Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Bu video, çift kanallı eş zamanlı görüntüleme kullanarak T-hücresi reseptör sinyal olaylarını takip etme prosedürünü açıklamaktadır. Toplam iç yansıma floresan mikroskobu veya TIRF mikroskobu kullanılarak, öncelikle T-hücreleri GFP etiketli ZAP 70 kodlayan bir plazmid ile transfekte edilir; ardından lipid çapalı peptid MHC kompleksleri, adezyon molekülleri ve ko-stimülatör moleküller içeren cam destekli bir lipid çift tabaka hazırlanır.

T-hücresi reseptörleri peptid MHC kompleksleri tarafından etkileşime girdiğinde, ZAP 70 transfekte edilmiş T hücreleri çift katmana eklenir. T-hücresi reseptörü ile ilişkili CD3 zincirleri, SRC ailesi kinazı LCK tarafından fosforillenir ve zap 70 kinazı sitoplazmadan buraya çekilir. Ardından T-hücresi reseptörü floresanla işaretlenir ve hücrelerin lamel camdan daha düşük kırılma indisine sahip bir ortama daldırıldığı ve toplam iç yansıma gerçekleştiren bir açıyla lazer ışınıyla aydınlatıldığı görüntüleme işlemi uygulanır.

Bu, cam-su arayüzünde, ortama doğru eksponansiyel olarak sönümlenen ve 100 ila 200 nanometre arasında bir penetrasyon derinliği sağlayan bir evanescent dalga oluşturur. Böylece sadece plazma membranındaki veya buna çok yakın olan floroforlar uyarılır. Elde edilen görüntülerin analizi, sinyalleşmenin T hücresi reseptör mikro kümelerinde gerçekleştiğini ortaya koymaktadır.

TIRF mikroskopisinin veya konvansiyonel konfokal mikroskopisinin temel avantajı, TCR mikro kümeleri gibi sinyalizasyon kümelerinin veya sinyalizasyon komplekslerinin kolayca görselleştirilmesini sağlayan daha iyi bir çözünürlük elde etmenizdir. Laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacılar Travis Crites ve Chen, maxi nucleo affection teknolojisini kullanarak primer fare T hücrelerinin nasıl transfekte edileceğini ve ardından antijen içeren cam destekli lipid çift tabakası ile stimüle edilerek total internal refleks floresan mikroskopisi veya TIRFM kullanılarak nasıl görüntüleneceklerini göstereceklerdir.

Bu yöntem; T hücreleri, B hücreleri, doğal katil hücreler ve mast hücreleri dahil olmak üzere çeşitli bağışıklık hücrelerindeki sinyal iletimini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Yöntem geniş bir uygulama alanına sahiptir ve memeli hücrelerindeki çoğu reseptör sistemini, özellikle sinyal iletimi kümeler halinde gerçekleşiyorsa incelemek için kullanılabilir. Yönteme yeni başlayanlar, T hücrelerinin transfeksiyonunun oldukça zor olması nedeniyle başlangıçta güçlük çekebilirler.

Ek olarak, T hücresi canlılığı ve transfeksiyon verimliliğinin yanı sıra bilar kalitesinin ve mikroskop hizalamasının istenen düzeyde olması için hassas bir koordinasyon gereklidir. Bu prosedürün ilk adımı, AM maxa mouse T-cell nucleo effector kiti kullanarak, naif veya in vitro aktive edilmiş primer T hücrelerini ekspresyon plazmidleri ve GFP ile işaretlenmiş kodlayan sinyal molekülleri ile transfekte etmektir. Bu çalışmada kullanılan tüm T hücreleri, K'nın MHC IE molekülünde bulunan MCC peptidini tanıyan A-N-D-T-C-R eksprese etmiştir. Burada gösterilen transfeksiyon prosedürü, üreticinin önerilerine uygun olarak gerçekleştirilir.

Bununla birlikte, transfeksiyon sonrası T hücrelerinin canlılığını artıran bazı ipuçları sunulmuştur. Hem canlılık hem de transfeksiyon verimliliği, in vitro aktive edilmiş T hücrelerinde naif hücrelere göre daha yüksektir; bu nedenle, bu protokol başlangıçta in vitro aktive edilmiş T hücrelerini kullanır. Her transfeksiyon için; 1,9 ml kit içinde sağlanan besiyeri, 20 µL bileşen A, 20 µL bileşen B ve 100 µL fetal bovine serumu iki mililitrelik bir tüpte birleştirerek iki mililitre takviye edilmiş T hücresi besiyeri hazırlayın.

