Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Bu video, çift kanallı eşzamanlı edinimi kullanarak T hücresi reseptörü sinyal olaylarını izlemek için bir prosedürü açıklar. Toplam iç yansıma floresan mikroskobu veya çim mikroskobu ilk T hücresi, lipid bağlantılı peptit içeren cam destekli bir lipid çift tabakası olan ZAP 70 etiketli GFP'yi kodlayan bir plazmit ile transfekte edilir. MHC kompleksleri, adezyon molekülleri ve ko-stimülatör moleküller hazırlanır.

ZAP 70 transfekte edilmiş T hücreleri, T hücresi reseptörleri peptit MHC kompleksleri tarafından devreye girdiğinde çift tabakaya eklenir. T hücresi reseptörü ile ilişkili CD üç zinciri, SARC ailesi kinaz LCK tarafından fosforile edilir ve kinaz zap 70 sitoplazmadan alınır. T hücresi reseptörü daha sonra floresan olarak etiketlenir ve hücrelerin kapak camından daha düşük kırılma indisine sahip bir ortama daldırıldığı ve toplam iç yansımaya maruz kalan bir açıda bir lazer ışını ile aydınlatıldığı görüntüleme gerçekleştirilir.

Bu, cam su arayüzünde, ortama katlanarak bozunan ve 100 ila 200 nanometre arasında bir penetrasyon derinliğine izin veren bir kaçış dalgası oluşturur. Bu nedenle, sadece plazma zarındaki veya ona çok yakın olan floro dörtlüsü uyarılır. Elde edilen görüntülerin analizi, sinyalleşmenin T hücresi reseptörü mikro kümelerinde gerçekleştiğini ortaya koymaktadır.

Çim mikroskobunun veya konvansiyonel konfokal mikroskopinin ana avantajı, sinyal kümelerinin veya TCR mikro kümeleri gibi sinyal komplekslerinin kolayca görselleştirilmesi için daha iyi çözünürlük elde etmenizdir. Travis Crites ve Chen. Laboratuvarımdaki her iki doktora sonrası araştırmacı, maksi nükleo sevgi teknolojisini kullanarak birincil fare T hücrelerinin nasıl transfekte edileceğini gösterecek ve daha sonra bunları toplam iç yansıma floresan mikroskobu veya antijen içeren bir cam kuş lipid safra tabakası ile uyarılan çim M kullanarak görüntüleyecektir.

Bu yöntem, T hücreleri, B hücreleri, doğal öldürücü ve ana hücreler dahil olmak üzere çeşitli bağışıklık hücrelerinde sinyallemeyi incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Yöntem geniş çapta uygulanabilir ve memeli hücrelerindeki çoğu reseptör sistemini, özellikle de sinyalizasyon kümelerde meydana geliyorsa, incelemek için kullanılabilir. Yönteme yeni başlayan bireyler, T hücrelerinin transfekte edilmesi çok zor olduğu için başlangıçta mücadele edebilir.

Ek olarak, T hücresi canlılığı ve transfeksiyon verimliliği, bilar kalitesi ve mikroskop hizalamasının işarete kadar olması için hassas bir koordinasyon gereklidir. Bu prosedürün ilk adımı, bir maxa fare T hücresi nükleo efektör kiti kullanılarak GFP tarafından etiketlenen ekspresyon plazmitleri ve kodlama sinyal molekülleri ile naif veya in vitro aktive edilmiş birincil T hücrelerini transfekte etmektir. Bu çalışmada kullanılan T hücrelerinin tümü, K'nın MHC molekülü IE'de bulunan MCC peptidini tanıyan A-N-D-T-C-R'yi eksprese etti.

Bununla birlikte, transfeksiyondan sonra T hücrelerinin canlılığını destekleyen bazı ipuçları sunulmaktadır. Hem canlılık hem de transfeksiyon verimliliği, in vitro aktive edilmiş T hücrelerinde naif hücrelerden daha yüksektir ve bu nedenle, bu protokol başlamadan önce in vitro aktive edilmiş T hücrelerini kullanır. Kit 20 mikrolitre bileşeninde sağlanan 1.9 mililitre ortamı, 20 mikrolitre B bileşeni ve 100 mikrolitre fetal sığır serumunu iki mililitrelik bir tüpte birleştirerek her transfeksiyon için iki mililitre takviye edilmiş T hücresi ortamı hazırlayın.

