Name: Polianhidrid Nanopartiküller Bağlı Mürin Alveoler Makrofajlar Hasat ve Değerlendirme Hücresel Etkinleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Öğrenin, fare alveoler makrofajlarını bronkoalveoler lavaj ile izole edip polianhidrid nanopartiküllerle aktive etme yöntemini. Akış sitometrisi ile yüzey belirteçleri analiz edilerek immünoloji ve biyomalzemeler araştırmalarına katkı sağlanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar için Iowa State University Akım Sitometri Tesisi mali destek ve Dr Shawn Rigby için ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Malzeme Komutanlığı (Grant Numaraları W81XWH-09-1-0386 ve W81XWH-10-1-0806) teşekkür etmek istiyorum Onun uzman teknik yardım.

1. Akciğer Lavaj kullanarak Mouse Alveoler Makrofajlar (AMɸ) Hasat <ol><li> Böyle bir laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık eldivenler, ve uygun göz koruması gibi uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) giyiniz. </li><li> Hasat başlamadan önce tam AMɸ (cAMɸ) orta hazırlayın. Penisilin / streptomisin Dulbelcco en Modified Eagle Medium (DMEM) ile 222,25 mL (kalem / Strep) çözeltisi, β-merkaptoetanol, 250 uL (2-merkaptoetanol), ve ısı inaktive edilmiş fetal bovin serumu (FBS) ve 25 ml 2.5 ml ilave edilir. Vakum altında 0.2 mikron gözenek büyüklüğüne şişe top filtre kullanarak cAMɸ orta Filtre-sterilize edin. </li><li> Bir euthanization odasında CO 2 boğularak sağlıklı bir fare Euthanize. Bir C57BL / 6 fare (6-8 haftalık) Proje amaçlar için kullanılmıştır, ancak bu akciğer lavaj tekniği fare herhangi suşu üzerinde gerçekleştirilebilir. Basınçlı gaz tüpleri kullanarak, ch fare vermeden önce 1 dakika için odasına gaz akışını izinodasının tamamen CO 2 ile dolu olduğundan emin olmak için sarı yanar. Fare euthanize için en az bir dakika boyunca odasında fare yerleştirin. Buna ek olarak, 1.4 &#39;te tarif edildiği gibi fare ölümü teyit etmek için bir yöntem, fiziksel olarak kalp ponksiyonu ile her fareden asıl bulbus olfaktoryusları alındı. </li><li> Arka (sırt tarafı),% 70 etanol ile sprey fare Lay, sternum bulup, karından 30 derecelik açıyla, göğüs boşluğuna 50 mm, 23 gauge iğne (1 ml şırınga bağlı) takın . Iğnenin doğru yerleştirilmesi ile, fare büyüklüğüne bağlı olarak kan 1-0,4 arasındaki mL toplamak için mümkün olacaktır. Vital bulguların kesilmesi için hayvan inceleyin. </li><li> Onun karın (ventral tarafı) yatıyor böylece laboratuarlarında Yeri fare. Çalışma ortamı sterilize etmek için% 70 etanol ile Sprey fare. Yaklaşık yarım fare omurga aşağı cilt Pinch. % 70 etanol ile sterilize edilmiştir diseksiyon makas kullanarak, deri yoluyla küçük bir kesi yapmak. &lt;/ Li&gt; <li> Kesi her iki tarafında cilt kap ve fare beyin-kaudal ekseni boyunca zıt yönlerde cilt çekme. Doğru yapıldığı zaman, cilt alttaki karkas silinecektir. </li><li> Fare boyun şimdi maruz kaslar ve bezlerin göstermelidir. Dikkatle bu doku kesme ve böylece fare gırtlak, soluk borusu, yemek borusu açığa forseps kullanarak fare öne doğru çekin. Juguler ven veya karotis arter kesme kaçının. </li><li> Trakea şimdi görünür ve çevresinde kıkırdak halkaları ile doku olarak tanımlanabilir. Hafif forseps ile trakea tutun ve yavaşça kaldırın ve sırt tarafında bulunan yemek borusu, gelen trakea ayırın. </li><li> Bir trakea ancak larinks posterior tuttuğu yerde küçük bir kesi anterior olun. Kesi yaklaşık 45 ° derecelik açıyla yapılmalıdır. Ayrıca, tamamen bu içine geri çekme önlemek olacak şekilde, trakea transect yokvücut boşluğu. </li><li> Trakea lümenine kateter eklemek için hazırlık steril PBS ile bir Tom Cat kateter takılmış 1 cc şırınga doldurun. Forseps kullanarak trakea tutun ve elinizle kontrolünü artırmak ve yavaşça trakeal kesi eklemek için yakın uç kateter tutun. Yavaşça 20 mm trakea içine kateter yerleştirin. Diğer taraftan serbest bırakarak, kateter tüpünün etrafında olan trakea boğulacak. </li><li> Kateter takılmış 1 ml şırınga yavaşça akciğerlere oda sıcaklığında, steril PBS 0.75 mL demini aldıktan sonra yavaşça PBS geri enjektöre aspire. Dışarıdan göğüs masaj yaparken bu işlemi üç kez tekrarlayın. Kateterden şırınga çıkarın ve 15 ml santrifüj tüpüne lavaj akıtın. Taze PBS 0.75 ml şırınga doldurma ve kateter için şırınga yeniden bağlamadan sonra, her bir fare için iki kez adımları 1.9 ve 1.10 tekrarlayın. Akışkan kurtarma az vo daha elde edilmesi, kısmi olabilirLume aşılamıştır. Birden fazla fareden hücreleri toplanması durumunda bütün akciğer yıkamasına yapılıncaya kadar, buz üzerinde toplanmış hücreleri ile 15 ml yerleştirilir. </li></ol> 2. Akciğer Lavaj AMɸ Hasat İşleme <ol><li> 4 azından 10 dakika için 250 ° C. x g&#39;de santrifüje akciğer lavaj </li><li> Bir biyogüvenlik kabini içinde uygun bir atık kabı içine steril tekniği, aktarmak süpernatant kullanma. Hafifçe bir test tüpü raf üstünde santrifüj tüpüne yan yatan tarafından hücre pelletini. Hücreleri yeniden süspanse etmek cAMɸ ortamın 1 ml ilave edilir. </li><li> Coulter sayacı flakonda ISOTON II Diluent 10 ml içine hücrelerin 20 uL pipetleme bir Coulter Partikül Sayıcı Z1 kullanarak hücrelerin numaralandırılamıyor. , Şişeye Zap-oglobin II Parçalayıcı reaktif, 3 ila 4 damla yavaşça çevirin 3 ila 4 kez ve daha sonra bir hücre konsantrasyonunu elde etmek için tezgahın üzerine örnek şişesine yükleyin. Görüntülemek için 2 x 10 4 bir seyreltme faktörü ile karşı programlamak emin olunmL başına hücre sayısı olarak hücre konsantrasyonunu. </li><li> CAMɸ orta kullanarak ml başına 2.5 x 10 5 hücreleri sulandırınız. </li><li> Bir 