Nanodisc Lipid Parçacıklar içine bir ABC Transporter Sulandırma için bir adım-adım yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, bir A, b, C taşıyıcısını dahil etmektir. Bu durumda, maltoz taşıyıcı malf GK iki çözünür membran nano disk parçacıklarına dönüşür. Bu, önce membran iskele proteini MSP'nin taşıyıcı ve deterjan mycell'lerinde doğru miktarda lipit ile karıştırılmasıyla gerçekleştirilir.

İkinci adım, polistiren boncuklar eklemek ve karışımı gece boyunca hafifçe sallamaktır, deterjan kademeli olarak boncuklar üzerine emilir ve nano disk parçacıklarının oluşumuna izin verir. Daha sonra, boncuklar sedimantasyon ile uzaklaştırılır. Son adım, uygun şekilde oluşturulmuş diskleri jel filtrasyon kromatografisi ile agregalardan ve birleştirilmemiş iskele proteinlerinden ayırmaktır.

Son olarak, disklerin kalitesi doğal jel elektroforezi veya ışık saçılma spektroskopisi ile değerlendirilir. Bu tekniğin lipozomlar gibi diğer yöntemlere göre ana avantajı, zar proteinlerinin ve disklerinin sulu çözelti içinde mükemmel şekilde çözünür olmasıdır. Ek olarak, protein alanlarına artık her iki taraftan da erişilebilir.

Artık zar bölmesi olmadığı için farklı uzunluklarda zar iskelesi proteinleri kullanarak, zar proteinlerinin farklı bağ durumlarını yakalayabildim ve inceleyebildim. En önemlisi, bu yöntem, a, b, C taşıyıcılarının yeni bağlanma ortaklarının tanımlanması gibi membran proteomik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Aslında, bu tekniğin etkileri tedaviye doğru daha da uzanır, çünkü membran proteinlerinin ve reseptörlerinin aktivatörlerinin veya inhibitörlerinin keşfine yardımcı olabilir.

Bu yöntem basit gibi görünse de, doğru protein lipit oranını seçerken dikkatli olunmalıdır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, doğru kalıp oranını hesaplamada veya hazırlığın kalitesini sağlayan doğru kontrolü yapmada zorlanırlar. Bu nedenle, bu yöntemin görsel bir gösterimi, yeni bir öğrencinin çeşitli adımları ve olası zorlukları öğrenmesi için çok yararlıdır.

Başlamak için, 600 nanometrede ölçülen optik yoğunluk 37 santigrat derecede üç saat boyunca yaklaşık 0.5 olduğunda, plazmid P MSSP 1D'den üç e coli suşu BL 21 DE'de MSP etiketli MSP, hücreleri dört santigrat derecede üç saat boyunca yaklaşık 0.5 olduğunda protein üretimini indükledi, hücreleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 5.000 G'de santrifüjleme ile hasat edin. Peletleri 100 mikromolar PMSF içeren TSG 10 tamponunda yeniden askıya alın, hücreleri 8.000 PS'de üç kez Fransız presi ile bitleyin. Çözünmeyen materyali dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 5.000 G'de santrifüjleyerek çıkarıyorum. Daha sonra, MSP'yi içeren çözünür fraksiyonu 45 dakika boyunca 125.000 Gs'de ultrasantrifüjleme ile izole edin.

TSG 10 tamponunda yaklaşık 1,5 mililitre nikel seros yüksek performans kullanarak nikel şelatlama kromatografisi ile MSP'yi saflaştırın. Kirleticileri 50 milimolar İLE elüte içeren T SG 10 tamponu ile yıkayın. Diyaliz sonrası 600 milimolar I midaz içeren TSG 10 tamponlu MSP.

TSG 10 tampon MSP'deki saflaştırılmış protein, eksi 70 santigrat derecede ve mililitre başına yaklaşık 10 ila 15 miligram protein konsantrasyonunda saklanabilir. MAL K'nın C terminalinde etiketlenen MALF GK iki kompleksi, plazmitten eksprese edilir. E coli suşu BL 21 DE'de yetiştirilen PED 22 FG K, hücre lizisi ve santrifüjlemeyi takiben 37 santigrat derecede üç saat boyunca% 0.2 L Arap ile% 0.5 olan yaklaşık 0.5 olduğunda protein üretimini indükler.

