Name: Nanodisc Lipid Parçacıklar içine bir ABC Transporter Sulandırma için bir adım-adım yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Öğrenin MalFGK2 ABC taşıyıcısını nanodisc lipid parçacıklarına yerleştirme yöntemini. Bu teknik, membran proteinlerinin çözünür ortamda fonksiyonel çalışmaları için stabil kompleksler oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Sağlık Araştırma Kanada Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. CSC Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Konseyi doktora sonrası burs tarafından finanse edildi. FD bir Tier II Kanada Araştırma Başkanı olduğunu.

<html> Genel Sulandırma Süreci Sulandırma işlemi deterjan çözülmüş fosfolipidlerin mevcudiyetinde saflaştırılmış MalFGK 2 kompleks ile membran protein iskele (MSP) ve karıştırma başlatılır. Adım Bio-boncuk veya Amberlite (Şekil 1) olarak adlandırılan bir emici malzeme ile polistiren deterjan yavaş kaldırılması tarafından takip edilir. Otomatik montaj işlemi çünkü hidrofobik fosfolipidler, MalFGK 2 karmaşık ve MSP amfipatik proteinin yüzeyi ile apolar etkileşim büyük olasılıkla oluşur. Nihai ürün MalFGK 2 kompleks MSP sarma iki molekül yapılmış bir disk biçiminde bir parçacıktır. Partiküller ultra-santrifüj ile analitik boyut-dışlama kromatografisi ile adducts ve agregadan ayrılır. Partiküller doğal-jel elektroforezi ve dinamik ışık saçılması spektroskopisi ile karakterize edilmiştir. Membran başlığı &quot;&gt; 1. Hazırlama İskele Protein, MSP <ol><li> His-etiketli MSP (versiyon MSP1D1 1) E. plazmid pMSP1D1 üretilir coli, 37, 3 saat boyunca 0.5 mM izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside ile OD 600 ~ 0.5 indüklenen BL21 (DE3) ° C. </li><li> Hücreler 10 dakika 4 ° C&#39;de 5.000 x g santrifüj ile toplanır ve 100 uM fenilmetansülfonil flor içeren TSG10 tampon içinde tekrar süspanse edilir. </li><li> Hücreler 8,000 psi ile bir Fransız pres (3x) ile lize edilir ve erimez madde 4 ° C sıcaklıkta 10 dakika için 5000 x g&#39;de santrifüj ile çıkarılır MSP içeren çözünür kesir 45 dakika süreyle 125,000 xg ultra santrifüj yoluyla izole edilir. </li><li> MSP nikel-şelat kromatografi TSG10 tampon içinde ~ 1.5 ml Ni Sepharose HP kullanılarak saflaştırılır. Kirletici maddelerin, 50 mM imidazol içeren tampon TSG10 ile yıkandıktan. MSP 600 mM TSG10 tampon ile elüt edilmiştirimidazol. Saflaştırılmış protein TSG10 tampon içinde diyaliz edildi ve ~ 10-15 mg / ml &#39;lik bir protein konsantrasyonu -70 ° C de saklanır. </li></ol> 2. MalFGK 2 Kompleksi hazırlanması <ol><li> MalFGK 2 kompleksinin Malk, C-terminalinde His-etiketli E. plazmid pBAD22-FGK eksprese edilir coli BL21 (DE3) ve 37 de, 3 saat boyunca% 0.2 L-arabinoz ile OD 600 ~ 0.5 indüklenen ° C. </li><li> Adım 1.3 &#39;de olduğu gibi hücrelerinin lisisi ve santrifüj sonrasında, zar pelet 5 mg / ml&#39; lik bir nihai konsantrasyonda TSG20 tampon içinde tekrar süspanse edilir. Malzeme hafif sallama ile 4, 3 saat boyunca% 1 w / v n-dodesil-β-maltopyranoside (DDİ) ° C ile çözündürülmüş edilir. </li><li> Çözünmeyen malzeme adım 1.3 &#39;de olduğu gibi ultra-santrifüj ile çıkarıldı ve yüzey maddesi içeren bir çözünür MalFGK 2 kompleksinin toplanan ve adım 1,4 olarak saflaştırılmış, ama diyalize olmadan edilir. </li><li> Further arıtma 0.5 ml / dak &#39;lık bir akış hızında, bir