Polikistik Böbrek Hastalığı Olan İnsanlar ve Fareler kromozom anomalileri Eğitim Spektral Karyotipik

Bu prosedürün amacı, polikistik böbrek hastalığı olan fare ve insanlarda kromozom aberrasyonlarını ve segregasyon defektlerini belirlemek için kromozomları boyama probları ile işaretlemektir. Bu işlem; önce insan veya farelerden hücrelerin toplanması ve smid ile işlenmesi, ardından fiksasyon yapılması ve cam lamlar üzerinde metafaz yayılımlarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, hibridizasyonu engelleyebilecek fazla RNA ve sitoplazmayı uzaklaştırmak için lam ön işlemden geçirilir.

Bu işlem sırasıyla RNase ve pepsin ile sindirim yapılarak gerçekleştirilir. Ardından, kromozomların işaretlenmesi için kromozom ve prob denatürasyonu ile ardından hibridizasyon uygulanır. Son adım, probun floresan boyalarla tespit edilmesidir.

Nihayetinde, floresan, mikroskopi ve Skyview yazılımı ile görüntü yakalama ve analiz yoluyla kromozom sayısal ve yapısal anomalilerini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin, klasik GIM'ler bükme teknikleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı; kromozomal translokasyonlar ve klasik bükme teknikleriyle karakterize edilemeyen karmaşık kromozomal yeniden düzenlemeler gibi kompleks kromozomal aberasyonlar hakkında ek bilgi sağlamasıdır. Bu yöntem, polikistik böbrek hastalığı alanında, kistik böbrek oluşum mekanizması gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Prosedür, laboratuvarımızdan yetenekli bir kıdemli doktora sonrası araştırmacı Dr. Wiam Abu tarafından gösterilecektir. Endotel hücreleri, hücreler %70 ila %80 konfluense ulaşana kadar %10 ila %15 fetal bovine serum ve %1 penisilin streptomisin içeren DMEM içerisinde 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında başlatılır. Ardından, hücreler hasat edilmeden önce 37 °C'de 30 ila 60 dakika boyunca 0,05 mg/mL nihai konsantrasyondaki Cole solüsyonu ile muamele edilir. Hücreleri hasat etmek için öncelikle, yüzen hücreleri içeren ortam 50 mL'lik steril santrifüj tüplerine toplanır.

Steril tripsin ile bir ila iki dakika inkübe ettikten sonra, plaktaki hücreleri bir kez steril PBS ile durulayın, kalan hücreleri hasat ederek aynı tüpe toplayın. Hücreleri dakikada 1000 devirde beş dakika santrifüjleyerek çöktürdükten sonra, pelletin üzerinde yaklaşık 0,5 mililitre kalacak şekilde tüpteki süpernatantın büyük kısmını aspire edin. Tüpü hafifçe vurarak hücre pelletini gevşetin.

Ardından, pelet boyutuna bağlı olarak, distile su içinde %0,56'lık potasyum klorür hipertonik çözeltisinden 5 ila 10 mililitre ekleyin ve süspansiyonu 37 °C'de 30 ila 45 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, her bir mililitre hipertonik hücre süspansiyonu için buz gibi soğuk fiksasyon çözeltisinden bir damla eklemek üzere küçük bir bir mililitrelik pipet kullanın. Daha sonra, hücreleri dakikada 1.200 devir hızında beş dakika santrifüj ettikten sonra, karıştırmak için tüpü yavaşça ters çevirin.

Süpernatantı daha önce olduğu gibi aspire edin. Ardından, pelleti hafifçe sallarken yavaşça bir mililitre taze tespit çözeltisi ekleyin. Sonra, tüpün çeperinden dört mililitre daha tespit çözeltisi nazikçe ekleyin.

Bu işlem, metafaz yayılımlarının hücre kümeleri içinde hapsolmamasını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Santrifüj adımını tekrarlayıp süpernatantı aspire ettikten sonra, tespit ediciyi tüpün duvarlarından aşağıya yavaşça pipetleyerek 5 ila 10 mililitre tespit ediciyi yenileyin. Bu aşamada hücreler, işleme devam edilene kadar kısa süreli saklama için -20 °C'de veya uzun süreli saklama için -80 °C'de, sıkıca kapatılmış ve mühürlenmiş bir tüpte saklanabilir.

