Name: Flourogenik DNAzymes kullanarak Bakterilerin Tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: Öğrenin, florojenik DNAzim probları kullanarak Escherichia coli gibi bakterileri hızlı ve basit bir şekilde nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, PCR ve antikor tabanlı tekniklere göre daha kolay uygulanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu iş için finansman Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Kurumu (NSERC) ve Sentinel Biyoaktif Kağıt Network tarafından sağlanmıştır.

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Principles+of+Bacterial+Detection%3A+Biosensors%2C+Recognition+Receptors+and+Microsystems%22">Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems</a>. Zourob, M., Elwary, S., Truner, A. , Springer. New York. (2008).</li>
<li>Call, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+Opportunities+for+Pathogen+Detection+Using+DNA+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Challenges and Opportunities for Pathogen Detection Using DNA Microarrays.</a> Crit. Rev. Microbiol. 31, 91-99 (2005).</li>
<li>Lazcka, O., Campo, D. el, J, F., Muñoz, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+detection%3A+A+perspective+of+traditional+methods+and+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Pathogen detection: A perspective of traditional methods and biosensors.</a> Biosens. Bioelectron. 22, 1205-1217 (2007).</li>
<li>Velusamy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+foodborne+pathogen+detection%3A+In+the+perspective+of+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors.</a> Biotechnol. Adv. 28, 232-254 (2010).</li>
<li>Ali, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+DNAzyme+Probes+as+Bacterial+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic DNAzyme Probes as Bacterial Indicators.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).</li>
<li>Navani, N. K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+aptamers+and+enzymes+as+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).</li>
<li>Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Nucleic+Acid+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional Nucleic Acid Sensors.</a> Chem. Rev. 109, 1948-1998 (2009).</li>
<li>Li, Y., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+Y+%22Functional+Nucleic+Acids+for+Analytical+Applications%22">Functional Nucleic Acids for Analytical Applications</a>. , Springer. New York. (2009).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forty+Years+of+In+Vitro+Evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Forty Years of In Vitro Evolution.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 46, 6420-6436 (2007).</li>
<li>Breaker, R. R., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+enzyme+that+cleaves+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A DNA enzyme that cleaves RNA.</a> Chem. Biol. 1, 223-229 (1994).</li>
<li>Cuenoud, B., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+metalloenzyme+with+DNA+ligase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A DNA metalloenzyme with DNA ligase activity.</a> Nature. 375, 611-614 (1995).</li>
<li>Chinnapen, D. J., Sen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deoxyribozyme+that+harnesses+light+to+repair+thymine+dimers+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A deoxyribozyme that harnesses light to repair thymine dimers in DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 65-69 (2004).</li>
<li>Schlosser, K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologically+inspired+synthetic+enzymes+made+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA.</a> Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).</li>
<li>Silverman, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+as+a+versatile+chemical+component+for+catalysis%2C+encoding%2C+and+stereocontrol%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">DNA as a versatile chemical component for catalysis, encoding, and stereocontrol.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 7180-7201 (2010).</li>
<li>Mei, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+RNA-cleaving+DNA+enzyme+that+synchronizes+catalysis+with+fluorescence+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">An efficient RNA-cleaving DNA enzyme that synchronizes catalysis with fluorescence signaling.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 412-420 (2003).</li>
<li>Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblage+of+signaling+DNA+enzymes+with+intriguing+metal-ion+specificities+and+pH+dependences%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal-ion specificities and pH dependences.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).</li>
<li>Kandadai, S. A., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+catalytically+efficient+acidic+RNA-cleaving+deoxyribozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of a catalytically efficient acidic RNA-cleaving deoxyribozyme.</a> Nucleic Acids Res. 33, 7164-7175 (2005).</li>
<li>Rupcich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quenching+of+fluorophore-labeled+DNA+oligonucleotides+by+divalent+metal+ions%3A+implications+for+selection%2C+design%2C+and+applications+of+signaling+aptamers+and+signaling+deoxyribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Quenching of fluorophore-labeled DNA oligonucleotides by divalent metal ions: implications for selection, design, and applications of signaling aptamers and signaling deoxyribozymes.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 780-790 (2005).</li>