Superdex 200 HR 10/300 kolon üzerinde TSGD tampon içinde, jel filtrasyon kromatografisi ile elde edilir. </li></ol> 3. Fosfolipidler hazırlanması <ol><li> Bir E. coli, toplam lipid kloroform içinde çözüldü özü vidalı kapaklı mikrofüj tüpler içinde 1.000 nmol alikotları ayrılır. Çözücü, bir azot akımı altında buharlaştırıldı yumuşak ve bir vakumlu desikatör içinde daha ileri gece boyunca kurutulur. </li><li> Lipid filmi 5 nM son konsantrasyonda TS tampon içinde çözülmüş ve kuvvetlice vortekslenmiş ve sonike edilmiştir. Çözünmüş lipidler nedeniyle sulu TS tampon genel çözülmezlik hafifçe opak görünecektir, ancak askı kalmalıdır. DDİ çözelti berrak hale geldiği% 0.5 (~ 10 mm), ve bir nihai konsantrasyon ilave edilir. </li><li> Lipit karışımı bir su banyosuna yerleştirilir ve nabız ~ 5 sn için 5 kez sonike edilir. Lipid karışımı 1 çiş bir süre için 4 ° C sıcaklıkta saklanırk. </li></ol> 4. Bio-Boncuk hazırlanması <ol><li> Yaklaşık 10-15 ml (kuru cilt) Bio-Boncuk 50 ml&#39;lik bir tüp yerleştirilir. </li><li> Boncuklar art arda% 100 metanol,% 95 etanol, milliQ H2O, ve son olarak da TS tamponu (iki defa her biri), 50 ml ile yıkanır. </li><li> Yıkanmış boncuklar 4 saklanır ° C ~ 10 ml tampon içinde TS. </li></ol> 5. Nanodisc Sulandırma <ol><li> MSP ~ 7 mg / ml (~ 0.3 mM) nihai konsantrasyonu TSGD tamponu içinde seyreltilir. </li><li> MSP: TSGD tampon içinde 1:3:60 veya 1:3:400 lipid oranının saflaştırılmış MalFGK 2 kompleks ~ 2 nmol bir protein karıştırılmıştır. Nihai konsantrasyon 6 uM MalFGK 2, 18 uM, 360 uM MSP lipidler (1:3:60) ya da 2.4 mM lipidler (1:3:400) &#39;dir. Son hacim 300 ul olup. Nihai DDM konsantrasyonu% 0.08 (~ 1.6 mM) &#39;dir. Gliserol nihai konsantrasyon lipit miktarına bağlı olarak değişir, ancak ilave etrafında% 5-10 v / v kalır </li&gt; <li> ~ Bio-boncuk süspansiyonu 50 ul tüpüne ilave edilir ve karışım, 4 ° C&#39;de bir sallanan bir masa üzerinde bir gece inkübe edilir </li><li> Boncuklar yerçekimi ile sedimente edilir ve çözelti, mümkün olduğu kadar çok Biyo-Boncuk önlemek için dar bir ucu ile pipetle konulur. </li><li> Çökelek Büyük 20 dakika için 100,000 x g ultra-santrifüj ile çıkarılır. Diskler TSG10 tampon içinde adım 2.4 &#39;de olduğu gibi, jel filtrasyon kromatografisi ile saflaştırılır. Diskleri ihtiva eden fraksiyonlar bir araya getirilmiştir ve bir kısım hazırlanması kararlılık test etmek için aynı jel süzme sütunu üzerine, yeniden enjekte edilmelidir. </li><li> Saflaştırılmış disklerin uzun bir süre -70 ° C&#39;de saklanabilir. Buz üzerinde eritme sonra, diskler, potansiyel çökeltileri uzaklaştırmak için adım 5.5 gibi ultra-santrifüj tabi tutulmalıdır. Bir kısım önemli agregasyonu veya yağış çözdürme sırasında meydana vermedi sağlamak için jel filtrasyon kromatografisi ile analiz edilmelidirsüreç. </li></ol> 6. Yerli Jel Elektroforezi <ol><li> Nanodiscs 1 uM (~ 0.2 mg / ml) ile sulandırma (Şekil 3A) kalitesini ölçmek için doğal PAGE 6, 7 (Tris-HCl, pH 8.8,% 4-12) ile analiz edilir. </li><li> 2-kompleks MalFGK için erkek bağlayıcı (1 uM) nanodiscs yılında yeniden yapılandırılmış, ayrıca yerel-PAGE (Şekil 3A) tarafından değerlendirilir. </li><li> Elektroforez sonra, jel 10 dakika için Coomassie mavisi ile boyandı, ve ~ 1 saat boyunca destained. </li></ol> 7. Dinamik ışık saçılımı (DLS) <ol><li> Nanodiscs 