Name: Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 10 s
Description: Öğrenin, TIRF mikroskopisi ile T hücre reseptörü sinyalleşme olaylarını gerçek zamanlı görüntüleme yöntemini. GFP etiketli ZAP-70 kullanarak protein etkileşimlerinin uzamsal ve zamansal dinamiklerini inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma, Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Enstitüsü İntramural Araştırma Bölümü tarafından desteklenmiştir. Biz bu çalışmalarda kullanılan H57 arasında scFv bize sağlamış Johannes Huppa ve Mark Davis minnettarız. RV bu tekniğin geliştirilmesi sırasında yararlı tartışma Keir Neumann teşekkür etmek istiyorum.

<ol><li>Call, M. E., Wucherpfennig, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T+cell+receptor%3A+critical+role+of+the+membrane+environment+in+receptor+assembly+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The T cell receptor: critical role of the membrane environment in receptor assembly and function.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 101-125 (2005).</li>
<li>Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S.T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">S.T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 591-619 (2009).</li>
<li>Bezbradica, J. S., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+cytokine+and+heterologous+receptor+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Integration of cytokine and heterologous receptor signaling pathways.</a> Nat. Immunol. 10, 333-339 (2009).</li>
<li>Fraser, I. D., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+the+network%3A+signaling+cross-talk+in+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Navigating the network: signaling cross-talk in hematopoietic cells.</a> Nat. Immunol. 10, 327-331 (2009).</li>
<li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Curr. Protoc. Immunol. Chapter 18, 13-13 (2007).</li>
<li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).</li>
<li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25, 117-127 (2006).</li>
<li>Yokosuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat. Immunol. 6, 1253-1262 (2005).</li>
<li>Huppa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463, 963-967 (2010).</li>
<li>Tolar, P., Pierce, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conformation-induced+oligomerization+model+for+B+cell+receptor+microclustering+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A conformation-induced oligomerization model for B cell receptor microclustering and signaling.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 340, 155-169 (2010).</li>
<li>Treanor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane+skeleton+controls+diffusion+dynamics+and+signaling+through+the+B+cell+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The membrane skeleton controls diffusion dynamics and signaling through the B cell receptor.</a> Immunity. 32, 187-199 (2010).</li>
<li>Treanor, B., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insight+into+lymphocyte+activation+through+quantitative+imaging+and+theoretical+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insight into lymphocyte activation through quantitative imaging and theoretical modelling.</a> Curr. Opin. Immunol. 19, 476-483 (2007).</li>
<li>Sylvain, N. R., Nguyen, K., Bunnell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vav1-mediated+scaffolding+interactions+stabilize+SLP-76+microclusters+and+contribute+to+antigen-dependent+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Vav1-mediated scaffolding interactions stabilize SLP-76 microclusters and contribute to antigen-dependent T cell responses.</a> Sci. Signal. 4, ra14-ra14 (2011).</li>
<li>Purbhoo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+subsynaptic+vesicles+and+surface+microclusters+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Dynamics of subsynaptic vesicles and surface microclusters at the immunological synapse.</a> Sci. Signal. 3, ra36-ra36 (2010).</li>
<li>Lasserre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ezrin+tunes+T-cell+activation+by+controlling+Dlg1+and+microtubule+positioning+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">Ezrin tunes T-cell activation by controlling Dlg1 and microtubule positioning at the immunological synapse.</a> EMBO. J. 29, 2301-2314 (2010).</li>
<li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+7%3A+Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).</li>
<li>Williamson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+clusters+of+the+adaptor+Lat+do+not+participate+in+early+T+cell+signaling+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pre-existing clusters of the adaptor Lat do not participate in early T cell signaling events.</a> Nat. Immunol. 12, 655-662 (2011).</li>
</ol>

Bu deneylerde kullanılan tüm hayvanların belirli bir patojen içermeyen ortamda muhafaza edildi ve deneyler Sağlık Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından onaylanmıştır.