6-de doku kültürü çanağı her oyuğuna 2.5 x 10 5 hücre / mL &#39;lik 2 mL dağıtın. </li><li> Hücrelerin hem alt yapışma sağlamak için 6 saat süreyle% 5 CO2 içeren bir atmosfer 37 ° C nemlendirilmiş inkübatöründe içindeki AMɸ, inkübe kültür tabakları zenginleştirmek. Hafifçe yapışık hücreleri bozmayacak şekilde süpernatant aspire. </li><li> Yapışmaz hücreleri ve enkaz kaldırmak için steril PBS (kalsiyum ve magnezyum ücretsiz) kullanarak kuyu durulayın. Her bir kuyucuğa cAMɸ orta 2 ml ilave edilir. </li><li> Uyarıcılar ilave edilmeden önce, bir% 5 CO2 içeren bir atmosfer 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör içerisindeki bir gece boyunca inkübe hücreleri. Bu zenginleştirme adımdan sonra, hücreler, yaklaşık% 87 makrofaj belirteçler CD11b ve F4/80 (Şekil 2C) pozitiftir. </li></ol> 3. Polyanhydrid ilavesie Nanopartiküller ve Kontrol Tedaviler <ol><li> Polianhidrid anti-solvent nanoencapsulation 15 ile nanopartiküller imal. Bu süreçte, polimer metilen klorür içinde çözülmüştür (4 ° C&#39;de 25 mg / mL &#39;lik bir konsantrasyonda) ve pentan (a oranı 1:200 metilen klorür az -20 ° C: pentane) içinde çökeltilmiştir. </li><li> Sterilize doğru mikrogram miktarda ölçebilen bir denge kağıt ağırlığı kullanılarak polianhidrid nanopartiküller dışarı tartılır. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne parçacıkları ekleyin. </li><li> Buz cAMɸ yılında nanopartiküller yeniden süspanse edin. Hesaplamalar ortamın fazla 0.3 &#39;den mL Nanopartiküllerin istenen bir konsantrasyon elde etmek için, her oyuğa ilave edilir öyle yapılır. Nanopartiküller de kültüre eklenene kadar buz içinde tekrar süspanse edilir partikülleri tutmak. </li><li> Önce AMɸ kültürlere nanopartiküller ekleyerek, bir mikrotip bir tezgah üstü sonikatör kullanarak parçacıkların ses dalgalarına maruz. % 70 Etanol ve wipin püskürterek mikrotip sterilizesonikasyon steril bir Kimwipe ile g. Buz üzerine tüp tutarken 30-45 s için 10-20 jul azından sonikasyon. Makroskopik nanoparçacık süspansiyon gözlemleyin. Parçacıklar yeterince dağılmış değilse, süspansiyon nanopartiküller 30-45 sn için tekrar sonicating önce polimerin cam geçiş sıcaklığının altında olmasını sağlamak için 1-2 dakika boyunca buz üzerinde ayarlamak için olanak sağlar. Bu sonikasyon adımın hedefi yeterince 50:50 CPTEG olarak, nanopartiküller dağıtmak için olan: sulu bir ortamda maruz kaldığında CPH nanopartiküller toplam eğilimindedir. Ancak, Nanopartiküllerin bazı küçük agrega hala askıda kalabilir. </li><li> Nanopartikül süspansiyon (yeterince dağılmış) buz üzerinde tutulmalıdır ve erken yüzey erozyonu veya toplama önlemek için hemen kullanılmalıdır. </li><li> Inkübatör gelen AMɸ ve biyogüvenlik kabini yer içeren kültür kaplarına çıkarın. Medi miktarı kapalı yaklaşık 45 derecelik bir açı ve pipet de Tilt plakaum olduğu nanoparçacık süspansiyonu (it 0,3 mL geçmemelidir) eklenecektir. Orta çıkartırken yapışmış olan hücrelerin rahatsız etmeyin. </li><li> Vorteks önce uygun kuyulara eklemenin kısaca polianhidrid nanoparçacık süspansiyon. Belirli bir zamanda (s) içine nanoparçacık süspansiyonu (en fazla 0.3 &#39;den mL) miktarı Pipeti, ancak kadar Pipeti ve aşağı karıştırılması. Bu eylem kuyudan AMɸ yapışık kesebilirsiniz. Parçacıklar iyi dibe ve hücreler temas edecek. Bu rapor özetlenen çalışmaları için, Nanopartiküllerin son konsantrasyon AMɸ ile birlikte kültüre 125 ug / ml olmuştur. Sonraki kuyular ve istenilen tedavi grupları ile devam edin. Bu tür tek orta ve 200 ng / mL lipopolisakkarid (LPS) tayin kuyucuklara olarak pozitif ve negatif kontrol gruplarına içerir. </li><li> 37 ile kültür tabaklarında dönmek ° C&#39;de 48 saat boyunca bir% 5 CO2 inkübatöründe atmosfer ile nemlendirilmiş. Bizim Laboratuvar kinetik çalışmalarıy bu transkripsiyon ve meydana protein sentezi için yeterli bir zaman izin olarak hücre yüzey işaretleyici ifade ve sitokin salgı hem değerlendirmek için uygun kültürü periyodu olarak 48 saat göstermiştir. Sitokinlerin büyük seviyede uzun bir kültür dönemi (yani, 72 saat) boyunca biriktikçe, ancak bu zaman noktasında hücre yüzey işaretleyici ifade değerlendirilmeden sitokin seviyesi yüksek katkısı karmakarışık hale edilebilir. Yüzey işaretleyici ifadesinde değişiklikler nanopartiküller kendileri ile uyarılması ile doğrudan ilişki olmayabilir gözlenmiştir. </li></ol> 4. Akım Sitometri kullanarak AMɸ Aktivasyon Değerlendirilmesi <ol><li> Floresans-aktive hücre ayırma (FACS) tamponu (% 0.1 sodyum azit ve% 0.1 sığır serum albümini (BSA)) içinde 0.1 M fosfat önceden nanopartiküller o ile eş-kültüre edilmiştir kaplama makrofajlar hasat etmek (pH 7.4) tamponlu tuzlu hazırlamakr uyarıcılar. </li><li> Engelleme tampon ve monoklonal antikor çözeltileri çalışma hazırlayın. Blok tampon hazırlamak için, FACS tampon içinde, sırasıyla, sıçan IgG (Sigma) ve anti-CD16/32 (eBioscience) için 1 mg / ml ve 10 ug / mL seyreltik. Üreticinin tavsiye konsantrasyonu veya kullanıcı optimize konsantrasyonu birine FACS tampon yüzey işaretleyici antikor paneli sulandırınız. Bu çalışma sunulan sonuçlar için, işaretleyici yüzey paneli MHC II, CD86, CD40 ve Cire (CD209) karşı antikorlar oluşur. Makrofaj işaretleri F4/80 ve CD11b karşı anti-fare antikorları da olumlu veri analizi sırasında makrofaj fenotipi belirlemek için panel dahildir. Kendilenmiş fare suşları genellikle kendi MHC II haplotipleri farklı olarak, MHC II moleküllerine karşı antikorlar seçerken dikkatli olunmalıdır. Seçilen antikorlar ilgi fare suşu tarafından ifade spesifik MHC antijenlerdir ile