0.1 ml / dak &#39;lık bir akış hızında, bir Superdex 200 HR 10/300 kolonu kullanılarak TSG10 tampon içinde adım 2.4&#39; de olduğu gibi, jel filtrasyon kromatografisi ile saflaştırılır. Nanodiscs ihtiva eden fraksiyonlar toplanmış ve bir Amicon santrifüj filtre ile yaklaşık 10 mg / ml &#39;ye konsantre edilmiştir. </li><li> Örnek kullanarak DLS ile analizden önce (0.22 mikron filtre) iki kez filtre edilirBir 1 ul iç hacmi kuvars küvetine bir Dynapro nanostar enstrüman (Wyatt Technology). Veriler, çap ve parçacıkların moleküler ağırlığı tahmin etmek DİNAMİK yazılım (Wyatt Technology) ile monte edilir. </li></ol> 8. ATPaz Ölçümleri <ol><li> MalFGK 2-Sulandırılan nanodiscs arasında ATPaz aktivitesi kolorimetrik 8 kullanılarak belirlenir. </li><li> Saflaştırıldı diskleri ve 1 mM ATP 1 uM, 20 dakika boyunca erkek ve 37 ° C de inkübe artan miktarları ile karıştırılır. Inorganik fosfat sürümü 660 nm&#39;de ölçülür. </li><li> Serbest fosfat miktarı, bir fosfor Standart çözelti ile oluşturulan standart bir eğri ile karşılaştırılmıştır. </li></ol> 9. Temsilcisi Sonuçlar Nanodiscs jel filtrasyon kromatografisi (Şekil 2A, sol) ile arıtılır. Kromatogramı göstermektedir ki sulandırılmış d çoğunluğuISCS (siyah iz) tek bir zirve olarak elute, oysa aşırı lipid (kırmızı iz) boşluk hacminde elute olan ve geniş zirveleri bir dizi olarak yapılmış diskler. Nanodiscs kalitesi daha fazla doğal jel elektroforezi ve dinamik ışık saçılması spektroskopisi (DLS) ile analiz edilir. Lipidlerin aşırı varlığında Sulandırılan bu bir smear (Şekil 2A, sağ) olarak göç ise Düzgün Sulandırılan diskler jel üzerinde keskin bir bant olarak göç ederler. DLS disk ile analiz nüfus 11.4 nm (Şekil 2B), bir ortalama çapa sahip homojen olduğunu göstermektedir. Sulandırılan DLS disk yaklaşım esas 215 kDa bir görünür moleküler ağırlığa sahiptir. Aşırı lipid varlığında sulandırılmış Örnekler yaygın olarak homojen olmayan örnekler için tipik olan, 100 nm yarı çapları etrafında dağıtılmış ekranı. MalFGK 2 kompleksinin kalitesi ATPaz tarafından yerli jel elektroforezi ve faaliyet değerlendirilirölçümleri (Şekil 3). Maltoz bağlayıcı protein Erkek MalFGK 2 taşıyıcı 9, 10 yüksek afinite ile bağlanır. Kullanılması olmayan denatüre edici jel elektroforezi, erkek ve MalFGK 2 (Şekil 3A) arasında bir kompleks tespit etmek mümkündür. Erkek Malk 2 ATPaz aktivitesinin uyarılması Şekil 3B &#39;de gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. Sulandırma protokolü için tipik akış şeması. <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig2.jpg" alt="Şekil 2,"/> Şekil 2. Nanodisc hazırlanması. A. Kalite Kontrol Veya yüksek yağ oranı (1/3/400; kırmızı iz); nanodiscs Jel filtrasyon analizi (Superdex 200 HR 10/300 sütun) düşük yağ oranı (siyah iz 1/3/60) de sulandırılır. Aynı diskin hazırlık Native jel elektroforezi. MolkDa yılında ecular ağırlığı işaretleri gösterilir. Aynı diskin hazırlanması B. Dinamik ışık saçılımı analiz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3910/3910fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3,. MalFGK 2-nanodisc parçacıklar analizi. C. Male jel kayma analizi MalFGK 2-nanodisc parçacıkların artan miktarlarda ile inkübe edildi. MalFGK B. ATPaz aktivitesi 2-nanodisc Erkek konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak parçacıklar.