Biz burada TIRFM ve yapay ZPT gibi cam desteklenen lipid bilayers kullanarak antijen spesifik primer fare T hücrelerinde sinyal okumak için bir sistem açıklar. Tekniği başarıyla bu hücrelerde GFP tagged proteinleri dayanır. T hücrelerine transferiyle her zaman zor bir iştir. Tipik olarak, retrovirüslerin ya Lentivirüs kullanılarak elektroporasyon ya da gen aktarımının kullanılır. Bir teknik diğerinden üstün değildir, her ikisi kendi sınırlamaları ve avantajları var. 1) Bu retrovirüslerin ancak Lentivirüs için gerekli olduğu hücrelerinin aktif bölünmesi edilmesi gerekmemektedir, ve 2) ifade seviyesini hücreleri görüntüleme önce inkübe edilir zamanda değişen kontrol edilebilir: bu elektroporasyon aşağıdaki avantajlara sahiptir bulmak. Büyük dezavantajı biz çok zor primer hücrelerde boyutu büyük olan proteinlerin ifade bulmak olmasıdır. Biz elektroporasyon sonra bize çok iyi bir hücre canlılığı veren bir yöntem sundu. Sonuç olarak, bu applicab olduğusiRNA aracılı gen susturulması elde etmek için bunu kullanmaya le. Biz de burada chromatically düzeltilir ve farklı dalga boylarında için ayrı hizalama gerektirmez özelleştirilmiş bir iki kanal aynı anda satın TIRF mikroskop açıklar. Bu yetenekleri, ancak, ticari olarak temin edilebilir. Sistemimiz TIRF mikroskopi alanında uzmanlar tarafından yayınlanan ve ticari alternatiflerine göre çok daha ucuzdur ilkelerine dayanmaktadır. Bizim tasarım Olası eleştirilerden biri, biz farklı uyarma dalga boyları için geliş aynı açı ile olmasıdır. Bu farklı uyarma dalga boyları için farklı bir TIRF penetrasyon derinliği neden olacaktır. Biz fani bir dalga katlanarak çürüyen alan ve TIRF alan derinliğini dalga doğrusal bir fonksiyonu olduğu için bu etkiler küçük olduğunu düşünüyorum. Cam yüzeye yakın florofor iki dalga boyları arasında laser yoğunluklarındaki fark yaşayacaksınız. Pe yakın florofor içinyonunun derinliği, yoğunluğu farkı iki dalga boyu 488 ve 561 nm için iki dalga boyu 488 ve 640 nm ve 1.15 kat için 1,3 misli olacaktır. Aynı sistemi TIRF aydınlatma kullanan süper çözünürlük teknikleri ile bağlantılı olarak da kullanılabilir. Ayrıca özel dahili bir iki kamera sistemi tarif var. TIRF sistemi gibi benzer aparatları, aynı zamanda, ticari olarak mevcuttur. Sistemimiz dalga boylarında farklı kombinasyonları ile kullanımına izin veren, filtre ve dichroics değiştirmek için esneklik sunar. Bizim sistemin dezavantajı iki görüntü uyum için yapılması gereken dönme bir derecesidir. Bu sorun piezo tahrik ve uyum dönme dereceleri sunarlar kamera standlar ile çözülebilir. Biz de başarıyla kameralar farklı olduğunu ve değişik piksel boyutlarında sahip olduğu, bu mikroskop iki kamera sistemi hayata geçirdik. Tek tek kanalda duyarlılık ve büyük bir dy gerekirse, bu tür bir sistem yararlı olacaktırBaşka bir aralık içinde pi ile, her ikisi de aynı kamera nadiren mevcuttur. Biz bize 16 mikron piksel boyutu vardır fotometri Quant-EM kamera ile 12.9 mikron bir etkin piksel boyutu veren 2x2 binning de fotometri HQ-2 kamera kullanıldı. A 180 mm odak uzunluğu tüp lens Quant-EM için kullanılan ve 145 mm odak uzaklığı tüp lens HQ-2 kamera kullanıldı. HQ-2 Metamorph yazılım ve Quant-EM dış tetik modu ayrı bir bilgisayarda mikro yöneticisi yazılımı ile kontrol edildi kullanılarak kontrol edildi. Dış tetik Metamorph ve configure aydınlatma ayarlarında ek bir deklanşör olarak uygulanmıştır ölçüm hesaplama DAC kurulu, bir dijital çıkış kullanarak Quant-EM kamera sağlanmıştır. Tüp mercek uzunluklan oranı etkili bir piksel boyutu oranı ile eşleşir. Bir temsili hizalama Şekil 5 de gösterilmiştir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Fare T hücreleri için Amaxa Nucleofector Kit </td><td> Lonza A.Ş. </td><td> VPA-1006 </td><td></td></tr><tr><td> PureLink HiPure Plazmid Midiprep Kiti </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> K2100-05 </td><td> Endotoksin serbest DNA preparatlarıyla için </td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector Aygıt </td><td> Lonza A.Ş. </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Rekombinant Mürin IL-2 </td><td> Peprotech A.Ş. </td><td> 212-12 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent Mikroküreler 0.20μm </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 24050-5 </td><td></td></tr><tr><td> Lab-Tek II 8-iyi odacıklı coverglass </td><td> Thermo Scientific, Nunc </td><td> 155409 </td><td></td></tr></tbody></table>

gerçek zamanlı, tcr eşzamanlı görüntüleme ve İlişkili sinyal proteinler için tirf mikroskopi tekniği

