne salınacaktır.

Zenginleştirme işleminden sonra, GR1 pozitif ve GR1 negatif fraksiyonlarını yeniden saymak için trypan blue ve bir hemositometre kullanın. Ardından hücreleri, %3'lük boyama ortamında mL başına 1x10⁷ hücre ile 2x10⁷ hücre arasında olacak şekilde yeniden süspande edin ve 50 µL'yi uygun şekilde etiketlenmiş FACS tüplerine aktarın. Akış sitometrisi ve tekli boyama kompanzasyonları için hücreleri MAC-1 ve DPI canlılık boyaları ile boyayın.

GR1 pozitif ve GR1 negatif yüzdelerini belirlemek ve ayrıca AutoMax öncesi ve sonrası MDSC yüzdelerini karşılaştırmak için akış sitometrik veri alımı gerçekleştirin. Dalaklar, pankreas tümörlü ve naif farelerden toplandı ve bu video makalesinde açıklandığı gibi tek hücreli süspansiyonlar haline getirildi. Burada gösterildiği gibi, MAC1 ve GR1 floresan konjuge antikorlarla yüzey boyaması yapılmış naif lökositleri incelemek için akış sitometrisi uygulandı; AutoMax zenginleştirmesi öncesinde, naif MAC1 ve GR1 pozitif MDSC'lerin yalnızca çok düşük bir yüzdesi, %1,19 görülmektedir. Ancak, GR1 pozitif popülasyonunun zenginleştirilmesinin ardından, bu hücre alt popülasyonu naif farelerdeki %10,5 ile anlamlı derecede daha büyüktür ve artık tümör taşıyan farelerdeki %25,3 ile kıyaslanabilir düzeydedir.

Bu prosedürü takiben, MDSC genişlemesi, migrasyonu ve diferansiyasyonu ile bağışıklık yanıtlarını baskılama özelliklerinden sorumlu moleküler mekanizmalara ilişkin ek soruları yanıtlamak için hızlandırılmış MDSC, akış sitometrisi tabanlı sıralama, in vivo transfer deneyleri, kantitatif gerçek zamanlı PCR ve western blotting dahil olmak üzere diğer yöntemler uygulanabilir.