<ol><li>Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).</li>
<li>Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+separate+chemoreceptor+oligomeric+states+and+reveal+their+signaling+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 11509-11514 (2006).</li>
<li>Bass, B. J., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homotropic+cooperativity+of+monomeric+cytochrome+P450+3A4+in+a+nanoscale+native+bilayer+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 in a nanoscale native bilayer environment.</a> J. Biol. Chem. 282, 7066-7076 (2007).</li>
<li>Alami, M., Dalal, K., Lelj-Garolla, B., Sligar, S. G., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+unravel+the+interaction+between+the+SecYEG+channel+and+its+cytosolic+partner+SecA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs unravel the interaction between the SecYEG channel and its cytosolic partner SecA.</a> EMBO J. 26, 1995-2004 (2007).</li>
<li>Mi, L. -Z., Grey, M. J., Nishida, N., Walz, T., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+stability+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+detergent+micelles+and+phospholipid+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Functional and structural stability of the epidermal growth factor receptor in detergent micelles and phospholipid nanodiscs.</a> Biochemistry. 47, 10314-10323 (2008).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217, 220-230 (1994).</li>
<li>Dalal, K., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+SecY+translocon+in+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the SecY translocon in Nanodiscs.</a> Methods Mol. Biol. 619, 145-156 (2010).</li>
<li>Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+assay+for+nanomole+amounts+of+inorganic+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate.</a> Anal. Biochem. 100, 95-97 (1979).</li>
<li>Davidson, A. L., Dassa, E., Orelle, C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+evolution+of+bacterial+ATP-binding+cassette+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structure, function and evolution of bacterial ATP-binding cassette systems.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72, 317-364 (2008).</li>
<li>Bordignon, E., Grote, M., Schneider, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maltose+ATP-binding+cassette+transporter+in+the+21st+century-towards+a+structural+dynamic+perspective+on+its+mode+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The maltose ATP-binding cassette transporter in the 21st century-towards a structural dynamic perspective on its mode of action.</a> Mol. Microbiol. 77, 1354-1366 (2010).</li>
<li>Alvarez, F. J., Orelle, C., Davidson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+reconstitution+of+an+ABC+transporter+for+use+in+electron+paramagnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Functional reconstitution of an ABC transporter for use in electron paramagnetic resonance spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 9513-9515 (2010).</li>
<li>Ritchie, T. K., Grinkova, Y. V., Bayburt, T. H., Denisov, I. G., Zolnerciks, J. K., Atkins, W. M., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 464, 211-231 (2009).</li>
<li>Glück, J. M., Koenig, B. W., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+allow+the+use+of+integral+membrane+proteins+as+analytes+in+surface+plasmon+resonance+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs allow the use of integral membrane proteins as analytes in surface plasmon resonance studies.</a> Anal. Biochem. 408, 46-52 (2011).</li>
<li>Wan, C. -P. L., Chiu, M. H., Wu, X., Lee, S. K., Prenner, E. J., Weers, P. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein-induced+conversion+of+phosphatidylcholine+bilayer+vesicles+into+nanodisks%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+%28BBA%29%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein-induced conversion of phosphatidylcholine bilayer vesicles into nanodisks.</a> Biochim. Biophys. Acta (BBA). 1808, 606-613 (2011).</li>
<li>Nath, A., Trexler, A. J., Koo, P. K., Miranker, A. D., Atkins, W. M., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+spectroscopy+using+phospholipid+bilayer+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence spectroscopy using phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 472, 89-117 (2010).</li>
<li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochromes+P450+in+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytochromes P450 in Nanodiscs.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1814, 223-229 (2011).</li>
<li>Zhang, X. X., Chan, C. S., Bao, H., Fang, Y., Foster, L. J., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+and+SILAC-based+mass+spectrometry+to+identify+a+membrane+protein+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs and SILAC-based mass spectrometry to identify a membrane protein interactome.</a> J. Proteome Res. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz nanodiscs içine maltoz taşıyıcı sulandırılması için basit bir prosedür açıklanmaktadır. Taşıyıcı ATPaz aktif ve çözünen bağlayıcı ortağı erkek ile etkileşim (Şekil 3) yeniden olabilir. Nanodiscs içine taşıyıcı başarılı rekonstitüsyon ek biyofiziksel ve biyokimyasal analiz için yolu açın. Özellikle ilgi Of Malk ATPaz ve deterjan maltoz taşımacılık faaliyeti, lipozom ve nanodiscs sistematik analiz olacaktır. ABC taşıyıcıları taşıma döngüsü sırasında konformasyonlar değiştirebilirsiniz ancak bu konform...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 50K santrifüj filtre </td><td> Millipore </td><td> UFC805008 </td><td> Uygun kullanımı için üreticinin protokol izleyin </td></tr><tr><td> Bio-Boncuk SM-2 Adsorban </td><td> Bio-Rad </td><td> 152-3920 </td><td></td></tr><tr><td> E. coli total lipid </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 100500C </td><td> Kloroform içinde çözülmüş, bir organik çözücü uygun olarak işlemek </td></tr><tr><td> Ni Sepharose HP reçine </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5268-01 </td><td></td></tr><tr><td> Fosforlu standart çözelti </td><td>Sigma-Aldrich </td><td> P3869 </td><td></td></tr><tr><td> pMSP1D1 </td><td> Addgene </td><td> 20061 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR 10/300 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5172-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo I. Belirli reaktifler. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Kompozisyon </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DDM stok </td><td> % 10 w / v DDM </td><td> -20 ° C&#39;de milliQ su ve mağaza süspanse </td></tr><tr><td> MalFGK 2 stok </td><td> 1-2 mg / ml &#39; 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl % 10 h / h gliserol % 0.03 w / v DDM </td><td> -70 ° C&#39;de saklayın sonra purification </td></tr><tr><td> MSP stok </td><td> 10-15 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl % 10 h / h gliserol </td><td> -70 ° C&#39;de saklayın &lt;1 ml alikotları arıtma sonrası ve aşırı donma / çözülme döngüleri önlemek </td></tr><tr><td> Fosfolipid stok </td><td> 5 nM E. coli lipidler toplam % 0.5 w / v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCI, pH 7.9 50 mM NaCl </td><td> 1 hafta boyunca 4 ° C&#39;de depolayın </td></tr><tr><td> TS tampon </td><td> 50 mM Tris-HCI, pH 7.9 50 mM NaCl </td><td> 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> TSG10 tampon </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl % 10 h / h gliserol </td><td> 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> TSG20 tampon </td><td> 50 mM Tris-HCl, PH8 100 mM NaCl % 20 h / h gliserol </td><td> 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> TSGD tampon </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl % 10 h / h gliserol % 0.03 w / v DDM </td><td> 4 ° C&#39;de saklayın ve sadece kullanmadan önce DDM ekleyin </td></tr><tr><td colspan="3"> Tablo II. Çözüm tarifleri. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