reaksiyona gerekir. </li><li> 48 nanopartiküller ile inkübasyondan h ve / veya sonrauyarıcılar, 20 dakika boyunca buz üzerinde yer hücre kültürü yemekleri. Plakalardan yapışık makrofajlar kaldırmak için hafifçe 24 cm hücre kazıyıcı ile kuyu kazıyorum. </li><li> Bir 5 mL serolojik pipet kullanılarak, yavaşça tek bir hücre süspansiyonu elde etmek beş kez aşağı hücreleri ve orta yukarı ve aspire. Ayrı 5 ml polistiren tüpler içine bireysel kuyuların içeriğini Pipeti şekilde farklı deneysel tedaviler hücreleri birbirine karıştırmak değil. </li><li> Her tüpe FACS tamponu 2 ml ilave edilir. </li><li> 10 dakika süre ile 4 ° C&#39;de 250 x g&#39;de santrifüje hücrelerinin tüpler. </li><li> Durusu bir test tüpü raf üstünde tüpler yan yatan tarafından kalan sıvı içinde yüzen ve yavaşça Pastör pipetiyle hücre pelletini. </li><li> Monoklonal antikorların spesifik olmayan bağlanma önlemek için, hücreler her tüpe bloke edici tamponun 10 uL (4.2 &#39;de hazırlanan) ilave edilir. Vorteks tüpler ve 30 dakika süreyle buz üzerinde inkübe. </li><li> Her bir tüp ve incub seyreltilmiş monoklonal antikorlar uygun hacimde ekle15 dakika süreyle buz üzerinde karanlıkta yedi. Analiz edilecek örnekleri içeren tüpler polycromatic paneli (önceki antikorlar bileşimlerini optimize bireysel Labs yapılmalıdır) ve antikor kombinasyonu almalıdır. Ek kontrol gruplarına doğru ayrı ayrı tek renk kullanarak etiketli hücreleri karşılık etiketli değildi hücrelerin bir tüp dahil akış sitometresinde satın parametreleri, ve tazminat tüpler ayarlamak için dahil edilmelidir. Doğru akım sitometri analizi için kapıları ayarlamak için, Floresans Eksi Bir (FMO) kontrol edinimi sırasında dahil edilmelidir. FMO kontroller, kendi ilgili izotip kontrolü ile değiştirilir biri dışında panel üzerinde kullanılan tüm florokrom-konjuge antikorları ile etiketlenmiş hücreler vardır. Pozitif ve negatif popülasyonları (yani, tek başına bir pozitif kontrol uyarıcı ve orta ile tedavi edilen hücrelerin bölüntülerin ayrılması) da, FMO ve kompanzasyon kontrolü tüpler dahil edilmelidir. </li><li&gt; 10 dakika süre ile 4 250 x g hızında her bir tüp, girdap ve santrifüj ° C ila FACS tamponu 2 ml ilave edilir. </li><li> Bir test tüpünün raf üstünde tüpler yan yatan tarafından rezidüel sıvı Durusu süpernatan ve Pastör pipetiyle hücre pelletini. </li><li> Antikor paneli, bir florokrom doğrudan konjuge olmayan bir antikor oluşur ancak biyotin yerine konjuge olup, bir florokrom-konjuge streptavidin yüzey görsel işaretleyici için gereklidir. Bu adımda, seyreltilmiş florokrom-konjuge streptavidin uygun bir hacmi ekleyin ve buz üzerinde 15 dakika süreyle karanlıkta inkübe edilir. 4.2 &#39;de olduğu gibi, streptavidin Üretici tarafından tavsiye bir konsantrasyona ya da kullanıcı tarafından optimize edilmiş bir ila seyreltilmiş edilecektir. Bu adım sadece biyotinile primer antikorları içeren paneller için gereklidir. </li><li> 4,10 olarak tanımlanan bir yıkama adımı gerçekleştirmek. </li><li> BD deiyonize su içinde sabitleştirici 01:03 stabilize uygun bir hacim sulandırınız. Her tüpe seyreltilmiş sabitleştirici 100 uL ekle hafifçe vo sürehücrelerinin topaklanma önlemek için rtexing. Etiketli ve sabit hücrelerin stabil ° C Akış sitometresiyle satın alınmadan önce yaklaşık bir hafta boyunca 4 karanlıkta saklanabilir. </li></ol> 5.. Temsilcisi Veri Adım 3.1 &#39;fabrikasyon Nanopartiküller 163 ortalama çapı ± 24 nm ve daha önceki çalışmalarda elde edilen 5,16 ile tutarlı bir morfoloji vardı. Önceden sonikasyon ile ve sonra çözelti içinde Nanopartiküller partiküllerin sağlanması için yeterli bir dağılma sonication için ihtiyaç gösteren Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Akciğer lavaj yoluyla elde edilen hasat AMɸs akış sitometrik analizi Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Anti-fare CD11b ve anti-fare antikoru F4/80 yanı sıra, karşılık gelen kontrol FMO bir kombinasyonu ile etiketlenmesi hücreleri daha fazla analiz için AMɸs ve perdeleme tanımlanması, arka etiketleme olanak sağlamaktadır. Polianhidrid alveolar makrofajların TedavisiMHC II, CD40, CD86, ve Cire (Şekil 3) arasında yüksek ortalama floresans yoğunluğunu tarafından gösterildiği gibi nanopartiküller aktivasyon arttırır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig1.jpg" /> . Şekil 1 50:50 CPTEG: CPH önce (A) ve sonication (B) 30 sn sonra nanopartiküller. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig2.jpg" /> Şekil 2. Flow sitometrik (A) Alexa Fluor 700 anti-CD11b ve PE-Cy7 FMO Kontrol, (B) Alexa Fluor 700 FMO Kontrol ve PE-Cy7 anti-F4/80 etiketli hasat alveoler makrofajların analizi ve (C ) Alexa Fluor 700 anti-CD11b ve PE-Cy7 anti-F4/80. Sağ üst köşedeki sayısı çift pozitif hücrelerin yüzdesini temsil eder. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig3.jpg" /> Şekil 3. Histogramlar floresans kütüphane olduğu söylenebilir bir artış gösteren50:50 CPTEG ile makrofaj eş-kültürden sonra MHC II (A), CD40 (B), CD86 (C) ve Cire (D) yüzey ifade sity: CPH polianhidrid 48 saat boyunca nanoparçacıklar. Histogramlar FMO kontrol olarak etiketlenmiş AMɸ sonuçları (tasvir <img alt="Grafik Satır 1" src="/files/ftp_upload/3883/3883line1.jpg" /> ), Tedavi edilmemiş AMɸ tüm hücre yüzey belirteçleri karşı antikorlar ile işaretli ( <img alt="Grafik Satır 3" src="/files/ftp_upload/3883/3883line3.jpg" /> ) Ve AMɸ nanopartiküller ile kültüre ve tüm hücre yüzey belirteçleri karşı antikorlar ile işaretli ( <img alt="Grafik Satır 2" src="/files/ftp_upload/3883/3883line2.jpg" /> ).