Devam etmeye hazır olduğunuzda, hücre preparasyonundaki metafaz kromozom sayısını kontrol edin. Lamı absolut etanol ile temizleyin. Ardından, lam yüzeyinde bir su tabakası oluşturmak için lamı distile su içerisinde yaklaşık 10 kez batırıp çıkarın, lamı bir cam plaka üzerine yerleştirin ve lamın yaklaşık 10 inç üzerinden 15 ila 20 µL hücre süspansiyonu damlatın.

Lamı 65 ila 70 derece Celsius'ye ayarlanmış bir su banyosunda bir ila iki dakika bekletin ve kurumaya bırakın; lamı 10 kat ve 40 kat kuru objektifleri kullanarak bir ışık mikroskobu altında inceleyin. Metafaz kromozomlarının mevcut olduğundan ve yayılımların eşit aralıklı olduğundan emin olun. Kromozomları çevreleyen sitoplazmayı kontrol edin.

Burada görüldüğü gibi sitoplazma mevcutsa, lam ön işlemine geçiniz. Sitoplazma mevcut değilse ve kromozomlar iyi morfolojiye sahipse, 20 mg/mL RNA çözeltisinin iki katı SSC içinde çözündürülerek taze hazırlanmış 1:200'lük çözeltiden 120 µL'nin 24 mm x 60 mm'lik bir lam örtü camına uygulanması şeklindeki lam ön işlemine gerek yoktur.

Metafaz lamını, ön yüzü lamelle temas edecek şekilde ters çevirin. Ardından, metafaz lamını nazikçe tekrar ön yüzü yukarı gelecek şekilde çevirin. Lamı nemlendirilmiş bir hazneye yerleştirin ve 37 degrees Celsius sıcaklıkta 45 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyon süresi dolduğunda, lamı çizmemeye dikkat ederek lamel camını dikkatlice çıkarın ve bir bağlama kabı içerisinde, her biri beşer dakika sürecek şekilde, sallayarak üç kez SSC tamponu ile ikişer defa yıkayın. Bu sırada, temiz bir behere distile su içerisinde çözülmüş 100 mg/mL pepsin'den 5 ila 15 µL ekleyin ve ardından 37 °C'ye önceden ısıtılmış 100 mL 0,01 M hidroklorik asit ekleyin. Pepsin'in önce temiz behere eklenmesi önemlidir, aksi takdirde çözünmeyecektir.

Bu çözeltiyi bir coplan kavanozuna aktarın. Yıkama lamını, sindirim işleminden sonra coupling kavanozunda 37 °C'de en fazla üç ila beş dakika inkübe edin. Lamı, bir XPBS içeren bir copin kavanozunda, her biri beş dakika sürecek şekilde sallayarak iki kez yıkayın.

Ardından, magnezyum klorürle desteklenmiş PBS içeren bir copin kavanozunda beş dakikalık bir yıkama uygulayın. Daha sonra %1 formaldehit içeren bir copin kavanozunda 10 dakika inkübasyon yapın ve bunu, 1X PBS içeren bir cochin kavanozunda beş dakikalık son bir yıkama ile takip edin. Ardından, lamları sırasıyla %70, %80 ve %100'lük etanol serileri içeren cochin kavanozlarında her biri iki dakika olacak şekilde dehidrate edin ve ardından havada kurutun.

Lamların uygun şekilde sindirildiğinden, sitoplazma kalıntısı bulunmadığından ve kromozom morfolojisinin korunduğundan emin olmak için lamları bir ışık mikroskobunda 40 kat kuru objektif kullanarak inceleyin. Son olarak, bir elmas kalem kullanarak hibridizasyon için bir alan seçin. Denatürasyon solüsyonunu taze olarak hazırladıktan sonra bir copin kavanozuna yerleştirin ve bir su banyosunda 70 °C'ye kadar ön ısıtma yapın.

Ardından lamı, 70 °C'lik su banyosunda ön ısıtılmış denatürasyon çözeltisi içeren cochin kavanozuna yerleştirip 30 saniye ile bir dakika arasında bekletin. İnkübasyonun ardından lamı derhal üç dakika boyunca buz gibi soğuk %70 etanolde, ardından üçer dakika boyunca sırasıyla %80 ve %100 etanolde bekletin ve sonrasında havada kurutun. Lamı, soluk veya parlak görünmeyen koyu renkli kromozomların görünümü ile kromozom morfolojisi açısından inceleyin.