nanodisc lipid parçacıklar içine bir abc transporter sulandırma için bir adım-adım yöntemi

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Nanodisc bir diskoidal parçacık (~ 10-12 nm büyük) o tuzağa membran proteinlerinin fosfolipid çift tabakası küçük bir yama içine. Olduğunu Nanodisc özellikle ligand-reseptör etkileşimlerinin bağlamında, zar proteinleri çalışmak için özellikle çekici bir seçenek. Yöntem Sligar tarafından ve arkadaşları, apolipoprotein A1 türetilen bir tasarlanmış çok a-sarmal iskele protein amfipatik özelliklerine dayanmaktadır. Kutup bölgeleri sulu ortamda karşı karşıya iken iskele proteinin hidrofobik yüzleri iki tabakalı lipid ve yağ açil yan zincirleri ile etkileşim. Partikülleri, küçük homojen değildir ve suda çözünebilir olduğu için nanodiscs içinde zar proteinlerinin analizi lipozom göre önemli avantajlara sahiptir. Buna ek olarak, normal olarak çözünür proteinler için ayrılmış biyokimyasal ve biyofiziksel uygulanan yöntemler, ve zarın her iki tarafında olabilir. Bu görsel protokol, biz iyi bir karakter bir adım-adım sulandırma sunmakkarekterize bakteriyel ABC taşıyıcı, erkek-MalFGK 2 kompleksi. Diskin oluşum deterjan ilerleyen çıkarılması sırasında meydana gelen hidrofobik etkileşimler bağlı olarak bir öz montaj işlemdir. Biz gerekli adımları açıklamak ve agrega ve büyük polidispers lipozom benzeri partiküllerin oluşumunu sınırlamak için doğru protein-to-lipid oranı seçmenin önemini vurgulamak. Basit kalitesi tür diskler düzgün sulandırılmış oylandı emin jel filtrasyon kromatografisi, yerli jel elektroforezi ve dinamik ışık saçılma spektroskopisi olarak denetler.

Nanodiscs fosfolipid çift tabakası küçük bir yama içine membran proteinleri dahil küçük diskoid parçacıklardır. Biz bir disk içine MalFGK2 taşıyıcı adım adım kuruluş gösteren görsel bir protokol sağlar.

Nanodisc Lipid Parçacıklar içine bir ABC Transporter Sulandırma için bir adım-adım yöntemi