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Bu ana doku uyumu kompleksine (pMHC) antijen sunan hücreler (APC) yüzeyinde ifade edilen proteinleri ile bağlı antijenik peptit parçaları tarafından angaje olduğunda sinyalleşme T hücre reseptör (TCR) ile başlatılır. TCR kompleksi ligand bağlama TCRαβ heterodimer oluşur ilişkilendiren CD3 dimerler (εδ ve heterodimerler εγ ve ζζ homodimer) 1 ile kovalent olmayan. Reseptörünün angajman üzerine, CD3 ζ zincirleri LCK, Src kinaz ailesi tarafından fosforile edilir. Bu daha sonra lck tarafından fosforile ve aktive edilir Syk aile kinaz, Zap70, istihdamına yol açar. Bundan sonra, Zap70 farklı sinyal molekülleri 2 büyük bir sayı içeren proksimal sinyalleşme kompleksinin oluşumunu başlatan, bağdaştırıcı proteinler LAT ve SLP76 fosforile. Kalsiyum ve Ras-bağımlı tra bu kompleks sonunda sonuçların oluşumuoyma yazıyı faktörü aktivasyonu ve T hücre farklılaşması 2 yol gen ifadesi programları karmaşık bir dizi sonuçta başlatılması. TCR sinyalleri (ve farklılaşma oluşan durum) antijen potens ve çapraz co-stimulatory/co-inhibitory ile kemokin ve 3-4 sitokin reseptörleri gibi diğer birçok faktör tarafından modüle edilir. Çeşitli stimülasyon koşullar altında proksimal sinyalizasyon kompleksinin zamansal ve mekansal organizasyon incelenmesi, bu nedenle, TCR sinyal yolu gibi diğer sinyal yolları tarafından düzenlenmesi anlamanın anahtarıdır. T hücrelerinde plazma membranında TCR tarafından başlatılan sinyalizasyon incelemek için bir çok faydalı modelin sistemi olarak daha önce anlatılan cam 5-6 destekli lipid bilayers vardır. Onlar yapay APC&#39;ler olarak T hücreleri-hizmet için antijenik pMHC kompleksleri, yapışma, ve eş-uyarıcı moleküller sunmak için kullanılabilir. Görüntüleme yöntemi ile T hücreleri ile etkileşentoplam iç yansıma florasan mikroskobu (TIRFM) kullanılarak çift katlı lipid, biz 7-8 cam ve hücre yüzeyi arasındaki boşluğun içinde 100 nm için uyarma kısıtlayabilirsiniz. Bu bize resim öncelikle sinyal olaylar plazma membranı meydana gelen sağlar. Biz görüntüleme TCR kompleks proteinler sinyal alımı ilgilenen, biz iki kamera TIRF görüntüleme sistemi tanımlamak neyin H57 antikor floresan Fab etiketlenmiş TCR, (fragman antijen bağlama) parçaları (hibridoma H57-597 arınmış , ATCC, ATCC No: GFP ile etiketlenmiş TCRβ için spesifik olan HB-218), ve sinyal proteinleri, aynı anda ve gerçek zamanlı olarak görüntülenmiştir edilebilir. Bu strateji, T hücrelerinin hem de ve TCR gerçekleştiğini sinyalizasyon olaylar son derece dinamik doğası nedeniyle gereklidir. Bu görüntüleme yöntemi görüntü tek ligandlar 9-11 yanı sıra aktif reseptörlerine sinyal moleküllerinin alımı ve araştırmacılar izin verdi12-16 in-situ biyokimya eğitim için mükemmel bir sistemdir.

Dolayısıyla, bu işe dahil olan proteinlerin mekansal ve zamansal davranışlarını incelemek için önemli sinyal anlamak için; plazma zarının içinde ya da hücre içi konumlara ya proteinlerin kompartımanlara büyük ölçüde sinyal sonuçlarını etkileyebilecek bir düzenleyici mekanizmadır. Burada T hücrelerinde sinyal iletimi çalışmak üzere bir TIRF mikroskopi tabanlı sistemi tanımlamak, ama genel olarak uygulanabilir.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Sinyalleşme, Major Histokompatibilite Kompleksi tarafından bağlanan antijenik peptid fragmanları ile etkileşime girdiğinde T Hücre Reseptörü (TCR) aracılığıyla başlatılır...