<ol><li>Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory biomaterials.</a> Int. J. Pharm. 364, 265-271 (2008).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
<li>Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+polymer+chemistry+and+fabrication+method+on+protein+release+and+stability+from+polyanhydride+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+B%3A+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 91, 938-947 (2009).</li>
<li>Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydrides+for+protein+stabilization+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release.</a> Biomaterials. 28, 108-116 (2007).</li>
<li>Ulery, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+Protective+Single-Dose+Intranasal+Nanoparticle-Based+Vaccine+Platform+for+Respiratory+Infectious+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Design of a Protective Single-Dose Intranasal Nanoparticle-Based Vaccine Platform for Respiratory Infectious Diseases.</a> PLoS ONE. 6, e17642(2011).</li>
<li>Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simultaneous+effect+of+polymer+chemistry+and+device+geometry+on+the+in+vitro+activation+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells.</a> Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+innate+immune+responses+in+a+pathogen-mimicking+manner+by+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticle+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants.</a> Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).</li>
<li>Torres, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyanhydride+microparticles+enhance+dendritic+cell+antigen+presentation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Biomater%22%5BJournal%5D)">Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation.</a> Acta. Biomater. 7, 2857-2864 (2011).</li>
<li>Kirby, A. C., Coles, M. C., Kaye, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+transport+pathogens+to+lung+draining+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages transport pathogens to lung draining lymph nodes.</a> J. Immunol. 183, 1983-1989 (2009).</li>
<li>Barletta, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+compartments+in+the+mouse+lung%3A+Distinguishing+between+marginated%2C+interstitial%2C+and+alveolar+cells+in+response+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Leukocyte compartments in the mouse lung: Distinguishing between marginated, interstitial, and alveolar cells in response to injury.</a> J. Immunol. Methods. , (2011).</li>
<li>Rubins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages%3A+wielding+the+double-edged+sword+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword of inflammation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 103-104 (2003).</li>
<li>Sun, K., Gan, Y., Metzger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Murine+Genetic+Predisposition+to+Pneumococcal+Infection+Reveals+a+Critical+Role+of+Alveolar+Macrophages+in+Maintaining+the+Sterility+of+the+Lower+Respiratory+Tract%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Analysis of Murine Genetic Predisposition to Pneumococcal Infection Reveals a Critical Role of Alveolar Macrophages in Maintaining the Sterility of the Lower Respiratory Tract.</a> Infect. Immun. 79, 1842-1847 (2011).</li>
<li>Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+Macrophages+that+Phagocytose+Apoptotic+Neutrophils+Produce+Hepatocyte+Growth+Factor+during+Bacterial+Pneumonia+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Alveolar Macrophages that Phagocytose Apoptotic Neutrophils Produce Hepatocyte Growth Factor during Bacterial Pneumonia in Mice.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 608-615 (2001).</li>
<li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li>
<li>Ulery, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li>
<li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+protein+stability+in+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles.</a> Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).</li>
<li>Irvin, C. G., Bates, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+lung+function+in+the+mouse%3A+the+challenge+of+size%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Res%22%5BJournal%5D)">Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size.</a> Respir. Res. 4, 4(2003).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Tek doz rejimleri 5 intranazal uygulandığında polianhidrid nanoparçacık aşı platformları etkinliğini göstermiştir. Bu aşı dağıtım platformu tarafından uyarılan akciğerlerde ikamet fagositik hücre popülasyonlarının aktivasyon Ölçme potansiyel yeteneğinin değerlendirilmesi sonuçta adaptif bağışıklık yanıtları teşvik etmek için izin verir. Özellikle akciğer lavaj sıvısında makrofaj hasat ve nanopartiküllerin farklı formülasyonları ile onları tedavi antijen sunumu 6,8 yol m...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> CAM Medya </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 15-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> 50 mM 2-merkaptoetanol </td><td> Sigma </td><td> M3148-25ml </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin 10,000 ug / ml solüsyon </td><td> Cellgro </td><td> 30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> Sığır fetüs serumu </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> FACS Tampon </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Fisher Scientific </td><td> S671-500 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum fosfat </td><td> Fisher Scientific </td><td> MK7868500 </td><td></td></tr><tr><td> Potasyum klorür </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217500 </td><td></td></tr><tr><td> Potasyum fosfat </td><td> Fisher Scientific </td><td> P288-200 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (Bovine Serum Albumin) </td><td> Sigma </td><td> A7888 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum Azid </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td> Antikorlar </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rat IgG </td><td> Sigma </td><td> I4341 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Ms CD16/32 </td><td> eBioscience </td><td> 16-0161 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Ms MHC II haplotip floresein izotiyosiyanat (FITC) IA / IE, klon M5/114.15.2, konjuge </td><td> eBioscience </td><td> 11-5321 </td><td></td></tr><tr><td> Fare anti-CD86, allophycocyanin ile konjuge klonu GL-1, (APC)-Cy7 </td><td> Biolegend </td><td> 105030 </td><td></td></tr><tr><td> APC konjuge anti-fare CD40, klon 1C10, </td><td> eBioscience </td><td> 17-0401 </td><td></td></tr><tr><td> Biotin için konjuge anti-fare CD209, klon 5H10, </td><td> eBioscience </td><td> 13-2091 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 700 konjuge anti-fare CD11b, klon M1/70, </td><td> eBioscience </td><td> 56-0112 </td><td></td></tr><tr><td> Phycoerythrin ile konjuge edilmiş anti-fare F4/80, klon BM8, (PE)-Cy7 </td><td> eBioscience </td><td> 25-4801 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Texas kırmızı konjuge Streptavidin </td><td> BD Biosciences </td><td> 551487 </td><td></td></tr><tr><td> Diğer Sarf Malzemeleri ve Reaktifler </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A405-20 </td><td> 70% (v / v) olarak kullanıldı </td></tr><tr><td> Sıkıştırılmış CO 2 </td><td> Linweld </td><td> 16000060 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml Şırınga </td><td> BD Biosciences </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Egemen 3 ½ &quot;Fr Tom Catcatheter </td><td> Kendall </td><td> 703021 </td><td></td></tr><tr><td> Biyogüvenlik Kabini </td><td> NUAIRE </td><td> Series 22 </td><td></td></tr><tr><td> Diseksiyon Makas </td><td> Balıkçı </td><td> 138082 </td><td></td></tr><tr><td> Forseps </td><td> Roboz </td><td> RS-8254 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, kalsiyum ve magnezyum içermeyen 1X </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CM </td><td></td></tr><tr><td> Vida Kapaklı 15 ml Santrifüj Tüpleri </td><td> VWR International </td><td> 21008-216 </td><td></td></tr><tr><td> Altı sıra Doku Kültürü Tabaklar Tedavi </td><td> Costar </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> Plastik Boru Raflar </td><td> Nalgene </td><td> 5970 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre Kazıyıcı 24 cm </td><td> DYP </td><td> 99002 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml Polistiren Yuvarlak Alt Tüp </td><td> Şahin </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetleyin yardım XL </td><td> Drummond </td><td> 4-000-105 </td><td></td></tr><tr><td> 10, 5, ve 2 mL Pipetler </td><td> Balıkçı </td><td> 13-675 </td><td></td></tr><tr><td> 200 ve 10 uL micropipettors </td><td> Gilson Pipetman </td><td> F123601 </td><td></td></tr><tr><td> 200 ve 10 uL pipet uçları </td><td> Balıkçı </td><td> 02-707 </td><td></td></tr><tr><td> BD DengeleyiciSabitleştirici </td><td> BD Biosciences </td><td> 338036 </td><td></td></tr><tr><td> ISOTON II Dilüent </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 8546719 </td><td></td></tr><tr><td> Zap-oglobin II Parçalayıcı Reaktif </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 7546138 </td><td></td></tr><tr><td> Coulter Sayaç Polistiren Flakon </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 14310-684 </td><td></td></tr><tr><td> Test Tüpleri </td><td> BD Biosciences </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Ekipman </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Soğutmalı Santrifüj </td><td> Labnet </td><td> 50075040 </td><td></td></tr><tr><td> Nemlendirilmiş İnkübatör CO 2 </td><td> Nuaire </td><td> Model Autoflow 8500 </td><td></td></tr><tr><td> FACSCanto Akış Sitometresi </td><td> BD Biosciences </td><td> 338960 </td><td></td></tr><tr><td> Coulter Partikül Sayacı Z1 </td><td> Beckman-Coulter </td><td> WS-Z1DUALPC </td><td></td></tr><tr><td> Mikrotip ile Sonicator Sıvı İşleme Ekipmanları </td><td> Misonix </td><td> Model No S-4000 </td><td></td></tr></tbody></table>