12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna iki mililitre ortam aktarın. Plakayı, ortamın hücre ölümünü dengelemek için en az bir saat boyunca 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin, bu da transfekte edilmiş hücrelerin soğuk veya 7.2 pH değerinde olmayan bir ortamda Resus süspansiyonundan kaynaklanacaktır. Transfeksiyon karışımını hazırlamak için, 82 mikrolitre fare T hücresi nükleo efektör solüsyonunu, mikrolitre başına 0.5 mikrogramdan daha düşük olmayan bir konsantrasyonda 18 mikrolitre ek iki ve beş mikrogram endotoksin içermeyen plazmit DNA ile birleştirin.

Beş ila 10 milyon hücreyi 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın, dönüşü takiben oda sıcaklığında beş dakika boyunca 75 kez G'de santrifüjleyin. Transfeksiyon karışımındaki hücre peletini yeniden süspanse etmek için mümkün olduğunca çok süpernatanı çıkarmak için bir vakum aspiratörü kullanın, hücre peletini büyük hücre kümeleri kalmayana kadar üç ila dört kez nazikçe ve yavaşça aspire edin. Bir pipet kullanarak, süspansiyonu dikkatlice sertifikalı bir amaxa vete'ye aktarın ve kabarcık olmadığından emin olun.

Nükleo efektör cihazında qve select nükleer efektör programı X 0 0 1'i kapatın. Vete'yi Q vete tutucusuna yerleştirin ve seçilen programı uygulamak için düğmeye basın. Ardından vete ve önceden dengelenmiş kültür ortamını hemen davlumbaza aktarın.

Sağlanan plastik pipeti kullanarak, vete'ye yaklaşık 500 mikrolitre önceden dengelenmiş ortam ekleyin. Ardından hücre süspansiyonunu plakadaki ortama ekleyin. Damla damla.

Hücreleri dört saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin, böylece GFP etiketli proteinlerin düşük seviyeli ekspresyonuna izin verin ve aşırı ekspresyondan kaynaklanan artefaktların görünümünü en aza indirin. Bu bölümde, mikroskobun tüm bileşenlerini çalıştırmaya başlamadan önce mikroskobu iki kanallı eşzamanlı görüntüleme için hizalamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bilgisayarı ve yazılımı başlatın.

Ardından, tüm donanım bileşenlerinin yazılım tarafından tanındığından emin olun. Yazılım herhangi bir hata mesajı olmadan başladığından, tüm bileşenler algılandı. Bir mikrolitre alt çözünürlüğü seyreltin.

Flores parlak çoklu floresan mikro kürecikler, bir kolokalizasyon standardı olarak kullanılmak üzere iki mililitre PBS'ye dönüştürülür. Ardından, bir laboratuvar teknolojisi sekiz iyi odacıklı kapak camı sisteminin her bir kuyusuna 0.25 mililitre mikroküre süspansiyonu ekleyin. Hazne kızak sistemini objektifin üzerindeki platforma yerleştirin.

Ardından, canlı önizlemeye odaklanmak için boncukları cama emdirin. Sol bölme, GFP ile kesilmiş hücrelerin görünür olacağı kanaldır. Sağ bölme, canlı hücre görüntüleme deneyleri sırasında etiketli TCR'yi gösterecektir.

XY, Z fiber fırlatmanın Y hizalamasını kullanarak, lazer ışınının konumunu, ışın objektiften çıkacak ve tavana yansıtılacak şekilde ayarlayın. Bunu, hedef cam düzlemin odakta olduğu konumdayken yapmak önemlidir. Tavandaki kiriş dağılırsa, kiriş harmanlanmaz.

Deneyde kullanılacak lazer çizgilerinin her biri için tam harmanlama testi harmanlaması elde etmek için Z mikrometresini ayarlayın. Ardından bir lazer güç ölçer kullanarak lazer gücünü her kanal için 20 ila 30 mikro watt'a ayarlayın. T hücreleri lazer radyasyonuna karşı son derece hassastır ve aydınlatma toplam 50 mikro watt ile sınırlıdır.

Çim açısını ayarlamak için yanında. Işını tavandan açısına kadar uzaklaştırmak için fiber fırlatmadaki Y hizalama mikrometresini çevirin. Hedeflerle ilgili olarak, optik eksen 90 dereceye yaklaşır.

