Biyomarker Discovery için Mezogözenekli Silika İnce Filmler üzerine düşük molekül ağırlıklı Protein Zenginleştirme

Bu prosedürün genel amacı, insan serumundan düşük moleküler ağırlıklı proteinlerin ve peptitlerin seçici olarak geri kazanılması için mezo gözenekli silika ince filme dayalı bir teknoloji geliştirmektir. Bu, önce mezo gözenekli silika ince film yongalarının üretilmesi ve oksijen plazma külü ile ön işleme tabi tutulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, serumun basit bir ön işlemini gerçekleştirmek ve daha sonra serumdaki düşük moleküler ağırlıklı proteinleri ve peptitleri çip üzerinde fraksiyonlama ile zenginleştirmektir.

Çipten düşük moleküler ağırlıklı proteinlerin ve peptitlerin elucian'ını takiben, moleküller, uçuş kütle spektrometresinin matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon süresi kullanılarak profillenir. Son adım, veri analizi yapmak için profesyonel yazılım kullanmaktır. Sonuç olarak, kütle spektrumları ve istatistiksel analiz sonuçları, düşük moleküler ağırlıklı proteom hasadının özgüllüğünü ve etkinliğini ortaya koymaktadır.

Bu tekniklerin ana avantajı veya 2D sayfa Batı kanı gibi mevcut teknoloji, serumdaki düşük miktarda bulunan düşük moleküler ağırlıklı proteinleri ve peptitleri zenginleştirmek için güçlü bir kapasite, yüksek verim ve zaman verimliliği, serum numunesi gereksinimlerinin azaltılması ve düşük maliyet. Bu prosedürün en zorlu yönlerinden biri, PO boyut dağılımı, PO gemisi ve zayıf ara bağlantı gibi bir Nanopore ağ morfolojisini kontrol etmektir. Çünkü bu özellik, bir profil oluşturma hedef kan imzasının hassasiyetini ve özgüllüğünü belirler.

Egzersizi sağlamak için, başlangıç malzemesinin model oranını dikkatli bir şekilde kontrol etmeyi ve çip için kaplama çözeltisini oluşturmak için talimatı tam olarak takip etmeyi amaçlıyoruz. Hidrolize silikat öncü çözeltisini yaparak başlayın. 14 mililitre teos'u 17 mililitre 200 geçirmez etanol, 6.5 mililitre deiyonize su ve 0.5 mililitre altı molar hidroklorik asit ile güçlü bir şekilde karıştırarak karıştırın.

Güçlü karıştırmaya devam edin ve elde edilen çözeltiyi iki saat boyunca 80 santigrat derecede ısıtın. Daha sonra, seçilen polimer çözeltisini oda sıcaklığında 10 mililitre etanole kuvvetlice karıştırarak ekleyerek üç bloklu kopolimer çözeltisini hazırlayın. Bu gösterimde onic F1 27 kullanılmıştır.

Silikat çözeltisini bu üç bloklu kopolimere ekleyerek ve ardından oda sıcaklığında iki saatlik güçlü bir şekilde karıştırarak karışımı tamamlayın. Elde edilen kaplama çözeltisinin bir mililitresini, 20 saniye boyunca 1.500 RPM hızında sıkma kaplaması ile dört inçlik bir silikon gofrete uygulayın. Ardından, gofreti 12 saat boyunca 80 santigrat derecede ısıtın.

Daha sonra 425 santigrat dereceye ulaşılana kadar sıcaklığı dakikada bir santigrat derece yükseltin ve bu sıcaklıkta beş saat pişirin. Ardından, elde edilen mezo gözenekli silika veya MPS çip yüzeyini oksijen plazma külü ile ön işleme tabi tutun. Ardından bir oksometre kullanarak film kalınlığını ve gözenekliliği ölçün.

Bu arada, her serum örneğine, %0.01'lik bir nihai konsantrasyona tri floro asidik asit ve %5'lik bir nihai konsantrasyona asetil nitril ekleyin, ardından bu örnekleri oda sıcaklığında bir masa girdabı çalkalayıcı üzerinde 30 dakika çalkalayın ve ardından cipslerin gece boyunca 160 derecelik bir fırında önceden pişirilmesini takip edin. Çipin yüzeyinde olabilecek parçacıkların tozunu almak için basınçlı hava kullanın. Kapak kızağını %100 etanol ile temizleyin ve numune kuyucuklarını oluşturarak NPS çip yüzeyine yerleştirin.