polianhidrid nanopartiküller bağlı mürin alveoler makrofajlar hasat ve değerlendirme hücresel etkinleştirme

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biyobozunur nanopartiküller solunum yolu enfeksiyon hastalıklarına karşı yeni aşıların intranazal tasarlanması ve uygulanması için çok yönlü bir platform olarak ortaya çıkmıştır. Spesifik olarak, polianhidrid alifatik sebasik asit (SA), aromatik 1,6-bis (p-karboksifenoksi) heksan (CPH), ya da amfifilik 1,8-bis (p-karboksifenoksi) -3,6-dioxaoctane oluşan nanoparçacıklar (CPTEG) benzersiz toplu ve yüzey erozyonu kinetik 1,2 gösterilecek ve yavaş yavaş in vivo 3,4,5 fonksiyonel biyomoleküllerin (örneğin, protein antijenleri, immünglobulinler, vb) serbest bırakmak için kullanılabilir. Bu onlara bir aşı dağıtım platformu 6,7,8 için mükemmel bir seçim yapmak, aynı zamanda sahip oldukları içsel adjuvan aktivite nanoparçacıklar. Burun içi mukozal aşılamayı takiben doğuştan gelen bağışıklık aktivasyonu düzenleyen mekanizmaları aydınlatmak üzere, bir antijen p moleküler ve hücre yanıtları değerlendirilmesi gerekirbağışıklık yanıtı başlatmadan sorumlu alınıyoruz hücreler (APC). Alveoler makrofajların (AMɸ) akciğer parankimi 9,10,11 baskın sırasında dendritik hücreler, hava yollarında yürütülmesi bulunan başlıca APC&#39;ler vardır. AMɸ mikrobiyal patojenler ve hücre artıkları 12,13 akciğerlerinde temizlenmesi son derece verimlidir. Ayrıca, bu hücre tipi bir adaptif bağışıklık yanıtının 9 başlamasında önemli bir ilk adımdır lenf düğümleri için mikrobiyal antijenlerin taşıma değerli bir rol oynar. AMɸ da doğuştan örüntü tanıma ve çöpçü reseptörleri, salgılar pro-enflamatuar mediatörler ve başbakan naif T hücrelerinin 12,14 yüksek seviyelerde ifade. AMɸ (ör., daha az% 80) arasında göreceli olarak saf popülasyonunun, laboratuarda çalışma için akciğer lavaj yoluyla elde edilebilir. AMɸ immün yetenekli hayvanlar hasat Resident encounte olacak makrofajların temsilcisi fenotipi sağlamakin vivo r parçacık tabanlı aşı. Bu yazıda, farelerden alınan hasat ve kültür AMɸ için kullanılan protokolleri tanımlamak ve in vitro polianhidrid nanopartiküller ile tedaviyi takiben makrofajların aktivasyonu fenotipi inceleyin.