Toplam iç yansıma için kritik açıya ulaşıldığında, lazer ışığı artık objektiften çıkmayacaktır Çim hizalamasının sağlanıp sağlanmadığını değerlendirmek için, kapak camının düzlemi boyunca yukarı ve aşağı odaklanın. Burada, yüzeye emilen boncuklar odak dışına çıkarıldıkça, çözelti içinde yüzen birçok boncuk görülebileceğine dikkat edin. İyi bir çim hizalaması elde etmek için, kirişin hedefe göre açısını artırmak gerekir.

Işının açısı arttıkça, yüzeye yakın yüzen boncuklar kaybolmaya başlar ve arayüzde emilen boncukların yoğunluğu artar. Şimdi, arayüze eklenen boncuklar odak dışına çıkarıldığında, çözelti içinde yüzen hiçbir boncuk görünür kalmaz. Bu noktada, çim düzgün bir şekilde hizalanır, çünkü yalnızca kapak kızağına emilen boncuklar içeri girebilir. Odak.

Ardından, kırmızı ve yeşil floresan kanallarını birbirine göre hizalamak için boncuklara odaklanın ve her iki kanalda üretilen görüntülerdeki tanımlanabilir özelliklerin konumunu karşılaştırın. Bir kamera standındaki X ve Y mikrometre vidalarını kullanarak, boncukların göreceli konumunu mümkün olduğunca yakına getirin. Burada. İki kanal arasında uzamsal hizalamayı sağlamak için her iki görüntünün sol alt çeyreğindeki parlak boncuğa dikkat edin.

Bu özellik her iki görüntüde de aynı göreceli konuma getirilir. Görüntüyü her iki kanaldan da yakalayın ve kaydedin. Bu görüntüler, iki kanalı hizalamak için bir yerelleştirme standardı olarak kullanılacaktır.

Bu hizalamanın bir örneği, hizalamadan önce burada görülmektedir. Kanallardan biri, alt çözünürlüklü boncukların iki kanalından gelen görüntülerin üst üste bindirildiği bu görüntüde gösterildiği gibi diğerine göre döndürülür. Ayarlamaların ardından görüntüler burada gösterildiği gibi hizalanır.

Hizalamanın kalitesi, GFP Transfekte edilmiş canlı hücrelerin görüntüleri karşılaştırılarak daha fazla incelenebilir. İki kanaldan gelen Laila podyumunun nasıl mükemmel bir şekilde hizalandığına dikkat edin. Floresan mikro boncuklar kullanılarak oluşturulan kalibrasyonu kullanarak iki görüntüyü hizaladıktan sonra.

Mikroskop kurulduktan sonra, antijen sunan cam destekli lipid çift tabakaları içeren akış odaları hazırlanır ve ilk olarak substrat ile etkileşime giren TRANSFEKTE T hücrelerini görselleştirmek için çim M gerçekleştirilir. Ana ve Dustin tarafından tarif edilen protokolü takiben, NI, NTA lipidleri, yapışma molekülü ICAM bir ve peptit MHC kompleksleri içeren bir cam örtü kızağı üzerinde oluşturulan düzlemsel lipid çift tabakaları ile bir akış odası monte edilir. MCC yüklü IEFK, histidin etiketleri aracılığıyla çift katmana dahil edilir.

Ko-uyarıcı molekül CD 80 dahil edilmiştir. Bir GPI ankrajı kullanarak, akış hücresini mikroskobun sahnesine yerleştirin ve odayı hareketsiz hale getirmek için bir gergi çubuğu kullanarak mikroskop tablasındaki bir adaptör plakasına bağlayarak stabilize edin. Ardından, sıcaklığını kontrol etmek için üretici tarafından sağlanan ısıtma elemanını akış hücresine takın.

Objektifi bir çift katman üzerine yerleştirin ve objektifin ısınmasını sağlamak için çift katmanlı düzlemi odak haline getirin ve akış hücresi, odanın sıcaklığını 37 santigrat dereceye getirmek için akış hücresi ve objektif ısıtıcıları üzerindeki anahtarı açın. Dört saatlik inkübasyondan sonra, kesilen T hücrelerini 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 80 kat G hızında santrifüjleyin. Hücreleri 300 mikrolitre H-B-S-B-S-A tamponunda yeniden süspanse edin. Ardından, TCR'yi fab için mililitre başına 10 mikrogram veya tek zincirli değişken parça için mililitre başına 20 mikrogram nihai konsantrasyona etiketlemek için H 57 FAB veya H 57 tek zincirli değişken parça ekleyin.