12 kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa iki mililitre besiyeri aktarın. Besiyerinin dengelenmesi için plağı 37 °C'deki nemlendirilmiş bir inkübatöre en az bir saatliğine yerleştirin; transfekte edilmiş hücrelerin soğuk veya pH'ı 7.2 olmayan bir besiyerinde süspansiyona getirilmesi hücre ölümüne yol açacaktır. Transfeksiyon karışımını hazırlamak için, 82 µL fare T-hücresi nükleo efektör çözeltisini, 18 µL supplement iki ve µL başına 0.5 µg'dan düşük olmayan bir konsantrasyonda beş µg endotoksin içermeyen plazmid DNA ile birleştirin ve hafifçe vurarak iyice karıştırın.

Beş ila 10 milyon hücreyi 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 75 ×g hızında santrifüjleyin. Hücre peletini transfeksiyon karışımı içinde yeniden süspande etmek için süpernatanın mümkün olduğunca fazlasını vakumlu aspiratör ile uzaklaştırın ve büyük hücre kümeleri kalmayana kadar hücre peletini nazikçe ve yavaşça üç ila dört kez aspire edin. Bir pipet kullanarak, hava kabarcığı kalmadığından emin olarak süspansiyonu dikkatlice sertifikalı bir amaxa vete içine aktarın.

Nükleo efektör cihazı üzerinde qve seçili nükleer efektör programı X 0 0 1'i ayarlayın. vete'yi Q vete tutucusuna yerleştirin ve seçilen programı uygulamak için düğmeye basın. Ardından vete'yi ve ön dengelenmiş kültür ortamını derhal çeker ocağa aktarın.

Sağlanan plastik pipeti kullanarak, önceden dengelenmiş ortamdan yaklaşık 500 microliters miktarını vete'ye ekleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu plaktaki ortama damla damla ekleyin.

GFP etiketli proteinlerin düşük düzeyde ekspresyonuna izin vermek ve aşırı ekspresyondan kaynaklanan artefaktların görünümünü minimize etmek için hücreleri 37 °C'de dört saat boyunca inkübe edin. Bu bölümde, mikroskobun tüm bileşenlerine güç verilmeden önce, iki kanallı eş zamanlı görüntüleme için mikroskobun hizalanma yöntemi açıklanmaktadır. Bilgisayarı ve yazılımı başlatın.

Ardından, tüm donanım bileşenlerinin yazılım tarafından tanındığından emin olun. Yazılım herhangi bir hata mesajı vermeden başladığına göre, tüm bileşenler tespit edilmiştir. Bir mikrolitre alt çözünürlüğü seyreltin.

Kolokalizasyon standardı olarak kullanmak üzere, Flores parlak çok renkli floresan mikroküreleri iki mililitre PBS içine ekleyin. Ardından, mikroküre süspansiyonundan 0,25 mililitreyi lab tech sekiz kuyucuklu oda sistemli lamel cam sisteminin her bir kuyucuğuna ekleyin. Oda sistemli lameli objektifin üzerindeki platforma yerleştirin.

Ardından, canlı önizlemede cam üzerindeki boncuk absorpsiyonunu odaklayın. Sol panel, GFP transfekte hücrelerin görünür olacağı kanaldır. Sağ panel ise canlı hücre görüntüleme deneyleri sırasında işaretlenmiş TCR'yi gösterecektir.

XY, Z fiber çıkışının Y hizalamasını kullanarak, lazer ışınının objektiften dışarı çıkmasını ve tavana yansımasını sağlayacak şekilde ışının konumunu ayarlayın. Bunu, objektifin cam düzlemin odaklandığı konumda olması durumunda yapmak önemlidir. Tavandaki ışın yayılıyorsa, ışın kolime edilmemiştir.

Deneyde kullanılacak her bir lazer hattı için tam kolimasyon testi kolimasyonunu sağlamak amacıyla Z mikrometresini ayarlayın. Ardından, bir lazer güç ölçer kullanarak her kanal için lazer gücünü 20 ila 30 µW arasına ayarlayın. T hücreleri lazer radyasyonuna karşı son derece hassastır ve aydınlatma toplamda 50 µW ile sınırlandırılmıştır.