İyi kromozom veya morfolojiyi belirtir. Gökyüzü boyasını ısıtın. 37 °C'de, çalkalayarak 20 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından vortexleyin ve kısa bir süre 1000 devirde santrifüjleyin. Probu, bir termosikletörde 85 °C'de beş dakika boyunca denatüre edin ve ardından 37 °C'de inkübe edin. Denatüre edilmiş probun 10 µL'sini hibridizasyon bölgesine uygulayın ve 22 mm x 40 mm boyutunda bir lamel ile örtüp bir saat boyunca bekletin.

Hava kabarcığı kalmadığından emin olarak lamel kenarlarını kauçuk yapıştırıcı ile mühürleyin, ardından nemlendirilmiş bir inkübasyon kabında 37 °C'de 48 ila 72 saat boyunca inkübe edin. Lameli dikkatlice kaldırın ve lamı, 45 °C'ye ön ısıtılmış, taze hazırlanmış yıkama çözeltisi içeren bir bağlama kavanozuna yerleştirin. 45 °C'deki çalkalayıcı su banyosunda, dakikada 45 rotasyon hızında, beşer dakikalık üç yıkama işlemi gerçekleştirin.

Ardından slaytları, çalkalayarak 45 °C'de beşer dakika boyunca iki kez yıkama solüsyonu iki ile yıkayın ve bunu 45 °C'deki yıkama solüsyonu üç ile çalkalayarak beş dakika boyunca sürdürün. Sonra, 80 µL bloklama reaktifi uygulayın. Ardından bir lam kapatıcı cam yerleştirin ve 37 °C'deki inkübatörde 30 dakika bekletin.

Lam camını kaldırın ve sıvının süzülmesine izin verin. 80 µL sci-fi boyama reaktifi uygulayın. Bir lam camı kapatın ve 37 °C'de 40 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, lamı 45 °C'deki yıkama solüsyonu 3 ile sallayarak beşer dakikalık üç yıkama işlemine tabi tutun.

Ardından, 80 µL PS 5.5 boyama reaktifi uygulayın. Bir lam kapatma camı yerleştirin ve 37 °C'de 40 dakika boyunca inkübe edin; inkübasyon sonrası, daha önce yapıldığı gibi yıkama solüsyonu üç ile üç kez yıkayın. Son olarak, lamı eğerek sıvının süzülmesini sağlayın.

20 µL Antifa dappy reaktifi uygulayın ve 24 mm x 60 mm'lik bir mikroskop lam camı yerleştirin. Oluşmuş olabilecek hava kabarcıklarını dikkatlice giderin; lamlar hemen görüntülenebilir veya karanlıkta, 4 °C'de bir haftadan fazla olmamak kaydıyla saklanabilir. Vahşi tip bir fareden alınan normal bir metafaz yayılımının bu görüntüsü, 60x yağ daldırma objektif donanımlı bir Olympus mikroskobu kullanılarak yakalanmıştır.

Spektral küp olarak bilinen özel tasarlanmış bir üçlü bant geçiren filtre, bir dappy filtresi ve CCD kameralı bir sac interferometre modülü kullanılmıştır. Spektral karyotipler skyview yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sol üst panel işaretlenmiş metafaz yayılımını, sağ üst panel ise yayılımın parlak alan görüntüsünü göstermektedir.

Alt panel, skyview yazılımı kullanılarak artan düzende sıralanmış kromozomları göstermektedir. Bir pkd1 homozigot nakavt fareden alınan bir metafaz yayılımının bu sky görüntüsü, 40 yerine 68 kromozomun bulunduğu anormal kromozom sayısını göstermektedir. Ayrıca sekizinci kromozomun delesyonu gibi kromozom anomalileri ile beşinci ve 16. kromozomlar ile 11. ve 19. kromozomlar arasında gerçekleşen translokasyonlar gibi durumlar da görülmektedir.

ADPKD hastası olmayan bir bireyin vasküler dokusundan alınan insan kromozomlarının metafaz yayılımına ait bu SKY görüntüsü, 44 otozom ve iki XXX kromozomundan oluşan normal kadın karyotipini göstermektedir. Bu son SKY görüntüsü, 88 otozom ve dört XXXX seks kromozomundan oluşan anormal bir karyotipe sahip bir ADPKD hastasının vasküler dokusundan alınan metafaz yayılımını göstermektedir. Bir ana kopya.

Bu teknik, uygun şekilde uygulandığında beş gün içinde tamamlanabilir.