Bu video, çift kanallı eş zamanlı görüntüleme kullanarak T-hücresi reseptör sinyal olaylarının izlenmesine yönelik bir prosedürü açıklamaktadır. Toplam iç yansıma floresan mikroskobu veya TURF mikroskobu kullanılarak, öncelikle T-hücreleri GFP etiketli ZAP 70 kodlayan bir plazmid ile transfekte edilir; ardından lipid çapalı peptid MHC kompleksleri, adezyon molekülleri ve ko-stimülatör moleküller içeren, cam destekli bir lipid çift tabakası hazırlanır.T-hücre reseptörleri peptid MHC kompleksleri ile etkileşime girdiğinde, ZAP 70 transfekte edilmiş T hücreleri çift katmanlı yapıya eklenir. T-hücre reseptörü ile ilişkili CD3 zincirleri, SARC ailesi kinazı LCK tarafından fosforillenebilir ve zap 70 kinazı sitoplazmadan bölgeye çağrılır. Ardından T-hücre reseptörü floresanla işaretlenir ve hücrelerin, lamel camdan daha düşük kırılma indeksine sahip bir ortamda daldırıldığı ve toplam iç yansıma gerçekleşecek bir açıyla lazer ışınıyla aydınlatıldığı görüntüleme işlemi gerçekleştirilir.Bu, cam-su arayüzeyinde, ortam içinde eksponansiyel olarak sönümlenen ve 100 ila 200 nanometre arasında bir penetrasyon derinliğine izin veren bir evanesan dalga oluşturur. Böylece yalnızca plazma membranındaki veya buna çok yakın konumdaki floroforlar uyarılır. Elde edilen görüntülerin analizi, sinyalizasyonun T hücresi reseptör mikro kümelerinde gerçekleştiğini ortaya koyar.TIRF mikroskobisi veya konvansiyonel konfokal mikroskobinin temel avantajı, sinyal kümeleri veya TCR mikro kümeleri gibi sinyal komplekslerinin kolayca görselleştirilebileceği daha yüksek bir çözünürlük elde etmenizdir. Laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacılar Travis Crites ve Chen, maxi nucleo affection teknolojisini kullanarak primer fare T hücrelerinin nasıl transfekte edileceğini ve ardından antijen içeren cam destekli lipid çift katman ile stimüle edilerek total internal yansıma floresan mikroskobisi (TIRFM) ile nasıl görüntüleneceklerini gösterecekler.Bu yöntem; T hücreleri, B hücreleri, doğal öldürücü hücreler ve mast hücreleri dahil olmak üzere çeşitli bağışıklık hücrelerindeki sinyal iletimini incelemek için kapsamlı bir şekilde kullanılmıştır. Yöntem geniş bir uygulama alanına sahiptir ve özellikle sinyal iletiminin kümeler halinde gerçekleştiği durumlar olmak üzere, memeli hücrelerindeki çoğu reseptör sistemini incelemek için kullanılabilir. T hücrelerinin transfeksiyonunun çok zor olması nedeniyle, yönteme yeni başlayan kişiler başlangıçta zorluk yaşayabilirler.Buna ek olarak, T-hücresi canlılığı ve transfeksiyon verimliliğinin yanı sıra bilar kalitesinin ve mikroskop hizalamasının standartlara uygun olması için hassas bir koordinasyon gereklidir. Bu prosedürün ilk adımı, bir AM maxa mouse T-hücresi nükleofil efektör kiti kullanarak, naif veya in vitro aktive edilmiş primer T-hücrelerine ekspresyon plazmidleri ve GFP ile işaretlenmiş kodlayan sinyal moleküllerinin transfekte edilmesidir. Bu çalışmada kullanılan tüm T hücreleri, K'nın MHC molekülü IE'sinde bulunan MCC peptidini tanıyan A-N-D-T-C-R'yi eksprese etmiştir. Burada gösterilen transfeksiyon prosedürü, üretici tavsiyelerine göre gerçekleştirilmektedir.Bununla birlikte, transfeksiyondan sonra T hücrelerinin canlılığını artırmaya yönelik bazı ipuçları sunulmuştur. Hem canlılık hem de transfeksiyon verimliliği, in vitro aktive edilmiş T hücrelerinde naif hücrelere göre daha yüksektir; bu nedenle, bu protokol başlangıçta in vitro aktive edilmiş T hücrelerini kullanmaktadır. Kit ile sağlanan 1,9 mililitre ortamı, 20 mikrolitre