Çip ile tam bir sızdırmazlık sağlamak için kapak kızağını forseps ile aşağı doğru bastırın. Ardından, her birine 10 mikrolitre serum örneği pipetleyin. Düşük moleküler ağırlıklı proteinlerin inkübasyondan sonra gözeneklere girmesine izin vermek için oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada 30 dakika inkübe edin, serumu kuyucuklardan aspire edin ve atın.

Daha sonra, daha büyük proteinleri yıkamak için her bir kuyucuğa 10 mikrolitre deiyonize su pipetleyin. Bir seferde yalnızca bir ila iki kuyucukla çalışarak bu yıkamayı dört kez tekrarlayın. Buharlaşmayı hızlı bir şekilde önlemek için, her numuneye beş mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin.

Karıştırmak için pipet ucunu kuyu içinde hareket ettirirken 30 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Karıştırdıktan sonra, tüm elucian tamponunu aspire edin ve matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon süresi gerçekleştirmeye hazır olana kadar bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin, numunenin 0.5 mikrolitresini MALDI hedef plakasına yerleştirmek için uçuş analizinin süresi ve kurumasını bekleyin, ardından 0.5 mikrolitre matrisi %0.1 TFA içeren %50 aseto nitril içinde lekeleyin ve bir sonraki noktanın birlikte kristalleşmesine izin verin, Kalibrasyon noktasına 0,5 mikrolitre kalibrasyon solüsyonu. Kuruduktan sonra, hedef plakayı maloff kütle spektrometresine yerleştirin.

Makine, numune başına 4.203.000 atış lazer yoğunluğu ile pozitif reflektör moduna gönderilmelidir. İlk olarak, analizi 2000 Dalton hedef kütlesi olan 800 ila 5.000 Dalton arasında seçilmiş bir kütle aralığı ile gerçekleştirin. Daha sonra aynı MALDI toff analizini doğrusal modda gerçekleştirin, ancak kütle aralığını 900 ila 10.000 Dalton veya hedef kütlesi 5.000 Dalton olan 3000 ila 70.000 Dalton olarak değiştirin.

Çoklu üst analizin ardından, ham spektrumları dönüştürme tepe listesi yazılımıyla işleyin ve ardından spekülasyona aktarın. Ön işleme için yazılımı hizalayın: hızlı Fourier dönüşümü veya P-A-F-F-T korelasyon yöntemi ile tepe hizalamasını kullanarak tüm spektrumları hizalayın ve yoğunlukları toplam iyon akımına göre normalleştirin. Tepe algılamayı, iki yükseklik oranı ve kütle penceresinin %0,3'ü ile gerçekleştirin.

Analizden önce taban çizgisini düzeltin ve negatif değerleri kaldırın. T 2D dosyalarının işaretçi görünümüne içe aktarılması, farklı grupların maldi verilerinin denetimli olarak işlenmesi için ilk adımdır. İşaretleyici görünüm yazılımını açarak başlayın, ardından T 2D dosyalarını içe aktarın.

T 2D dosyalarını içeren klasörü seçin ve spektrum işleme için parametreleri ayarlayın. Ardından, örnek tabloyu açın. Aynı gruptan örnekleri vurgulayın ve bir grup etiketi tasarlayın.

Toplam alan toplamlarını kullanarak örnekleri normalleştirin. Ardından seçenekler penceresini açın. Her grup için benzersiz bir renk ve sembol ayarlayın.

Daha sonra temel bileşenler analizi ve aktif veriler için T-testi gerçekleştirin, örnekler PC bir ve PC iki puanlarına göre farklı gruplara ayrılır. Biyobelirteç adayları, seçilen pikler için çizim profillerine tıklanarak seçilen biyobelirteçin yoğunluk profilinin özetini gösteren PC yükleme grafiklerine göre bulunacaktır. Daha büyük değerlere sahip noktalar farklı grupları ayırt edebilir.