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Bu prosedürün genel amacı, bir A, b, C taşıyıcısını, bu durumda maltoz taşıyıcısı malf GK ikisini, çözünür membran nano disk partiküllerine dahil etmektir. Bu işlem, öncelikle membran iskele proteini MSP'nin, taşıyıcı ve uygun miktardaki lipidlerle deterjan miselleri içinde karıştırılmasıyla gerçekleştirilir.İkinci adım, polistiren boncukların eklenmesi ve karışımın gece boyunca nazikçe sallanmasıdır; deterjan kademeli olarak boncuklar tarafından absorbe edilir ve böylece nano disk partiküllerinin oluşumu sağlanır. Ardından, boncuklar sedimentasyon yoluyla uzaklaştırılır. Son adım ise, uygun şekilde oluşmuş disklerin agregatlardan ve birleşmemiş iskele proteinlerinden jel filtrasyon kromatografisi ile ayrılmasıdır.Son olarak, disklerin kalitesi doğal jel elektroforezi veya ışık saçılım spektroskopisi ile değerlendirilir. Bu tekniğin lipozomlar gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, membran proteinlerinin ve disklerin sulu çözeltide tamamen çözünür olmasıdır. Ayrıca, protein domenleri artık her iki taraftan da erişilebilirdir.Artık bir membran kompartımanı bulunmadığından, farklı uzunluklardaki membran iskele proteinlerini kullanarak membran proteinlerinin farklı ligand durumlarını hapsetmeyi ve incelemeyi başardım. En önemlisi, bu yöntem membran proteomik alanı içindeki, a, b, C taşıyıcılarının yeni bağlanma ortaklarının tanımlanması gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Aslında, bu tekniğin etkileri, membran proteinlerinin ve reseptörlerinin aktivatörlerinin veya inhibitörlerinin keşfine yardımcı olabileceği için terapiye kadar daha geniş bir alana yayılmaktadır.Bu yöntem basit görünse de, doğru protein-lipid oranı seçilirken dikkatli olunmalıdır. Genellikle bu yöntemde yeni olan kişiler, doğru kalıp oranını hesaplamakta veya hazırlığın kalitesini garanti altına alan doğru kontrolü gerçekleştirmekte zorlanırlar. Bu nedenle, bu yöntemin görsel bir gösterimi, yeni bir öğrencinin çeşitli adımları ve karşılaşılabilecek zorlukları öğrenmesi açısından oldukça faydalıdır.E. coli BL 21(DE3) suşunda P-MSSP1D1 plazmidi kullanılarak heksa-histidin etiketli MSP üretimine başlamak için, 600 nanometrede ölçülen optik yoğunluk yaklaşık 0,5 olduğunda protein üretimini indükleyin ve 37 °C'de üç saat boyunca sürdürün; ardından hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 5.000 ×g merkezkaç kuvveti ile hasat edin. Peleti 100 µM PMSF içeren TSG 10 tamponunda yeniden süspande edin ve hücreleri bir French press ile 8.000 PSI'da üç kez parçalayın. Çözünmeyen materyali 4 °C'de 10 dakika boyunca 5.000 ×g merkezkaç kuvveti ile uzaklaştırın. Ardından, MSP içeren çözünür fraksiyonu 45 dakika boyunca 125.000 ×g ultrasentrifüj ile izole edin.MSP'yi, TSG 10 tamponu içindeki yaklaşık 1,5 mililitre nikel seros yüksek performanslı kolon kullanarak nikel şelatlama kromatografisi ile saflaştırın. Kontaminantları, 50 milimolar imidazol içeren TSG 10 tamponu ile yıkayarak uzaklaştırın. Diyaliz işleminden sonra, MSP'yi 600 milimolar imidazol içeren TSG 10 tamponu ile elüe edin.TSG 10 tamponu içindeki saflaştırılmış MSP proteini, -70 °C'de ve yaklaşık 10 ila 15 mg/mL protein konsantrasyonunda saklanabilir. MAL K'nın C terminusinde his-etiketli olan MALF GK 2 kompleksi, plazmid PED 22 FG K'dan eksprese edilir. E coli BL 21 DE3 suşunda büyütülen hücrelerde, 600 nm'de ölçülen optik yoğunluk yaklaşık 0,5 olduğunda, %0,2 L-arabinoz ile 37 °C'de üç saat boyunca protein üretimi indüklenir; ardından hücre lizizi ve santrifüj işlemleri gerçekleştirilir.Daha önce olduğu gibi, membran peletini nihai konsantrasyonu beş mg/mL olacak şekilde TSG 20 tamponunda süspande ediyoruz. Ardından, materyali %1 ağırlık/hacim GDM ile dört °C'de, hafif çalkalama eşliğinde üç saat boyunca solubilize edin. Çözünmeyen materyali, MAL FTK iki saflaştırmasında olduğu gibi ultrasantrifüjasyon ile uzaklaştırın.Ardından, çözünür hale getirilmiş mal FTK two kompleksini içeren süpernatantı toplayın ve nikel şelatlama kromatografisi ile yeniden saflaştırın. Kompleksi, SUEx 200, HR ten üç yüz kolonunda, TSGD tamponunda, dakikada 0.5 milliliters akış hızında jel filtrasyon kromatografisi ile daha fazla saflaştırın. Fosfolipidleri hazırlamak için, kloroformda çözülmüş bir e coli toplam lipid ekstraktını vidalı kapaklı mikrofüj tüplerine 1000 anomal alikotlar halinde ayırın; solventi hafif bir azot akımı altında buharlaştırın ve vakumda gece boyunca kurutmaya devam edin.Ardından kurutun, lipid filmini beş NMO son konsantrasyonundaki TS tamponunda çözün ve kuvvetlice vorteksleyin, ardından yaklaşık beş saniye boyunca beş kez darbeli sonikasyon uygulayın. Çözünmüş lipidler, sulu TS tamponundaki genel çözünmezlikleri nedeniyle hafif opak görünecektir ancak süspansiyon halinde kalmalıdırlar. DDM'yi 0,5% son konsantrasyona ulaşacak şekilde ekleyin. Bu noktada çözelti berraklaşacaktır; lipid karışımını bir su banyosuna yerleştirin ve yaklaşık beş saniye boyunca beş kez darbeli sonikasyon uygulayın.Lipit karışımı, dört °C'de maksimum bir hafta boyunca saklanabilir. Bio bead'leri hazırlamak için, 50 mL'lik bir tüpe yaklaşık 10 ila 15 mL bio bead yerleştirin. İlk olarak, bead'leri 50 mL %100 metanol ile yıkayın.Boncukların