bileşen A'yı, 20 mikrolitre bileşen B'yi ve 100 mikrolitre fetal bovine serumu iki mililitrelik bir tüpte birleştirerek her bir transfeksiyon için iki mililitre desteklenmiş T-hücre ortamı hazırlayın.Bir 12 kuyucuklu plakadaki her bir kuyucuğa iki mililitre besiyeri aktarın. Besiyerinin dengelenmesi için plakayı 37 °C'deki nemlendirilmiş bir inkübatöre en az bir saatliğine yerleştirin; soğuk olan veya pH değeri 7.2 olmayan besiyerinde transfekte edilmiş hücrelerin resüspansiyonu hücre ölümüne yol açacaktır. Transfeksiyon karışımını hazırlamak için, 82 µL fare T-hücre nükleo efektör çözeltisini 18 µL supplement 2 ve konsantrasyonu 0.5 µg/µL'den düşük olmayan beş mikrogram endotoksin içermeyen plazmid DNA ile birleştirin ve vurarak iyice karıştırın.Beş ila 10 milyon hücreyi 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 75 ×g hızında santrifüjleyin. Hücre peletini transfeksiyon karışımı içinde yeniden süspande etmek için süpernatantın mümkün olduğunca fazlasını vakumlu aspiratörle uzaklaştırın ve büyük hücre kümeleri kalmayana kadar hücre peletini yavaşça ve nazikçe üç ila dört kez aspire edin. Süspansiyonu, hava kabarcığı kalmadığından emin olarak bir pipet yardımıyla dikkatlice sertifikalı bir amaxa vete'ye aktarın.Nükleo efektör cihazı üzerindeki nükleer efektör program X 0 0 1'i seçip onaylayın. Vete'yi Q vete tutucuya yerleştirin ve seçilen programı uygulamak için düğmeye basın. Ardından, vete'yi ve önceden dengelenmiş kültür ortamını derhal çeker ocağa aktarın.Sağlanan plastik pipeti kullanarak, önceden dengelenmiş ortamdan yaklaşık 500 microliter miktarını vete'ye ekleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu plaktaki ortama damla damla ekleyin.GFP etiketli proteinlerin düşük düzeyde ekspresyonuna izin vermek ve aşırı ekspresyondan kaynaklanan artefaktların oluşumunu en aza indirmek için hücreleri 37 °C'de dört saat boyunca inkübe edin. Bu bölümde, mikroskobun tüm bileşenlerine güç verilmeden önce, iki kanallı eş zamanlı görüntüleme için mikroskobun hizalanma yöntemi açıklanmaktadır. Bilgisayarı ve yazılımı başlatın.Ardından, tüm donanım bileşenlerinin yazılım tarafından tanındığından emin olun. Yazılım herhangi bir hata mesajı vermeden başladığı için tüm bileşenler tespit edilmiştir. Bir µL alt çözünürlüğü seyreltin.Kolokalizasyon standardı olarak kullanmak üzere, Flores parlak çok renkli floresan mikrokürelerini iki mililitre PBS içine ekleyin. Ardından, mikroküre süspansiyonundan 0,25 mililitreyi bir lab tech sekiz kuyucuklu oda sistemli lamel cam sisteminin her bir kuyucuğuna ekleyin. Oda lam sistemini objektifin üzerindeki platforma yerleştirin.Ardından, canlı önizlemede cam üzerindeki boncuk emilimünü odağa getirin. Sol panel, GFP transfekte hücrelerin görünür olacağı kanaldır. Sağ panel ise canlı hücre görüntüleme deneyleri sırasında işaretlenmiş TCR'yi gösterecektir.XY, Z fiber çıkışının Y hizalamasını kullanarak, lazer ışınının objektiften çıkıp tavana yansıyacağı şekilde ışın konumunu ayarlayın. Bunu, objektifin cam düzleminin odaklandığı konumda olması sırasında yapmanız önemlidir. Tavandaki ışın dağınıksa, ışın kolime edilmemiş demektir.Deneyde kullanılacak her bir lazer hattı için tam kolimasyon test kolimasyonunu sağlamak amacıyla Z mikrometresini ayarlayın. Ardından, bir lazer güç ölçer kullanarak, her kanal için lazer gücünü 20 ila 30 µW değerine ayarlayın. T hücreleri lazer radyasyonuna karşı son derece hassastır ve aydınlatma toplamda 50 µW ile sınırlandırılmıştır.Sıradaki adım, turf için açıyı ayarlamaktır. Işının