Bu yazıda, akciğer doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ikamet ve polianhidrid nanopartiküller ile ko-kültür tepki olarak aktivasyon inceleyerek murin alveoler makrofaj, hasat için protokoller açıklanmaktadır.

Polianhidrid Nanopartiküller Bağlı Mürin Alveoler Makrofajlar Hasat ve Değerlendirme Hücresel Etkinleştirme

Biyobozunur nanopartiküller, solunum yolu hastalıklarına karşı yeni intranazal aşıların tasarımı ve uygulanması için çok yönlü bir platform olarak ortaya çıkmıştır...

Bu prosedürün genel amacı, polianhidrit nanoparçacıkların saflaştırılmış aynalayıcı alveolar makrofajları aktive etme yeteneğini değerlendirmektir. İlk olarak, farenin trakesi cerrahi olarak açılır ve solunum yolundan hücre toplamak için lavaj işlemi gerçekleştirilir. Ardından, alveolar makrofajları izole etmek için santrifüj uygulanır ve hücreler gece boyunca kültüre edilir.Ardından bir polianhidrit nanopartikül süspansiyonu hazırlanır ve alveolar makrofajlara eklenir. Makrofajlar, 48 saat sonra aktivasyona izin vermek için inkübe edilir. Hücre yüzey belirteci ekspresyonu akış sitometrisi ile analiz edilir.Verilerin analizi, alveolar makrofajları aktive edebilen Poli Anhidrit nanopartikül formülasyonlarının tanımlanmasına olanak tanır. Bu yöntem, biyomalzemeler ve immünoloji alanlarındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Özellikle, alveolar makrofajlar dahil olmak üzere antijen sunan hücreleri aktive etme yeteneğiyle kanıtlanan, intrinsik adjuvan aktiviteye sahip biyomalzemeleri tanımlayabiliriz.Solunum yolu patojenlerine karşı bir polianhidrit nano aşı platformunun, bakteriyel pnömoniye karşı tam koruma sağladığını keşfettiğimizde, araştırmalarımızda bu yöntemi kullanma fikri ilk kez ortaya çıktı. Mevcut çalışmada, aşı platformunun solunum yolu immün hücreleri ile olan spesifik etkileşimlerini incelemeyi amaçladık. Bu prosedüre, ötenazi uygulanmış bir fareyi sırt üstü yerleştirerek başlayın.Fareyi %70 etanol ile spreyleyin; burada altı ila sekiz haftalık bir C 57 BL six faresi kullanılmış olsa da, bu teknik herhangi bir fare suşu üzerinde uygulanabilir. Sternumu bulun ve abdomenle 30 derecelik bir açıyla, bir mililitrelik şırıngaya takılı 23 gauge bir iğne yerleştirin. Torasik kavitenin yaklaşık 50 milimetre derinliğinde, genellikle ventriküllerden 0.4 ile 1 mililitre arasında kan toplayın.Bu prosedürün uygulanması, deneyleri için satış dışı bir örnek elde etmede zorluk yaratacaktır. Bu nedenle, burada gösterildiği gibi dikkatle uygulanması gerçekten önemlidir. Lavajı gerçekleştirmek için fareyi karnının üzerine yatırın ve %70 ethanol püskürtün.Ardından, %70 ethanol ile sterilize edilmiş diseksiyon makası kullanarak omurganın yaklaşık ortasındaki deriyi sıkıştırın. Deri üzerinden küçük bir insizyon yapın. İnsizyonun her iki yanındaki deriyi tutun ve farenin kranial kaudal ekseni boyunca zıt yönlere doğru çekin.Boyun kasları ve bezleri açığa çıkarıldıktan sonra, kas dokusu dikkatlice kesin. Ardından pens kullanarak, larinks, trakea ve özofagusu açığa çıkarmak için dokuyu farenin anterioruna doğru çekin.Jugular venin veya karotis arterin kesilmesinden kaçının. Trake, etrafındaki kıkırdak halkalar sayesinde tanımlanabilir. Pensle trakeyi hassas bir şekilde kavrayın ve dorsal tarafta yer alan özofagustan nazikçe kaldırarak ayırın.Tomcat kateter takılmış bir cc'lik şırıngayı steril PBS ile doldurun. Ardından 45 derecelik bir açıyla, forsepslerin önünde ancak larinksin arkasında, trakeada küçük bir insizyon yapın.Trakeanın vücut boşluğuna geri çekilmesini önlemek için trakeayı tamamen kesmekten kaçının. Pens kullanarak trakeayı tutun ve kateteri trakea insizyon bölgesinden içeriye yaklaşık 20 milimetre boyunca nazikçe yerleştirin. Ardından, göğüs bölgesine dışarıdan masaj yaparken diğer elinizi serbest bırakmak için kateter tüpünün çevresindeki trakeayı kavrayın.Kateter takılı bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, akciğerlere oda sıcaklığındaki 0,75 mililitre steril PBS'yi nazikçe infüze edin. Ardından, PBS'yi şırıngaya nazikçe geri aspire edin. Bu işlemi üç kez tekrarlayın.Şırıngayı kateterden ayırın ve lavaj sıvısını 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Şırıngayı 0.75 mililitre taze PBS ile doldurun, şırıngayı katetere yeniden bağlayın ve lavaj işlemini tekrarlayın. Sıvı geri kazanımı kısmi olabilir, bu nedenle elde edilen hacim, infüze edilen hacimden daha az olabilir.Hücreler birden fazla fareden toplanacaksa, hasat edilen hücrelerin bulunduğu 15 mililitrelik tüpü, tüm akciğer lavajları tamamlanana kadar buz üzerinde bekletin. Hasat edilen hücrelerdeki alveoler makrofaj popülasyonunu zenginleştirmek için, akciğer lavaj sıvısını 4 °C'de 10 dakika boyunca 250 ×g'de santrifüjleyin.Steril teknik kullanarak, süpernatanı bir biyogüvenlik kabini içerisinde uygun bir atık kabına aktarın. Santrifüj tüpünü bir test tüpü rafının üst kısmında nazikçe sallayarak hücre peletini yeniden süspanse edin. Hücreleri saymak amacıyla, hücreleri yeniden süspanse etmek için bir mililitre komple alveolar makrofaj medyumu ekleyin.Bir kültür sayıcı tüpü içerisindeki 10 mililitre isotone two dilüenine 20 microliters hücre pipetleyin. Tüpe üç ila dört damla zog globin, two litik reaktif ekleyin ve tüpü hafifçe üç ila dört kez tersyüz edin. Ardından, numune tüpünü bir colter particle counter Z one sayıcıya yerleştirin.Hücre konsantrasyonunu mililitre başına hücre sayısı olarak görüntülemek için sayacı 2 × 10⁴ seyreltme faktörüyle programladığınızdan emin olun. Hücre konsantrasyonu belirlendikten sonra, hücreleri 15 ml'lik bir tüp içerisinde komple alveolar makrofaj