Flourogenik DNAzymes kullanarak Bakterilerin Tespiti

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yeni grip genik, DNA, Zyme probları Önce tam genetik DNA kullanarak e coli gibi spesifik bakterilerin varlığını hızlı bir şekilde tespit etmektir. Zyme probları ligasyon ile üretilir. Bakteriler daha sonra hedef moleküllerin sayısını zenginleştirmek için kültürlenir ve süpernatandan tahakkuk eden hücre dışı karışım hazırlanır.

Ham hücre dışı karışım daha sonra DNA Zyme probu ile birleştirilir DNA Zyme probu ve hedef moleküller arasındaki etkileşim, probun bölünmesine neden olur ve bu daha sonra floresan kullanılır. Prob ve hedef arasındaki bir florimetre etkileşimi, bağıl floresansta bir artış olarak görülür. Sonuçlar daha sonra denatüre edici poli akrilamid jel elektroforez analizi kullanılarak doğrulanır.

Bu tekniğin PCR veya antikor bazlı yöntemlere göre en büyük avantajı, işlemin daha basit ve daha kolay gerçekleştirilmesidir. Bu yöntem bakteri e coli modeli ile geliştirilmiş olsa da, diğer gıda kaynaklı veya nozokomiyal bakteriyel patojenlerin tespitinde uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, sentetik DNA problarının ve bakterilerin işlenmesine alışkın olmayabilecekleri için mücadele edeceklerdir Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Sergio Aguire ve bu protokol için doktora sonrası bir araştırmacı olan Monso Ali'dir.

RFD, EC olan, öne çıkan DNA Zyme'dir. Katalitik dizi EC'den oluşur, biri siyahla altı çizili ve alt tabaka dizisi FS, biri yeşil renkle altı çizili, alt tabaka içinde bulunur, mavi r ile gösterilir, F ile gösterilen Fluor etiketli bir DT ile çevrilidir ve kuyruk RF ile gösterilen QUENCHER etiketli DT, RF SS bir, RFD EEC'nin karıştırılmış bir versiyonudur, burada katalitik dizi EEC biri kısmen SS birine karıştırılır, ancak FS'nin bir kısmı değişmeden kalır. RF DEC bir ve RF SS bir, oligonükleotid FS'nin, oligonükleotid EC ile bir veya SS ile birlikte, ham hücre dışı karışımları hazırlamak için ligasyon şablonu olarak LT birinin varlığında şablon aracılı enzimatik ligasyonu ile yapılır veya R-F-D-E-C için hedef olarak kullanılacak cem'ler, bir pipet tabancası kullanılarak steril 14 mililitrelik kültür tüplerine iki mililitre LB dağıtılarak başlanır.

Daha sonra, steril bir pipet ucu kullanarak, bir burgu plakasından tek bir e coli kolonisi seçin ve lb içeren bir kültür tüpüne bırakın. Tüpleri 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin ve inkübasyondan sonra 14 saat boyunca 250 RPM'de çalkalayın. % 1'lik bir yeniden aşılama kültürü oluşturmak için, iki mililitre taze LB'yi 14 mililitrelik kültür tüplerine dağıtın ve önceki adımdan 20 mikrolitre bakteri kültürü ekleyin.

Tüpleri 37 santigrat derecede inkübe edin ve her bakteri çözeltisi yaklaşık bir transferin OD 600'üne ulaşana kadar 250 RPM'de çalkalayın. Her kültürden bir mililitre yeni bir 1.5 mililitre mikro santrifüj tüpüne koyun ve hücreleri beş dakika boyunca 11.000 G'de santrifüjleme ile peletleyin. Döndürme işleminden sonra, şeffaf süpernatanı 1.5 mililitrelik yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Süpernatanı eksi 20 santigrat derecede saklayın. DNA enzimlerinin ham hücre özütü ile etkileşimi ile floresan sinyalin üretilip üretilmediğini belirlemek için hemen kullanılmayacaksa, numuneler spektrum Fotometrisi ile test edilir. Floresan spektrofotometreyi açın ve 488 nanometrede uyarma ve 520 nanometrede emisyon ile veri toplama parametrelerini ayarlayın.

Ayrıca cihazı bir saat boyunca her dakika okuma yapacak şekilde ayarlayın. Üç kuvars kristal küveti önce damıtılmış deiyonize su ve ardından %100 etanol ile yıkayın. Nitrojen gazını yakıp söndürerek küvetleri kurutun.

Küvetleri C olarak etiketleyin: bir, kontrol için bir, kontrol iki için C, ikinci kontrol için iki ve test için T, daha sonra 24 mikrolitre damıtılmış deiyonize suyu C bir'e ve hazırlanan e coli ham hücre dışı karışımın 24 mikrolitresini C ikisine aktarın ve T.Her bir Q veterinerine 25 mikrolitre iki X RB ekleyin ve bunları floresan spektrofotometreye yerleştirin. Beş dakika sonra floresan verilerini toplamaya başlayın, floresan okumalarının kesintiye uğramamasını sağlamak için bir mikrolitre beş mikromolar RFS S bir ila C iki ve bir mikrolitre beş mikromolar, RFD eec bir ila T ve C bir ekleyin. Her bir çözeltiyi pipetleme ile karıştırın, ardından alım süresinin geri kalanında reaksiyonun devam etmesine izin verin.

Verileri Excel dosya biçiminde kaydedin. Ardından verileri kişisel bir bilgisayara aktarın ve grafiksel bir görüntü oluşturmak için Excel'i kullanın. Spectra tarafından analiz için kullanılan aynı reaksiyon karışımları.

Fotometri, jel elektroforezi ile analiz için kullanılabilir. Bir saatlik satın alma işleminden sonra. Küvetleri spektrofotometreden çıkarın ve çözeltileri yeni mikro santrifüj tüplerine aktarın.