objektiflerin optik eksenine göre açısı 90 dereceye yaklaşana kadar, ışını tavandan uzaklaştırmak için fiber lansmanındaki Y hizalama mikrometresini çevirin.Tam iç yansıma için kritik açıya ulaşıldığında, lazer ışığı artık objektiften çıkmayacaktır. Turf hizalamasının sağlanıp sağlanmadığını değerlendirmek için, örtü camı düzlemi boyunca yukarı ve aşağı odaklama yapın. Burada, yüzeye tutunan boncuklar odağın dışına çıktığında, solüsyonda yüzen birçok boncuğun görülebileceğini fark edin. İyi bir turf hizalaması elde etmek için, ışının objektife göre açısını artırmak gerekir.Işın açısı artırıldığında, yüzeye yakın bölgede yüzen boncuklar gözden kaybolmaya başlar ve ara yüzeye tutunmuş boncukların yoğunluğu artar. Şimdi, ara yüze tutunmuş boncuklar odak dışına çıkarıldığında, çözelti içinde yüzen hiçbir boncuk görünür kalmaz. Bu noktada, yalnızca lamıla tutunmuş boncukların odaklanabilmesi sayesinde düzenek doğru şekilde hizalanmış olur.Ardından, kırmızı ve yeşil floresan kanalları birbiriyle hizalamak için boncuklara odaklanın ve her iki kanalda üretilen görüntülerdeki ayırt edici özelliklerin konumlarını karşılaştırın. Bir kamera standındaki X ve Y mikrometre vidalarını kullanarak, boncukların göreceli konumlarını mümkün olduğunca birbirine yaklaştırın. İki kanal arasındaki mekansal hizalamayı sağlamak için her iki görüntünün sol alt kadranındaki parlak boncuğu dikkate alın.Bu özellik, her iki görüntüde de aynı göreceli konuma getirilir. Her iki kanaldan görüntüyü yakalayın ve kaydedin. Bu görüntüler, iki kanalı hizalamak için bir kolokalizasyon standardı olarak kullanılacaktır.Bu hizalamaya dair bir örnek, hizalama öncesinde burada görülmektedir. Alt çözünürlüklü boncukların iki kanalından gelen görüntülerin üst üste bindirildiği bu görselde gösterildiği gibi, kanallardan biri diğerine göre dönmüştür. Ayarlamaların ardından görüntüler, burada gösterildiği şekilde hizalanmıştır.Hizalamanın kalitesi, GFP transfekte edilmiş canlı hücrelerin görüntüleri karşılaştırılarak daha ayrıntılı bir şekilde incelenebilir. İki kanaldan elde edilen Laila podyumlarının nasıl mükemmel şekilde hizalandığına dikkat edin. Bu işlem, floresan mikroboncuklar kullanılarak oluşturulan kalibrasyon aracılığıyla iki görüntünün hizalanmasından sonra gerçekleştirilmiştir.Mikroskop kurulduktan sonra, antijen sunan cam destekli lipid çift katmanları içeren akış odaları hazırlanır ve önce substratla etkileşime giren TRANSFEKTE edilmiş T hücrelerini görüntülemek için turf M uygulanır. Ana ve Dustin tarafından açıklanan protokolü takip ederek, Ni-NTA lipidleri, adhezyon molekülü ICAM-1 ve peptit MHC kompleksleri içeren cam lam üzerinde oluşturulmuş düzlemsel lipid çift katmanlı bir akış odası kurulur. MCC yüklü IEFK'ler, histidin etiketleri aracılığıyla çift katmana dahil edilir.Ko-stimülatör molekül CD 80 dahil edilir. Bir GPI çıpası kullanarak, akış hücresini mikroskop tablasına yerleştirin ve hücreyi sabitlemek için bir gergi çubuğu yardımıyla hazneyi mikroskop tablasındaki bir adaptör plakasına tutturarak stabilize edin. Ardından, sıcaklığını kontrol etmek için üretici tarafından sağlanan ısıtma elemanını akış hücresine takın.Objektifi bir çift katman üzerine konumlandırın ve objektifin ve akış hücresinin ısıtılmasını sağlamak için çift katman düzlemini odaklayın; bölme sıcaklığını 37 °C'ye getirmek için akış hücresi ve objektif ısıtıcılarını açın. Dört saatlik inkübasyonun ardından, transekte edilmiş T hücrelerini 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 80 ×g hızda santrifüjleyin. Hücreleri 