Daha önce olduğu gibi, TSG 20 tamponundaki membran peletini mililitre başına beş miligramlık bir nihai konsantrasyona kadar askıya alıyoruz. Daha sonra, malzemeyi hafifçe çalkalayarak dört santigrat derecede üç saat boyunca hacim başına% 1 ağırlık GDM ile çözündürün. MAL FTK iki'nin saflaştırılması için olduğu gibi çözünmeyen materyali ultrasantrifüjleme ile çıkarın.

Daha sonra çözündürülmüş mal FTK iki kompleksini içeren süpernatanı toplayın ve nikel şelatlama kromatografisi ile tekrar saflaştırın. Kompleksi, dakikada 0,5 mililitre akış hızında bir SUEx 200, HR on üç yüz sütun üzerinde TSGD tamponunda jel filtrasyon kromatografisi ile daha da saflaştırın. Fosfolipidleri hazırlamak için, kloroform içinde çözünen bir e coli toplam lipid ekstraktı, vidalı kapaklı mikrofiş tüplerde 1000 anormal alikota ayrılır, çözücüyü hafif bir nitrojen akışı altında buharlaştırır ve gece boyunca bir vakumda daha fazla sürülür.

Daha sonra kurutun, lipit filmi TS tamponunda beş NMO son konsantrasyonda çözün ve kuvvetlice girdap yapın, ardından yaklaşık beş saniye boyunca beş kez sonikat atın. Çözünmüş lipitler, sulu TS tamponundaki genel çözünemezlikleri nedeniyle biraz opak görünecektir, ancak süspansiyon halinde kalmalıdırlar. % 0.5'lik bir nihai konsantrasyona DDM ekleyinBu noktada, çözelti berrak hale gelecektir, lipit karışımını bir su banyosuna yerleştirin ve yaklaşık beş saniye boyunca beş kez sonikat atın.

Lipid karışımı en fazla bir hafta boyunca dört santigrat derecede saklanabilir. Biyo boncukları hazırlamak için, yaklaşık 10 ila 15 mililitre biyo boncukları 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. İlk önce boncukları 50 mililitre% 100 metanol ile yıkayın.

Boncukların yerçekimi ile çökelmesine izin verin ve ardından çözeltiyi yavaşça dökün. İşlemi metanol için bir kez ve ardından %95 Etanol mili Q su ve son olarak TS tamponu için iki kez tekrarlayın. MSP'yi TSGD tamponunda mililitre veya 0.3 milimolar başına yaklaşık yedi miligramlık nihai konsantrasyona seyrelterek nano ayrık yapıya başlayın.

Başarılı bir deney sağlamak için, birlikte karıştırılacak lipit ve proteinlerin doğru oranlarını seçmek önemlidir. 300 mikrolitrelik bir nihai hacim için TSGD tamponunda bir proteinden MS P'ye bir ila üç ila 60 lipid oranında yaklaşık iki M saflaştırılmış malf GK iki kompleksini karıştırın, burada bir ila üç ila 400 oranında bir fazla lipit numunesi de 50 mikrolitre biyo boncuk süspansiyonunda negatif kontrol olarak hazırlanır tüpe ve karışımı gece boyunca bir Ertesi gün dört santigrat derecede sallanan masa, boncukları yerçekimi ile çökeltin. Boncuklar yerleştikten sonra, mümkün olduğunca çok biyo boncuktan kaçınmak için dar bir uçtan çözeltiye boru sıkın.

20 dakika boyunca 100.000 GS'de ultrasantrifüjleme ile büyük çökeltileri çıkarın. Diskleri daha önce TSG 10 tamponunda yapıldığı gibi jel filtrasyon kromatografisi ile saflaştırmaya devam edin. Ardından, preparatın stabilitesini test etmek için aynı jel filtrasyon kolonuna bir Eloqua enjekte edin.

Ardından diskleri içeren fraksiyonları birleştirin. Preparatın kalitesi, doğal jel elektroforezi ile değerlendirilir. Sulandırmanın kalitesini değerlendirmek için bir mikromolar nano diski analiz edin.