Ardından turf için açı ayarı yapılır. Işın açısı objektiflere göre optik eksene 90 derece yaklaşana kadar, ışını tavandan uzaklaştırmak için fiber başlatıcıdaki Y hizalama mikrometresini çevirin.

Tam iç yansıma için kritik açıya ulaşıldığında, lazer ışığı artık objektiften çıkmayacaktır. Turf hizalamasının sağlanıp sağlanmadığını değerlendirmek için, lamel düzlemi boyunca yukarı ve aşağı odaklama yapın. Burada, yüzeye tutunan boncuklar odak dışına çıkarıldığında, birçok boncuğun çözelti içinde yüzdüğünün görülebileceğini fark edin. İyi bir turf hizalaması elde etmek için, ışının objektife göre açısını artırmak gerekir.

Işın açısı arttıkça, yüzeye yakın yüzen boncuklar kaybolmaya başlar ve ara yüzeye absorbe olan boncukların yoğunluğu artar. Şimdi, ara yüzeye absorbe olan boncuklar odak dışına çıkarıldığında, çözeltide yüzen hiçbir boncuk görünür kalmaz. Bu noktada, yalnızca lamelle absorbe olan boncuklar odaklanabildiği için düzenek uygun şekilde hizalanmış olur.

Ardından, kırmızı ve yeşil floresan kanallarını birbirine göre hizalamak için boncuklara odaklanın ve her iki kanalda üretilen görüntülerdeki tanımlanabilir özelliklerin konumlarını karşılaştırın. Bir kamera standındaki X ve Y mikrometre vidalarını kullanarak boncukların göreceli konumlarını mümkün olduğunca yakınlaştırın. İki kanal arasındaki uzamsal hizalamayı sağlamak için her iki görüntünün sol alt kadranındaki parlak boncuğa dikkat edin.

Bu özellik, her iki görüntüde de aynı göreceli konuma getirilir. Her iki kanaldan görüntü alınır ve kaydedilir. Bu görüntüler, iki kanalı hizalamak için bir kolokalizasyon standardı olarak kullanılacaktır.

Bu hizalamanın bir örneği, hizalama öncesinde burada görülmektedir. Alt çözünürlüklü boncukların iki kanalından gelen görüntülerin üst üste bindirildiği bu görüntüde gösterildiği üzere, kanallardan biri diğerine göre döndürülmüştür. Ayarlamaların ardından, görüntüler burada gösterildiği gibi hizalanır.

Hizalamanın kalitesi, GFP transfekte edilmiş canlı hücrelerin görüntüleri karşılaştırılarak daha ayrıntılı bir şekilde incelenebilir. Floresan mikroboncuklar kullanılarak oluşturulan kalibrasyon ile iki görüntü hizalandıktan sonra, iki kanaldaki Laila podyumunun nasıl mükemmel bir şekilde hizalandığına dikkat edin.

Mikroskop kurulduktan sonra, antijen sunan cam destekli lipid çift katmanları içeren akış odaları hazırlanır ve önce substratla etkileşime giren TRANSFEKTE T hücrelerini görüntülemek için turf M uygulanır. Ana ve Dustin tarafından açıklanan protokolu takip ederek, NI-NTA lipidleri, adezyon molekülü ICAM-1 ve peptid MHC komplekslerini içeren bir lam üzerinde oluşturulmuş düzlemsel lipid çift katmanlı bir akış odası kurun. MCC yüklü IEFK, histidin etiketleri aracılığıyla çift katmana dahil edilir.

Ko-stimülatör molekül CD 80 dahil edilir. Bir GPI çapası kullanarak akış hücresini mikroskop tablasına yerleştirin ve hücreyi sabitlemek için bir gergi çubuğu yardımıyla hazneyi mikroskop tablasındaki bir adaptör plakasına tutturarak stabilize edin. Ardından, sıcaklığını kontrol etmek için akış hücresine üretici tarafından sağlanan ısıtma elemanını takın.

Objektifi bir çift tabaka üzerine konumlandırın ve objektifin ve akış hücresinin ısıtılabilmesi için çift tabaka düzlemini odaklayın; oda sıcaklığını 37 °C'ye getirmek için akış hücresi ve objektif ısıtıcılarını açın. Dört saatlik inkübasyonun ardından, transekte edilmiş T hücrelerini 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 80 ×g hızda santrifüjleyin. Hücreleri 300 µL H-B-S-B-S-A tamponunda yeniden süspande edin. Ardından, TCR'yi etiketlemek için FAB H57'yi (final konsantrasyonu 10 µg/mL olacak şekilde) veya tek zincirli değişken fragman H57'yi (final konsantrasyonu 20 µg/mL olacak şekilde) ekleyin.