besiyeri ile mililitre başına 2,5 × 10⁵ olacak şekilde seyreltin. Ardından, çözeltiden ikişer mililitreyi altı kuyucuklu bir doku kültürü plağının her bir kuyucuğuna dağıtın.Alveolar makrofajları zenginleştirmek için kültür kaplarını 37 °C sıcaklıkta, %5 CO2 atmosferine sahip nemlendirilmiş bir inkübatörde altı saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sırasında makrofajlar kuyucuk tabanına yapışacaktır; inkübasyonun ardından, yapışmış hücreleri bozmamaya dikkat ederek süpernatanı nazikçe aspire edin. Ardından kuyucukları steril kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS kullanarak durulayın.Yapışmayan hücreleri ve kalıntıları uzaklaştırmak için her bir kuyucuğa iki mililitre tam alveolar makrofaj ortamı ekleyin. Ardından hücreleri 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Bu zenginleştirme adımından sonra, hücrelerin yaklaşık %87'si makrofaj belirteçleri CD 11 B ve F4/80 için pozitif olacaktır.Alveolar makrofaj popülasyonu zenginleştirildikten sonra, prosedürün bir sonraki adımı polianhidrit nanoparçacıklar eklemektir; nanoparçacıklar öncelikle polianhidrit antisolvent nanoenkapsülasyonu yoluyla hazırlanır. Bu işlemde polimer metilen klorür içinde çözülür ve pentan içinde çöktürülür. Steril tartım kağıdı kullanarak uygun miktarda polianhidrit nanoparçacık tartın.Burada, her bir mililitre kültür için 125 mikrogram partikül eklenir. Partikülleri 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne ekleyin, nanopartikülleri uygun miktarda buz gibi soğuk, tamamlanmış alveolar makrofaj besiyerinde yeniden süspande edin ve buz üzerine yerleştirin. Ardından, masaüstü bir sonikatörün mikro ucunu sterilize edin.Tüpü buz üzerinde tutarken %70 ethanol ile püskürtün ve steril bir kim wipe ile silin. 10 ila 20 joule enerjiyle 30 ila 45 saniye boyunca sonikasyon uygulayın. Parçacıklar yeterince dağılmadıysa, nanopartikül süspansiyonunu makroskobik olarak gözlemleyin.Nanopartiküllerin polimerin camsı geçiş sıcaklığının altında olduğundan emin olmak için süspansiyonu bir ila iki dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Ardından 30 ila 45 saniye boyunca tekrar sonikasyon uygulayın. Sonikasyon adımının amacı, 50 50 CCP etiketi olarak nanopartikülleri yeterince dağıtmaktır.CPH nanopartikülleri, sulu bir ortama maruz kaldıklarında kümelenme eğilimi gösterirler. Bununla birlikte, süspansiyon içerisinde hala bazı küçük nanopartikül agregatları kalabilir. Erken yüzey erozyonunu veya kümelenmeyi önlemek için nanopartikül süspansiyonu buz üzerinde tutulmalı ve hemen kullanılmalıdır.Alveoler makrofajları içeren kültür kaplarını inkübatörden çıkarın ve biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Yapışık hücreleri rahatsız etmemeye dikkat ederek plakayı eğin ve nanoparçacık süspansiyonuna eklenecek miktardaki besiyerini pipetle çekerek uzaklaştırın. Poli anhidrit nanoparçacık süspansiyonunu kısa süreliğine vorteksleyin, ardından uygun kuyucuklara 0.3 milliliters kadar nanoparçacık süspansiyonu pipetleyin.Tekrar, yapışık hücreleri rahatsız etmemeye dikkat edin. Partiküller kuyucuğun dibine çökecek ve hücrelerle temas edecektir. Diğer kuyucuklar ve istenen işlem grupları ile işleme devam edin.Yalnızca besiyeri ve 200 ng/mL Lipopolisakkarit gibi pozitif ve negatif kontrol gruplarını belirlenen kuyucuklara ekleyin, ardından 37 °C'de 48 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, alveoler aktivasyon, ekteki belgede açıklandığı şekilde akış sitometrisi ile değerlendirilebilir.Hücresel aktivasyonu değerlendirmek amacıyla C 57 BL six farelerinden alveoler makrofajlar elde edilmiş ve video makalesinde açıklandığı şekilde zenginleştirilmiştir. Zenginleştirilmiş alveoler makrofajların mL'de 5 × 10⁵ hücresine, 125 µg/mL konsantrasyonunda 50:50 CPT:CPH polianhidrit nanoparçacıklar eklenerek 48 saat beklenmiştir. Ardından, alveoler makrofaj belirteçleri olan MHC II, CD 40, CD 86 ve SIRPα ekspresyonları, bu histogramda görüldüğü üzere antikor boyama ve akış sitometrisi ile değerlendirilmiştir.Düz mavi çizgi ile belirtilen nanoparçacıklarla inkübe edilen alveoler makrofajlar, beklendiği üzere, nanoparçacıklarla işlem görmemiş olanlara kıyasla, antijenlerin CD 4 T hücrelerine sunumu için gerekli bir molekül olan MHC two'nun yüzey ekspresyonunda artış göstermiştir. Floresan eksi bir (FMO) kontrollerinde daha düşük boyama seviyeleri görülmüş olup, bu durum gözlemlenen sinyalin otofloresanstan kaynaklanmadığını göstermektedir. Düz mavi çizgi ile belirtilen nanoparçacıklarla inkübe edilen alveoler makrofajlar, işlem görmemiş hücrelere kıyasla, T hücrelerinin uygun aktivasyonu için gerekli bir ko-stimülatör molekül olan CD 40'ın ekspresyonunda artış göstermiştir.Bir diğer T hücresi ko-stimülatör molekülü olan CD 86'nın ekspresyonu da polianhidrit nanopartiküllerle 48 saat boyunca yapılan tedavi sonrası artış göstermiştir. Patojenlerin yüzeyinde bulunan karbonhidrat motiflerine bağlanan C tipi bir lektin reseptörü olan CY'nin ekspresyonu, polianhidrit nanopartikül tedavisi sonrası alveolar makrofajlarda önemli ölçüde artmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, alveolar makrofajları toplamak amacıyla nasıl alveolar lavaj yapılacağı, bu hücrelerin nasıl kültüre edileceği ve hücrelerin hücresel aktivasyonunu polianhidrit nanopartiküllerle ölçmek veya değerlendirmek için bu hücrelerin nasıl stimüle edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.Bu prosedür uygulanırken, hasat edilen primer hücrelerin kontamine olmasını ve tedavilere kontaminantların karışmasını önlemek için steril laboratuvar tekniklerinin kullanılması önemlidir.