300 µL H-B-S-B-S-A tamponunda yeniden süspande edin. Ardından, TCR'yi etiketlemek için Fab için nihai konsantrasyonu 10 µg/mL veya tek zincirli değişken fragman için 20 µg/mL olacak şekilde H 57 FAB veya H 57 tek zincirli değişken fragman ekleyin.Hücreleri beş mililitrelik bir faks tüpüne aktarın. Ardından, bir mililitrelik slip tip şırınga kullanarak hücreleri üç yollu bir vana aracılığıyla akış odasına enjekte edin. Çift kanallı canlı görüntüleme, TCR ve GFP kanallarının canlı önizlemesini gösterecek şekilde görüntüleme koşullarını ayarlayın ve transfected hücrelerin bulunduğu bir alan bulun.TCR ve GFP arasındaki yoğunluk farkları nedeniyle, hücrelerin her iki kanalda da görüntülenebilmesi için görüntülerin ölçeklemesi gerçek zamanlı olarak ayarlanması gerekebilir. Burada olduğu gibi, herhangi bir lateral membran boyanmasını tespit etmek için cam düzleme odaklanarak turf aydınlatmasını doğrulayın. Lateral membranlar odağa girmiyorsa, turf hizalaması uygun demektir.Bu canlı önizlemede, lateral membran boyaması hem lamın düzleminde hem de mikroskobun iyi bir tür hizalamasına getirilmesi için lam odak dışında bırakıldığında belirgindir. Lazerin objektife göre açısı artırılır ve lateral membran odak dışına çıkar. 10 saniyelik aralıklarla tekil görüntüler ve zaman ayarlı sekanslar yakalamaya başlayın.Hücreler beş dakika boyunca, kare mikrometre başına altı peptit yüklü hist-etiketli IEFK molekülü, kare mikrometre başına 100 Alexa 647 konjuge hist-etiketli ICAM-1 molekülü ve kare mikrometre başına 100 GPI çapalı CD80 molekülü içeren cam destekli INTA çift katmanları üzerinde inkübe edildi. Alexa 546 konjuge H57 FAB fragmanının sürekli varlığında çift kanallı eşzamanlı kazanımlı turf mikroskopi gerçekleştirildi.TCR'yi boyamak için hücreler, çift tabakayla ilk temasın üzerinden bir saate kadar geçen süre boyunca görüntülendi. Hücre başına ZAP 70 küme sayıları, otomatik bir küme sayım yazılımı kullanılarak analiz edildi. Her durumda en az 40 hücre analiz edildi.Yüklenen peptitler iç resimde belirtilmiştir. ICAM 1, kare mikrometre başına 100 molekül Alexa 647 konjugeli His-etiketli ICAM 1 içeren çift katmanlar üzerindeki hücreleri ifade eder. Şekilde gösterildiği üzere, kare başına 10 saniyede çekilen bu videoda görülebileceği gibi, zap 70 bağımlı sinyal iletimi TCR mikro kümelerinde ve yalnızca agonist ligandlara yanıt olarak gerçekleşir.Agonist peptitlere yanıt olarak gelişen TCR sinyalleşmesi, temas alanının çevresinde ZAP 70'i mobilize eden TCR mikro kümelerinin sürekli oluşumuyla sürdürülür. Bu videoyu izledikten sonra, maksima nükleer affeksiyon teknolojisi kullanılarak primer T hücrelerinin nasıl transfekte edileceğini ve TURF mikroskopi kullanılarak GFPT sinyal moleküllerinin TCR mikro kümelerine alımının nasıl uygun şekilde görüntüleneceğini iyi kavramış olmalısınız. Bu teknik üzerinde uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde yedi saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken, primer hücrelerinize karşı çok nazik olmanız gerektiğini unutmamak önemlidir. Deneyin her adımında hücreler ne kadar sağlıklı olursa, transfeksiyon veriminiz o kadar yüksek olur ve görüntülemede o kadar çok hücre yakalarsınız. T hücreleri oldukça hareketlidir ve sonuç olarak, TCR ve GFP kanallarının ardışık görüntülenmesi, TCR mikro kümelerinin ve hücrelerin hareketi nedeniyle iki görüntünün mükemmel şekilde hizalanmamasına neden olur.Bu sorunun üstesinden gelmek için, çift kanallı eş zamanlı veri toplama özellikli turf mikroskobu geliştirdik.