Hücreleri beş mililitrelik bir faks tüpüne aktarın. Ardından, bir mililitrelik uçlu şırınga kullanarak hücreleri üç yollu bir valf aracılığıyla akış hücresine enjekte edin. Çift kanallı canlı görüntüleme, TCR ve GFP kanallarının canlı önizlemesini gösterecek şekilde görüntüleme koşullarını ayarlayın ve transfekte edilmiş hücrelerin bulunduğu bir alan bulun.

TCR ve GFP arasındaki yoğunluk farkları nedeniyle, hücrelerin her iki kanalda da görselleştirilebilmesi için görüntülerin ölçeklemesi gerçek zamanlı olarak ayarlanması gerekebilir. Buradaki durumda olduğu gibi, herhangi bir lateral membran boyanmasını tespit etmek için cam düzleme odaklanarak turf aydınlatmasını doğrulayın. Lateral membranlar odağa girmiyorsa, turf hizalaması uygundur.

Bu canlı önizlemede, lateral membran boyaması hem lamın düzleminde hem de mikroskobu iyi bir turf hizalamasına getirmek için lam odak dışına çıkarıldığında belirgindir. Lazerin objektife göre açısı artırılır ve lateral membran odak dışı kalır. 10 saniyelik aralıklarla tekil görüntüler ve time-lapse dizileri yakalamaya başlayın.

Hücreler beş dakika boyunca, kare mikrometre başına altı molekül peptid yüklü hist-etiketli IEFK, kare mikrometre başına 100 molekül Alexa 647 konjuge hist-etiketli ICAM-1 ve kare mikrometre başına 100 molekül GPI demirli CD80 içeren cam destekli INTA çift tabakaları üzerinde inkübe edildi. Alexa 546 konjuge H57 FAB fragmentının sürekli varlığında çift kanallı eş zamanlı görüntüleme TIRF mikroskopisi gerçekleştirildi.

TCR'yi boyamak için hücreler, çift tabaka ile ilk temastan sonra bir saate kadar görüntülenmiştir. Hücre başına ZAP 70 küme sayıları, otomatik bir küme sayım yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. Her durumda en az 40 hücre analiz edilmiştir.

Yüklenen peptitler iç kutucukta belirtilmiştir. ICAM 1, kare mikrometre başına 100 adet Alexa 647 konjuge His etiketli ICAM 1 içeren çift katmanlar üzerindeki hücreleri ifade eder. Şekilde gösterildiği gibi, kare başına 10 saniye ile çekilen bu videoda görülebileceği üzere, zap 70 bağımlı sinyalleşme TCR mikro kümelerinde ve yalnızca agonist ligandlara yanıt olarak meydana gelir.

Agonist peptitlere yanıt olarak gelişen TCR sinyali, temas alanının çevresinde ZAP 70'i bünyesine katan TCR mikro kümelerinin sürekli oluşumuyla sürdürülür. Bu videoyu izledikten sonra, maksima nükleer afeksiyon teknolojisi kullanarak primer T-hücrelerinin nasıl transfekte edileceği ve turf mikroskopisi kullanılarak GFPT sinyal moleküllerinin TCR mikro kümelerine katılımının nasıl uygun şekilde görüntüleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Uzmanlaşıldığında, bu teknik düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde yedi saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken, primer hücrelerinize karşı çok nazik olmanız gerektiğini unutmamak önemlidir. Deneyin her adımında hücreler ne kadar sağlıklı olursa, transfeksiyon verimliliğiniz o kadar yüksek olur ve görüntülemede o kadar fazla hücre yakalarsınız. T hücreleri oldukça hareketlidir ve bunun sonucunda, TCR ve GFP kanallarının ardışık görüntülenmesi, TCR mikro kümelerinin ve hücrelerin hareketi nedeniyle iki görüntünün mükemmel şekilde hizalanmamasına neden olur.

Bu sorunun üstesinden gelmek için, çift kanallı eş zamanlı veri toplama yeteneğine sahip turf mikroskobu geliştirdik.