Ayrıca mal E'nin nano disklerde yeniden oluşturulan mal ftk iki kompleksine bağlanmasını da değerlendirin. Elektroforezden sonra jeli 10 dakika kumasi mavisi ile boyayın ve yaklaşık bir saat bekletin. Dinamik ışık saçılımı veya DLS gerçekleştirmek için önce nano diskleri daha önce olduğu gibi jel filtrasyon kromatografisi ile dakikada 0,1 mililitre akış hızında bir SUEx 200 HR on üç yüz sütunu kullanarak saflaştırın.

Nano diskler içeren havuz fraksiyonları ve bir AmCon santrifüj filtre ile mililitre başına yaklaşık 10 miligrama konsantre olun. Ardından numuneyi iki kez filtreleyin. Bir mikrolitre iç hacim kuvars vete fit verilerinde bir dynapro nano star cihazı kullanarak DLS ile analiz gerçekleştirin.

Parçacıkların çapını ve moleküler ağırlığını tahmin etmek için dinamik yazılımı kullanarak, bir chole metrik tahlili kullanarak mal FTK iki sulandırılmış nano diskin A TPA aktivitesini belirleyin. İlk olarak, bir mikromolar saflaştırılmış disk ve bir milimolar a TP'yi artan miktarlarda mal e ile karıştırın. Numuneleri 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin.

Daha sonra 660 nanometrede inorganik fosfat salınımını ölçün. Salınan fosfat miktarını, fosfor standart çözeltisi ile oluşturulan standart bir eğri ile karşılaştırın. Nano diskler jel filtrasyon kromatografisi ile saflaştırılır.

Kromatogram, sulandırılmış disklerin çoğunluğunun tek bir tepe noktası olarak elüte olduğunu, buna karşın fazla lipidli disklerin boşluk hacminde elüte olduğunu ve bir dizi geniş tepe noktası olarak, disk hazırlığının kalitesinin, sınırlı miktarda lipit ile yeniden oluşturulan doğal jel elektroforez diskleri tarafından daha fazla analiz edildiğini gösterir. Fazla lipit varlığında sulandırılanlar ise smear olarak göç eder. DLS ile yapılan analiz, disk popülasyonunun ortalama 5.0 nanometre yarıçapı ile homojen olduğunu göstermektedir. DLS yaklaşımına dayanarak, sulandırılmış disklerin görünür moleküler ağırlığı 215 kilodaltondur Fazla lipid varlığında yeniden oluşturulan numuneler, homojen olmayan numuneler için tipik olan 100 nanometre civarında geniş dağılımlı yarıçaplar gösterir.

MAL FTK iki kompleksinin aktivitesi, bir TP hidrolizinin hızı ve maltoz bağlayıcı protein, MAL E, maltoz bağlayıcı protein gibi etkileşimli ortaklar için afinite ölçülerek değerlendirilir. MAL E, denatüre olmayan jel elektroforezi kullanarak MAL FTK iki taşıyıcıya yüksek bir afinite ile bağlanır. MAL E ve MAL ftk iki arasında bir kompleksi tespit etmek mümkündür, MAL KA TPA aktivitesinin MAL E tarafından uyarılması burada MAL e konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak gösterilmiştir.

Nano diskin yapımı nispeten basittir, ancak optimal koşullardan küçük sapmalar, bir kez ustalaştıktan sonra geri dönüşü olmayan protein toplanmasına yol açabilir, bu teknik iki günden daha kısa sürede yapılabilir. Bu prosedürü denerken, doğru bir protein lipid oranı seçmenin önemini hatırlamak önemlidir, çünkü fazla miktarda lipit, büyük poli dispers lipozom benzeri parçacıkların üretimine yol açacaktır. Işık saçılma spektroskopisi, analitik ultrasantrifüjleme veya daha basit bir şekilde doğal jel elektroforezi gibi jel filtrasyonu dışındaki teknikler kullanılarak sulandırılan malzemenin kalitesini dikkatli bir şekilde analiz etmek çok önemlidir.

Unutmayın, diski içeren fosfolipid tipinin yanı sıra membran iskele proteini, sulandırmanın verimliliğine katkıda bulunabilir. Bu videoyu izledikten sonra, tercih ettiğiniz zar proteinini içeren çözünür ve homojen nano disklerin nasıl oluşturulacağını iyi bir şekilde anladığınızı umuyoruz. Deneylerinizde iyi şanslar.