Grupları bir T-testi ile karşılaştırdıktan sonra, burada gösterilen çeşitli grupları ayırt edebilen tepe noktalarını belirlemek için tabloyu artan P değerlerine göre sıralayın, 900 ila 10.000 Dalton aralığındaki peptitler için serum örneğinin MS spektrumları ve 3000 ila 70.000 Dalton aralığındaki proteinler için. İşlenmemiş numunelerin spektrumları, MPS ince filmleri tarafından fraksiyonlandıktan sonra albümin gibi iyi iyonize olmuş, yüksek oranda yüksek moleküler ağırlıklı proteinlerin varlığına bağlı olarak düşük moleküler ağırlıklı bölgedeki sinyal baskılanmasını göstermektedir, büyük moleküllerin çoğu tükenmiştir, bu da düşük moleküler ağırlıklı bileşenlerin önemli ölçüde zenginleşmesine neden olur. Kontrol olarak, aynı serum örneği gözeneksiz saf silika bir yüzeye uygulandı.

Düşük moleküler ağırlıklı proteom geri kazanımı için MPS ince filmlerinin özgüllüğünü değerlendirmek için, gözeneksiz silikadan önemli ölçüde peptit veya protein toplanması olmamıştır. Bu nedenle, LMWP'nin zenginleşmesinde baskın faktörü oluşturan silika yüzey afinitesi değil, mezo gözenekli mimari olduğu sonucuna varılabilir. Farklı hidrofobik blok uzunluklarına sahip kopolimerlerin kullanılmasıyla gözenek boyutunda hassas bir şekilde kontrol edilen varyasyonlar elde edilebilir.

Gözenek boyutunun LMW peptidi ve protein geri kazanım etkinliği üzerindeki etkisi, hidrofobik ve hidrofilik bileşenlerin farklı hacim oranlarına sahip dört onik yüzey aktif maddeden hazırlanan MPS ince filmler kullanılarak araştırıldı. Burada, gözenek boyutuyla ilişkili olarak her bir MPS çipinin karakteristik moleküler kesimini gösteren maldi spektrumlarının büyütülmüş bir görünümü gösterilmektedir. Gözenek boyutları aralığı, boyut ve şekil dışlama yoluyla aynı serum örneğinden farklı bir peptit ve protein repertuarının geri kazanılmasına yol açtı.

Bu, farklı çipler arasındaki peptit karışımı özelliklerinin iki yönlü hiyerarşik kümelenmesinde de gözlemlenebilir. Kırmızı veya sarı rengin yoğunluğu, nispi peptit konsantrasyonunu gösterir. Daha büyük gözenekler, daha büyük peptitlerin toplanmasını arttırırken, küçük peptitler tercihen daha küçük gözenekli cipslerden geri kazanıldı.

Benzer por boyutu dağılımlarına sahip onik F1 27 gibi yüksek moleküler ağırlıklı üç bloklu kopolimerler kullanılarak oluşturulan farklı MPS ince film periyodik nanoyapıları, öncü çözeltideki polimer yapısının ayarlanmasıyla elde edilebilir. 3D kübik ve bal peteği altıgen nanoyapılar, daha arzu edilen nanopor ara bağlantısına ve daha erişilebilir nanopor morfolojisine sahiptir. Sonuç olarak, seçici olarak zenginleştirilmiş LMW peptitlerinde, ardından 2D altıgen yapıda üstün performans sergilerler.

Benzer gözenek boyutu dağılımlarını ve serum fraksiyonasyonu için aynı moleküler kesimi paylaşmalarına rağmen durum böyledir. Organy şeridinin MPS çipleri üzerindeki konjugasyonu, çip yüzeyine ön işlem yapmak için oksijen plazma küllemesi eklenerek kolaylaştırıldı. Bu şekil, işlevselleştirilmiş yongalar üzerinde seçici olarak yakalanan peptitlerin MS algılama yoğunluğunun bir çubuk grafiği aracılığıyla farklı yüzey işlevlerine sahip yongalar için yüke özgü geri kazanımı göstermektedir.

İzoelektrik noktalarına göre, peptitler, yüksek moleküler ağırlıklı proteinlerin tükenmesinin yanı sıra pH 7.0'da pozitif veya negatif olarak yüklenir. Sonuçlar, NPS'nin yapısal tasarımının ve kimyasal işlevselleştirilmesinin, peptit zenginleştirmesinin özgüllüğünü daha da artırdığını göstermektedir. Bu gelişme ile.

Bu tekniğin, proteomik alanındaki araştırmacıların, insan ve hayvan modelinden vücut flütünde erken tanı veya terapötik değerlendirme için yeni biyobelirteçleri keşfetmesinin önünü açmasını bekliyoruz. Sonuç olarak, ızgara majör hastalığın kişiselleştirilmiş tedavisini geliştirdi.