yerçekimi ile çökmesini bekleyin ve ardından çözeltiyi nazikçe dökün. Bu işlemi metanol için bir kez, ardından 95% Ethanol, milli Q water ve son olarak TS buffer için ikişer kez tekrarlayın. MSP'yi TSGD buffer içinde yaklaşık 7 mg/mL veya 0.3 mM son konsantrasyona seyrelterek nano ayrık yapılandırmaya başlayın.Deneyin başarılı olması için, birlikte karıştırılacak lipid ve proteinlerin doğru oranlarının seçilmesi önemlidir. Yaklaşık iki M saflaştırılmış malf GK iki kompleksini, TSGD tamponu içerisinde, protein:MS P:lipid oranı 1:3:60 olacak şekilde toplam 300 µL hacme tamamlayarak karıştırın. Burada, negatif kontrol olarak 1:3:400 oranında fazla lipid içeren bir örnek de hazırlanmıştır. Tüpe 50 µL bio bead süspansiyonu ekleyin ve karışımı bir sallama tablası üzerinde, 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, boncukları yerçekimi yardımıyla çöktürün. Boncuklar çöktükten sonra, mümkün olduğunca az bio bead alacak şekilde çözeltiyi dar bir uç yardımıyla pipetleyin.Büyük çökelekleri 100,000 GS'de 20 dakika boyunca ultrasantrifüj yaparak uzaklaştırın. Diskleri, daha önce TSG 10 tamponunda gerçekleştirildiği şekilde jel filtrasyon kromatografisi ile saflaştırmaya geçin. Ardından, hazırlığın stabilitesini test etmek için aynı jel filtrasyon kolonuna bir Eloqua enjekte edin.Ardından diskleri içeren fraksiyonları birleştirin. Hazırlığın kalitesi native jel elektroforezi ile değerlendirilir. Rekonstitüsyon kalitesini değerlendirmek için bir mikromolar nano disk analiz edin.Ayrıca, nano disklerde yeniden oluşturulan mal E ile mal ftk two kompleksinin bağlanmasını değerlendirin. Elektroforezden sonra, jeli 10 dakika boyunca kumasi blue ile boyayın ve yaklaşık bir saat boyunca boyayıyı giderin. Dinamik ışık saçılımı veya DLS gerçekleştirmek için, önce nano diskleri daha önce olduğu gibi, 0,1 mililitre/dakika akış hızında bir SUEx 200 HR ten üç yüz kolonu kullanarak jel filtrasyon kromatografisi ile saflaştırın.Nano diskler içeren fraksiyonları birleştirin ve bir AmCon santrifüj filtresi ile yaklaşık 10 mg/mL konsantrasyona getirin. Ardından örneği iki kez filtreleyin. Analizi, bir mikrolitre iç hacimli kuvars vete fit veri içeren bir dynapro nano star cihazı kullanarak DLS ile gerçekleştirin.Parçacıkların çapını ve molekül ağırlığını tahmin etmek için dinamik yazılımı kullanarak, kolörimetrik bir analiz ile iki yeniden oluşturulmuş mal FTK nano disklerinin ATPase aktivitesini belirleyin. İlk olarak, bir mikromolar saflaştırılmış diskleri ve bir milimolar ATP'yi artan miktarlarda mal e ile karıştırın. Numuneleri 37 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, inorganik fosfat salınımını 660 nanometrede ölçün. Salınan fosfat miktarını, bir fosfor standart çözeltisi ile oluşturulan standart eğriyle karşılaştırın. Nano diskler, jel filtrasyon kromatografisi ile saflaştırılır.Kromatogram, yeniden oluşturulan disklerin çoğunluğunun tek bir pik olarak elüe olduğunu, buna karşın fazla lipid ile hazırlanan disklerin boşluk hacminde ve bir dizi geniş pik şeklinde elüe olduğunu göstermektedir; disk hazırlama kalitesi, yerli jel elektroforezi ile daha ayrıntılı şekilde analiz edilmiştir. Sınırlı miktarda lipid ile yeniden oluşturulan diskler yerli jelde keskin bir bant olarak göç ederken, fazla lipid varlığında yeniden oluşturulanlar yayılmalar (smear) şeklinde göç etmektedir. DLS analizi, disk popülasyonunun 5.0 nanometre ortalama yarıçap ile homojen olduğunu göstermektedir. DLS yaklaşımına dayanarak, yeniden oluşturulan disklerin 215 kilodalton görünür moleküler ağırlığa sahip olduğu saptanmıştır; fazla lipid varlığında yeniden oluşturulan örnekler, homojen olmayan örnekler için tipik olan 100 nanometre civarında geniş dağılımlı yarıçaplar sergilemektedir.MAL FTK iki kompleksinin aktivitesi, TP hidroliz hızı ve maltoz bağlayıcı protein MAL E gibi etkileşim ortaklarına olan afinitesinin ölçülmesiyle değerlendirilir. MAL E, denatüre etmeyen jel elektroforezi kullanılarak MAL FTK iki taşıyıcısına yüksek afinite ile bağlanır. MAL E ile MAL ftk iki arasında bir kompleks tespit etmek mümkündür; MAL KA TPA aktivitesinin MAL E tarafından stimülasyonu, burada MAL e konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak gösterilmiştir.Nano disklerin hazırlanması nispeten basittir, ancak optimal koşullardan meydana gelen küçük sapmalar geri dönüşümsüz protein agregasyonuna yol açabilir; bu teknik bir kez kavrandığında, iki günden daha kısa sürede tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, doğru protein-lipid oranını seçmenin önemi unutulmamalıdır; çünkü aşırı miktarda lipid, büyük ve polidisperze lipozom benzeri partiküllerin üretilmesine neden olacaktır. Rekonstitüe edilen materyalin kalitesini, jel filtrasyonu dışındaki tekniklerle (ışık saçılım spektroskopisi, analitik ultrasantrifüjasyon veya daha basitçe doğal jel elektroforezi gibi) dikkatle analiz etmek kritik öneme sahiptir.Unutmayın, diski oluşturan fosfolipid türü ve membran iskelet proteininin türü, yeniden oluşturma verimliliğine katkıda bulunabilir. Bu videoyu izledikten sonra, seçtiğiniz membran proteinini içeren çözünür ve homojen nanodisklerin nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayış kazandığınızı umuyoruz. Deneylerinizde başarılar dileriz.