Beş mikrolitre üç molar sodyum asetat ve 125 mikrolitre %100 etanol ekleyerek reaksiyonları söndürün. Her çözeltiyi girdaplayarak karıştırın ve tüpleri inkübasyon santrifüjünü takiben bir saat boyunca eksi 20 santigrat derece dondurucuya koyun. Reaksiyon, dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 11.000 G'de karışır ve süpernatanı pipetleme ile dikkatlice çıkarın.

Peletleri bir DNA yoğunlaştırıcı kullanarak kurutun 10 dakika. 20 mikrolitre jel yükleme tamponu ekleyin ve kısaca girdap yapın. Tezgah üstü santrifüj ile kısa bir süre döndürün.

Daha sonra, çalışmadan sonra% 10 Dage jeli oyuğu başına 10 mikrolitre reaksiyon numunesi yükleyin. Cam plakaları çıkarın ve musluk suyuyla iyice yıkayın. Jel parçalarını çıkarmak için plakaları bir Kim mendiliyle silin.

Bir tayfun tarayıcı kullanarak jel plakayı floresan açısından tarayın. Sistemin hassasiyetini değerlendirmek için görüntü niceleme yazılımını kullanarak elde edilen görüntüleri analiz edin. Seri olarak seyreltilmiş kültürler artan süreler boyunca büyütülür.

Tek bir bakteriyi tespit etmek için gereken minimum inkübasyon süresini belirlemek için, iki mililitre lb içeren 10 kültür tüpü hazırlayın, her kültüre bir gliserol e coli stoğunun mililitresi başına 100 mikrolitre iki CFU ile aşılayın ve 37 santigrat derecede inkübe edin, 4, 8, 12, 16 ve 24 saatte 250 RPM'de çalkalayın. Aşılanmış kültür tüplerinin her birinden 300 mikrolitre hasat edin, çünkü zamanında hasat edilen numuneler için tespit edilebilir bakteri olmayabilir. Puan 4 8 12.

Bakteri içeren kültürleri tanımlamak için kalan kültürün 24 saat büyümesine izin verin. OD 600'ü ölçün ve hücreleri beş dakika boyunca 11.000 G'de santrifüjleme ile çökeltin. CEMS içeren süpernatanı taze 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın ve ertesi gün kullanana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Kültürleri büyüme açısından inceleyin. 10 kültürden sadece bir veya ikisi aşılamadan sonra e coli içerebilir ve kalan tüpler herhangi bir hücre içermeyecektir. Belirlenen zaman noktalarında pozitif kültürlerden geri kazanılan CEMS'yi kullanın RFD EEC one ile bölünme reaksiyonları hazırlamak için, daha önce tarif edildiği gibi DAGE jel elektroforezi kullanarak reaksiyon karışımlarını analiz edin, hem RFD EEC one hem de RF SS one probları, DNA zyme kısımlarının substrata enzimatik ligasyonu ile hazırlandı.

FS, CEM EEC ve RFD EEC'nin bir etkileşimi veya RF SS bir daha sonra spektrometri ile değerlendirildi. Burada görülebileceği gibi. RFDEC one, CEM ec ilavesi üzerine yüksek düzeyde floresan sinyali üretti.

Tam tersine, R FS S one güçlü bir floresan sinyali üretmedi. Böylece RFD EEC'nin floresan üretme işlevi. CEM ile iletişime geçildikten sonra EC sıralanır.

Gözlenen floresan artışlarının RNA bağlantısının bölünmesinden kaynaklandığını doğrulamak için spesifik. Reaksiyon karışımları, RFD eec'nin dage bölünmesi ile analiz edildi, bir ile 0.25 molar sodyum hidroksitin 2D NA fragmanları, Fluor'u tutan beş asal bir fragman ve söndürücüyü tutan üç asal bir fragman oluşturması bekleniyor. Burada görülebileceği gibi.

RFD EEC, CEM EEC reaksiyon karışımı gerçekten de beklenen bölünme ürününü üretti. Ayrıca, yalnızca UNC parçalanmış RFDEC bir ve beş asal parça floresan görüntüleme ile tespit edilebilir. RFD EEC'nin özgüllüğünü incelemek için, yalnızca diğer birkaç gram negatif ve gram pozitif bakteriden toplanan CEMS kullanılarak bir floresan testi gerçekleştirildi.

CEM EC içeren numune, floresanda bir artış üretti. Diğer bakterilerden CEMS ile çapraz reaktivite eksikliği, RFD-E-C'nin, 4, 8, 12, 16 ve 24 saat boyunca büyüme ortamı ile kültürlenmiş 100 mikrolitrede mililitre başına bir CFU'ya seyreltilmiş tek bir e coli hücresi e coli'yi tespit etmek için gereken minimum kültür süresini belirlemek için e coli için oldukça seçici olduğunu gösterir. Elde edilen CEMS, R-F-D-E-C ile karıştırıldı ve bölünme, burada gösterildiği gibi dage ile değerlendirildi.

Dage tahlilinin bir görüntüsü, RFD, E-C birinin beklenen bölünme ürününü üretmediğini gösterir. CEM ile reaksiyona girdiğinde. Dört ve sekiz saatlik büyümede toplanan ECS, bir kez ustalaştıktan sonra 12 saatlik kültür süresine ihtiyaç duyulduğunu gösterir.

Bu tekniğin ana bileşeni olan DA enzim bazlı test, bu gelişmeden sonra düzgün bir şekilde yapıldığı takdirde 60 dakikada yapılabilir. Prosedür, biyo analiz alanındaki araştırmacıların çok çeşitli bakteriyel patojenlerin tespiti için allojenik DNA enzimlerini keşfetmelerinin yolunu açtı.