a-tirf-microscopy-technique-for-real-time-simultaneous-imaging-tcr

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Toplam İç Yansıma Floresans (TIRF) mikroskopi yakın yüksek kontrast ve zamansal çözünürlükte hücre yüzeyine yapıları gözlemlemek için güçlü bir yaklaşımdır. Biz TIRF hücre duvarı kapalı bakteriyel ve mantar hücreleri kortekste protein dinamiklerini incelemek için istihdam edilebilir göstermek.

Mikroorganizmalarda Cortex Organizasyon ve Dinamiği Görselleştirme, Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanılarak

Bu videoda, aktin ve mikrotübül polimerizasyon dinamiklerini görselleştirmek için toplam iç yansıma mikroskobu tabanlı bir teknik olan TIRF açıklanmaktadır. Yöntem, hücresel karışmaları anlamak için gerekli olan aktin ve mikrotübül eşleşme dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine izin verir.

Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğini Görselleştirmek için TIRF Mikroskobu

Kaynak: Daniele, F., et. al SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde Nörotransmitter Vezikül Dinamiklerini Değerlendirmek için TIRFM ve pH'a duyarlı GFP probları: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi. J. Vis. Uzm. (2015). Bu video, florofor etiketli sinaptik vezikülleri görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak insan nöroblastom hücrelerinin görüntülenmesini göstermektedir. Hücreler ilk olarak epifloresan modunda odaklanır. Daha sonra, zarın yakınındaki floroforları...

Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu Kullanılarak Hücre Görüntüleme

Biz T-hücre aktivasyonu işlemi sırasında protein dinamiği içgörü sağlayan bir canlı hücre görüntüleme yöntem açıklanmaktadır. Bu kantitatif sonuçlar T-hücresi aktivasyonu boyunca kompleks oluşumu sinyalizasyon takip vermek üzere T-hücresi yayılmasını tahlilinde, konfokal mikroskopi ve görüntü analizi, kombine kullanımını göstermektedir.

T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal

Bu protokol, canlı hücrelerin yüzeyindeki tek reseptörleri görselleştirmek ve izlemek ve böylece reseptör yanal hareketliliğini, reseptör komplekslerinin boyutunu analiz etmek ve ayrıca geçici reseptör-reseptör etkileşimlerini görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan mikroskobunun nasıl kullanılacağını açıklar. Bu protokol diğer zar proteinlerine genişletilebilir.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Klatrin aracılı endositoz, hızlı ve oldukça dinamik bir süreç, sinyal reseptörleri de dahil olmak üzere birçok proteini içselleştirir. Burada açıklanan protokol, bireysel endositik olayların kinetiğini doğrudan görselleştirir. Bu, endositik makinenin çekirdek üyelerinin birbirleriyle nasıl koordine olduğunu ve protein yükünün bu süreci nasıl etkilediğini anlamak için gereklidir.

TIRF Mikroskopi ile Tek olay ebatları da G protein-bağlanmış alıcılar üzerinden Klatrin dolayımlı endositoz görselleştirme

Bu el yazması, işlevselleştirilmiş düzlemsel destekli lipid çift tabakası ile temas halinde olan bir T hücresinin immünolojik sinapsı içinde meydana gelirken, T hücresi antijen reseptörü (TCR) ile antijenik peptit yüklü MHC molekülleri arasındaki bağlanma dinamiklerini ölçmek için (tek moleküllü) Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) tabanlı testlerin nasıl yapılacağını açıklar.

TCR-pMHC Bağlama Ölçüm<em&gt; In Situ</em&gt; Bir FRET tabanlı Mikroskopi Assay kullanılarak

pH'ya duyarlı bir florofor ile bir membran proteinin hücre dışı alanını Etiketleme, superecliptic pHluorin (SEP), hücre içi lokalizasyonu, sentezleme ve trafik saptanmasına olanak sağlamaktadır. Görüntüleme toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) proteinleri Eylül-etiketli periferal ER ve plazma membranı protein seviyelerinin ölçümü sağlar.

pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

Burada, iki mikrotübül popülasyonunun dinamiklerini aynı anda ölçmek ve karşılaştırmak için TIRF mikroskopi tabanlı in vitro resusyon testi sunulmaktadır. Çapraz bağlı mikrotübül demetleri ve tek mikrotübüller üzerindeki çoklu mikrotübül ile ilişkili proteinlerin kolektif aktivitesini eşzamanlı olarak görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Çapraz Bağlı ve Tek Mikrotübüllerin Dinamiğinin In Vitro TIRF Mikroskobu ile Eşzamanlı Görselleştirilmesi

Dinamik mikrotübüllerin ve floresan olarak etiketlenmiş mikrotübülle ilişkili proteinlerin eşzamanlı görüntülenmesi için girişim-yansıma mikroskobu ve toplam-iç-yansıma-floresan mikroskobu uygulamak için bir protokol sunuyoruz.

Dinamik Mikrotübülleri ve İlişkili Proteinleri Görüntülemek için Eşzamanlı Girişim Yansıması ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu

Bu protokol, in vitro toplam iç floresan (TIRF) mikroskopi testi kullanarak dinamik aktin ve mikrotübülleri görselleştirmek için bir kılavuzdur.

Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğinin In Vitro Total İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu ile Görselleştirilmesi

Öğrenin, TIRF mikroskopisi ile T hücre reseptörü sinyalleşme olaylarını gerçek zamanlı görüntüleme yöntemini. GFP etiketli ZAP-70 kullanarak protein etkileşimlerinin uzamsal ve zamansal dinamiklerini inceleyin.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Daha fazla video keşfet