harvesting-murine-alveolar-macrophages-evaluating-cellular-activation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Konfokal mikroskopi tarafından fagosite Aspergillus sporlarının büyümesini kontrol için izole edilmiş fare alveolar makrofaj yeteneğini değerlendirmek için bir yöntem.

Eşodaklı Mikroskopi İzole Alveoler Makrofagların anti-fungal Hareketi değerlendirilmesi

Granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ile kültürlenen kemik iliği hücreleri, makrofajlar ve dendritik hücreler (DC'ler) içeren heterojen bir kültür oluşturur. Bu yöntem, makrofajları GM-CSF kültüründeki DC'lerden ayırt etmek için MHCII ve hyaluronan (HA) bağlanmasının kullanılmasını vurgular. Bu kültürdeki makrofajlar, alveolar makrofajlarla birçok benzerliğe sahiptir.

Fare Kemik İliği itibaren Üretimi ve GM-CSF tanımlanması Türetilmiş Alveoler gibi makrofajlar ve dendritik hücrelerin

Burada, kanser metastazında pulmoner alveoler makrofajların fonksiyonlarını incelemek için model ve yaklaşımı açıklıyoruz. Bu hücrelerin metastazdaki rolünü göstermek için, alveolar makrofajın klodronat lipozomlarla tükenmesi ile birlikte meme kanserinin sinjenik (4T1) modeli kullanıldı.

Meme Kanseri Metastaz alveoler makrofajlar Rolü incelenmesi

Akciğerin sağlık durumu, akciğer bronşiollerinde bulunan bağışıklık hücrelerinin türüne ve sayısına göre yansıtılır. Farelerin alt solunum yollarından yapışkan olmayan hücrelerin ve çözünür faktörlerin izolasyonunu ve çalışılmasını sağlayan bir bronkoalveolar lavaj tekniğini açıklıyoruz.

İnflamatuvar Hücre İnfiltrasyonunu İncelemek İçin Murin Akciğerlerin Bronkoalveoler Lavajı

Bu iletişim metodolojisi yalıtım ve kültür insanlardan alveoler makrofajlar ve deneysel amaçlar için fare modelleri açıklar.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Burada fare alveoler makrofajlar ve akciğer üzerinden bakteriyel Temizleme fagositik işlevi analiz etmek için ortak yöntemleri raporu. Bu yöntemler floresein isothiocyanate boncuk tüp bebek fagositoz ve Pseudomonas aeruginosa yeşil flüoresan protein içinde vivo fagositoz çalışma. Biz de P. aeruginosa farelerde temizlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Alveoler makrofaj fagositoz ve bakteri izni farelerde

Biz Bronkoalveoler Lavaj sıvısı işleme için bir yöntem tarif ve pulmoner HıV rezervuarları değerlendirmek için antiretroviral tedavi kronik HıV enfekte bireylerin periferik kan eşleşen. Bu yöntemler, son derece saf CD4 T hücrelerinin satın alınması ve daha sonra ultrason polimeraz zincir reaksiyonu ile immünofenotipleme ve HIV DNA/RNA ölçülerinde kullanılabilir alveoler makrofajlar sonuçlanır.

Alveoler Makrophaj ve CD4+ T-Cell Immünophenotyping ve HIV rezervuar değerlendirmesi Için Bronkoalveolar lavaj sıvısı ve eşleştirilen kanın işlenmesi

Bu el yazması, hava kirletici bir kriter olan ozon maruziyetinin alveoler makrofaj efferositozisinin in vivo'yu bozup bozmadığını belirleyen bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokol yaygın olarak kullanılan reaktifler ve teknikler kullanır ve alveoler makrofaj eferositoz üzerindeki etkilerini belirlemek için pulmoner yaralanma birden fazla modeladapte edilebilir.

Ozon Maruziyetinden Sonra Alveoler Makrofaj Eferositozun Vivo Değerlendirilmesi

Bu protokol, araştırmacılara, biyomateryal implant mikroçevresini modelleyen çeşitli polimerik yüzeylere ve adsordi protein katmanlarına yanıt olarak bir murine makrofaj hücre hattında TLR bağımlı NF-кB/AP-1 transkripsiyon faktörü aktivitesini ölçmenin hızlı ve dolaylı bir yöntemini sağlar.

Polimerik Yüzeylerde Adsorbe Protein Katmanlarında Sinyalizasyonu NF-kB/AP-1 Sinyallerini İnceleyecek Bir Makrofaj Muhabiri Hücre Tetkik

Burada sunulan birincil insan kanı monosit izolasyon yanı sıra makrofajlar ve dendritik hücreler ve çok hücreli insan akciğer modeli içine epitel hücreleri ile montaj içine farklılaşma için bir protokoldür. Proinflamatuar uyaranlara maruz kalındığında, taze izole edilmiş veya çözülmüş monositlerden farklı bağışıklık hücrelerinden oluşan kokültürlerin biyolojik yanıtları karşılaştırılır.

Tehlike Değerlendirmesi İçin Epitel Hücreleri ve Primer İmmün Hücrelerden Oluşan Çok Hücreli İnsan Alveoler Modeli

Öğrenin, fare alveoler makrofajlarını bronkoalveoler lavaj ile izole edip polianhidrid nanopartiküllerle aktive etme yöntemini. Akış sitometrisi ile yüzey belirteçleri analiz edilerek immünoloji ve biyomalzemeler araştırmalarına katkı sağlanır.

Polianhidrid Nanopartiküller Bağlı Mürin Alveoler Makrofajlar Hasat ve Değerlendirme Hücresel Etkinleştirme

Daha fazla video keşfet