a-step-step-method-for-reconstitution-an-abc-transporter-into

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Lipid membranlar bir prototip voltaj kapılı potasyum kanalı tam sulandırılması için prosedürler açıklanmıştır. Sulandırılmış kanallar biyokimyasal testler, elektrik kayıtları, ligand ve tarama elektron kristalografik çalışmalar için uygundur. Bu yöntemler, başka zar proteinlerinin yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için genel uygulamalar olabilir.

Yapısal ve İşlevsel Araştırmalar için Lipid Membranlar bir Kv Kanal Sulandırma

Birçok protein, zar yüzeylerine bağlandığında işlevlerini yerine getirir. Ekstrinsik proteinlerin nanodisk membranları üzerindeki bağlanması, transmisyon elektron mikroskobu ile dolaylı olarak görüntülenebilir. Negatif leke sodyum fosfotungstat tarafından indüklenen nanodisklerin karakteristik istiflenmesinin (rouleau), ekstrinsik proteinin bağlanmasıyla önlendiğini gösteriyoruz.

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Katı destekli, protein içermeyen, Çift fosfolipid bilayer membranlar (DLBM) karmaşık ve dinamik lipid nanotüp ağlara dönüştürülebilir ve endoplazmik retikulum 2D aşağıdan yukarıya modelleri olarak hizmet verebilir.

Kendiliğinden oluşumu ve endoplazmik retikulum için aşağıdan yukarıya Model olarak yapay Lipid nanotüp ağların düzenlenmesi

Mitokondriyal füzyon mitokondriyal dinamiğin altında yatan önemli bir homeostatik reaksiyondur. Burada açıklanan bir in vitro reconstitution sistemi membran tethering çözebilir mitokondriyal iç membran füzyon çalışması, yerleştirme, hemifüzyon, ve gözenek açılması. Hücre zarı sistemlerinin araştırılmasında bu yaklaşımın çok yönlülüğü tartışılmıştır.

Mitokondriyal Membran Dinamiğinin Yeniden İkasini için Model Membran Platformu

Önceden oluşturulmuş nanodisklere birlikte translasyonel yerleştirme, tanımlanmış lipit ortamlarında deterjanlarla temas etmeden hücresiz sentezlenmiş membran proteinlerinin incelenmesini mümkün kılar. Bu protokol, temel sistem bileşenlerinin hazırlanmasını ve ifade verimliliğini ve numune kalitesini artırmak için kritik parametreleri açıklar.

Membran Proteinlerinin Önceden Oluşturulmuş Nanodisklere Ko-Translasyonel Olarak Yerleştirilmesi

Bu protokol, floresan mikroskobu kullanılarak yeniden oluşturulmuş, membrana bağlı sitoiskelet ağlarının dinamiklerini incelemek için desteklenen lipid çift katmanlarının oluşumunu ve hücre iskeleti filamentlerinin ve motor proteinlerin eklenmesini açıklar.

Membrana Bağlı Minimal Aktin Kortekslerinin Desteklenen Lipid Çift Katmanlı Üzerinde Yeniden Sulandırılması

Bu yazıda, F-aktin sitoiskeletini dev unilamellar lipid veziküllerine (lipozomlar olarak da adlandırılır) kapsüllemek için deneysel teknikleri ve lipozom zarının iç broşüründe korteks-biyomimik yapan bir F-aktin tabakası oluşturma yöntemini göstereceğiz.

İn Vitro Aktin Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Yeniden Sulandırılması

Burada, nanodiskler içeren biyoaktif ajanların üretimini ve karakterizasyonunu açıklıyoruz. Amfoterisin B nanodiskleri, protokolü aşamalı olarak tanımlamak için örnek olarak alınmıştır.

Nanodisk İçeren Biyoaktif Ajanın Formülasyonu ve Karakterizasyonu

Bu protokol, sterol taşıyıcı ABCG5/G8'in kristalizasyonu için bir kurulumu açıklar. ABCG5/G8, asılı damla kristalizasyonu için iki seliler halinde yeniden oluşturulur. Protokol, özel malzemeler veya substratlar gerektirmez, bu da X-ışını kristalografisi yoluyla protein yapısını belirlemek için herhangi bir laboratuvarda erişilebilir ve uyarlanmasını kolaylaştırır.

ABCG5/G8 X-ışını kristalografisi için lipidik bicelle ortamında kristalleşme

Membran proteinlerinin yeniden yapılandırılması ve enzimlerin ve diğer suda çözünür bileşenlerin mikrometre altı ve mikrometre boyutundaki lipid veziküllerinde kapsüllenmesi için bir protokol sunuyoruz.

Nano ve Mikrometre Boyutlu Veziküllerde Denge Dışı Metabolik Ağların İnşası

Bu çalışma, membran proteini TWIK ile ilişkili asite duyarlı K+ kanal 2'nin (Görev 2) nanodisklere yeniden yapılandırılması prosedürünü özetlemektedir. Başarılı montaj, iyi tanımlanmış iki boyutlu sınıf ortalamaları elde eden tek parçacıklı kriyoelektron mikroskopi ile doğrulandı.

Nanodisklerde Membran Proteinlerini Stabilize Etme Tekniği

Öğrenin MalFGK2 ABC taşıyıcısını nanodisc lipid parçacıklarına yerleştirme yöntemini. Bu teknik, membran proteinlerinin çözünür ortamda fonksiyonel çalışmaları için stabil kompleksler oluşturur.

Nanodisc Lipid Parçacıklar içine bir ABC Transporter Sulandırma için bir adım-adım yöntemi

Daha fazla video keşfet