Hücreleri beş mililitrelik bir faks tüpüne aktarın. Daha sonra, bir mililitrelik kayma uçlu bir şırınga kullanarak, hücreleri üç bir valf aracılığıyla akış odasına enjekte edin. Görüntüleme koşullarını, çift kanallı canlı alımın TCR ve GFP kanallarının canlı bir önizlemesini göstermesi ve transfekte edilmiş hücrelerin bulunduğu bir alanı bulması için ayarlayın.

TCR ve GFP arasındaki yoğunluk farkları nedeniyle, hücrelerin her iki kanalda da görselleştirilebilmesi için görüntülerin ölçeklenmesinin gerçek zamanlı olarak ayarlanması gerekebilir. Burada olduğu gibi, herhangi bir yanal membran lekelenmesini tespit etmek için cam düzlemi yukarı odaklayarak çim aydınlatmasını onaylayın. Yanal membranlar odak haline gelmezse, çim hizalaması iyidir.

Bu canlı önizlemede, yanal membran lekelenmesi hem örtü kaymasının düzleminde hem de mikroskobu iyi çim hizalamasına getirmek için örtü kaymasının odak dışına çıkarılmasıyla belirgindir. Lazerin objektife göre açısı arttırılır ve lateral membran odak dışına çıkar. 10 saniyelik aralıklarla tek tek görüntüleri ve zaman atlamalı sekansları yakalamaya başlayın.

Beş dakika boyunca, hücreler cam destekli ve kare başına altı molekül içeren INTA çift katmanları üzerinde inkübe edildi. Peptit yüklü mikrometre IEFK etiketli hist, Alexa 6 4 7'nin mikrometre karesi başına 100 molekül, ICAM etiketli bir ve kare başına 100 molekül. GPI ankrajlı CD 80 çift kanallı mikrometre Eşzamanlı edinim çim mikroskobu, Alexa 5 46 konjuge H beş yedi FAB parçasının sürekli varlığında gerçekleştirildi.

Lekelemek için, TCR hücreleri, çift tabaka ile ilk temastan bir saat sonrasına kadar görüntülendi. Hücre başına düşen ZAP 70 küme sayısı, otomatik bir küme sayma yazılımı kullanılarak analiz edildi. Her durumda en az 40 hücre analiz edildi.

Yüklenen peptitler iç kısımda belirtilmiştir. ICAM bir, Alexa 6 4 7 konjuge mikrometre kare başına 100 molekül içeren çift katmanlar üzerindeki hücreleri ifade eder. Şekil zap 70'te gösterildiği gibi etiketli ICAM sinyali, TCR mikro kümelerinde ve yalnızca bu filmde görülebileceği gibi, kare başına 10 saniyede çekilen agonist ligandlara yanıt olarak gerçekleşir.

Agonist peptitlere yanıt olarak TCR sinyali, ZAP 70'i işe alan temas alanının çevresinde sürekli TCR mikro kümelerinin üretilmesiyle sürdürülür. Bu videoyu izledikten sonra, bir maxa nükleer sevgi teknolojisi kullanarak birincil T hücrelerinin nasıl transfekte edileceğini iyi bir şekilde anlamalı ve çim mikroskobu kullanarak GFPT sinyal moleküllerinin TCR mikro kümelerine alımını düzgün bir şekilde görüntülemelisiniz. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa yedi saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, birincil hücrelerinize karşı çok nazik olmayı unutmamak önemlidir. Deneyin her adımında hücreler ne kadar sağlıklı olursa, transfeksiyon verimliliğiniz o kadar yüksek olur ve görüntülemenizde o kadar çok hücre yakalarsınız. T hücreleri oldukça mt'dir ve sonuç olarak, TCR ve GFP kanalının ardışık görüntülemesi, TCR mikro kümelerinin ve hücrelerinin hareketi nedeniyle iki görüntünün mükemmel bir şekilde hizalanmamasına neden olur.

Bu sorunun üstesinden gelmek için, çift kanallı eşzamanlı edinimli çim mikroskobunu geliştirdik.