<li>Shen, Y., Brennan, J. D., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+secondary+structure+and+identifying+functionally+essential+nucleotides+of+pH6DZ1%2C+a+fluorescence-signaling+and+RNA-cleaving+deoxyribozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterizing the secondary structure and identifying functionally essential nucleotides of pH6DZ1, a fluorescence-signaling and RNA-cleaving deoxyribozyme.</a> Biochemistry. 44, 12066-12076 (2005).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revitalization+of+six+abandoned+catalytic+DNA+species+reveals+a+common+three-way+junction+framework+and+diverse+catalytic+cores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Revitalization of six abandoned catalytic DNA species reveals a common three-way junction framework and diverse catalytic cores.</a> J. Mol. Biol. 357, 748-754 (2006).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+high-branching+deoxyribozymes+from+a+catalytic+DNA+with+a+three-way+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of high-branching deoxyribozymes from a catalytic DNA with a three-way junction.</a> Chem. Biol. 13, 1061-1069 (2006).</li>
<li>Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalysis+and+rational+engineering+of+trans-acting+pH6DZ1%2C+an+RNA-cleaving+and+fluorescence-signaling+deoxyribozyme+with+a+four-way+junction+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+BioChem%22%5BJournal%5D)">Catalysis and rational engineering of trans-acting pH6DZ1, an RNA-cleaving and fluorescence-signaling deoxyribozyme with a four-way junction structure.</a> Chem BioChem. 7, 1343-1348 (2006).</li>
<li>Ali, M. M., Kandadai, S. A., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pH3DZ1+-+An+RNA-cleaving+deoxyribozyme+with+optimal+activity+at+pH+3%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of pH3DZ1 - An RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 3.</a> Can. J. Chem. 85, 261-273 (2007).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+signaling+platforms+built+from+a+small+catalytic+DNA+and+doubly+labeled+fluorogenic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient signaling platforms built from a small catalytic DNA and doubly labeled fluorogenic substrates.</a> Nucleic Acids Res. 35, 401-405 (2007).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+fluorescent+sensors+engineered+with+catalytic+DNA+MgZ+based+on+a+non-classic+allosteric+design%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA MgZ based on a non-classic allosteric design.</a> PLoS ONE. 2, e1224(2007).</li>
<li>Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrapment+of+fluorescence+signaling+DNA+enzymes+in+sol+gel-derived+materials+for+metal+ion+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Entrapment of fluorescence signaling DNA enzymes in sol gel-derived materials for metal ion sensing.</a> Anal. Chem. 79, 3494-3503 (2007).</li>
<li>Kandadai, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+RNA-cleaving+deoxyribozyme+with+optimal+activity+at+pH+5%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of an RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 5.</a> Biochemistry. 48, 7383-7391 (2009).</li>
<li>Zhao, W., Brook, M. A., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodic+assembly+of+nanospecies+on+repetitive+DNA+sequences+generated+on+gold+nanoparticles+by+rolling+circle+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Periodic assembly of nanospecies on repetitive DNA sequences generated on gold nanoparticles by rolling circle amplification.</a> Methods Mol. Biol. 474, 79-90 (2008).</li>
<li>Navani, N. K., Mok, W. K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+protein-binding+DNA+aptamers+as+ligands+for+biosensing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of protein-binding DNA aptamers as ligands for biosensing applications.</a> Methods Mol. Biol. 504, 399-415 (2009).</li>
<li>Ali, M. M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+sensing+by+using+allosteric-DNAzyme-coupled+rolling+circle+amplification+and+a+peptide+nucleic+acid-organic+dye+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Colorimetric sensing by using allosteric-DNAzyme-coupled rolling circle amplification and a peptide nucleic acid-organic dye probe.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 3512-3515 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Sık görülen bakteriyel algılama yöntemleri çoğu bugün de yavaş (klasik mikrobiyal) veya teknik olarak zor bir (antikor, PCR) vardır. Böylece, algılama araçları yeni nesil hız ve basitlik doğru hitap gerektiğine inanıyoruz. Bu amaçla, bir RNA-kesici, ve bir floresans sinyalinin üretilmesi yoluyla bakteri varlığında bildirmek için basit bir deneyleri geliştirmek için de kullanılabilir floresans-sinyalleşme DNAzyme oluşturduk. Özellikli DNAzyme probu, RFD-EC1, E. büyümesi sırasında üretilen CEM aktive edilir kültür ortamına coli. Bizim yöntemi algılama hedef olarak bir bakterinin ham ekstrasellüler karışımları kullanan ve zahmetli hedef çıkarma ve güçlendirme adımları atlar olduğundan, çok basit kurmak için kullanılabilir, bakteriyel tespiti için testlerin tipi &quot;mix-ve-oku&quot;. Bizim DNAzyme kullanımına dayalı floresans saptama yöntemi ile sınırlı değildir. Örneğin, kolorimetrik tespiti aynı DNAzyme sistem testi kullanarak cBir organik boya ile birlikte yuvarlanma daire amplifikasyon yararlanan önceden bildirilen yöntem kullanılarak tasarlanabilir. 32 Biz büyük işlem kolaylığı ile yeni bakteriyel biyosensörler oluşturmak için çekici bir cadde gibi bakteriyel tespiti için DNAzymes kullanımını öngörüyoruz.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası veya model </td></tr><tr><td> Agar </td><td> BioShop Kanada </td><td> AGR003 </td></tr><tr><td> Amonyum persülfat (APS) </td><td> BioShop Kanada </td><td> AMP001 </td></tr><tr><td> Akrilamid / Bis-akrilamit (% 40, 29:1) </td><td> BioShop Kanada </td><td> ACR004 </td></tr><tr><td> Asit borik </td><td> BioShop Kanada </td><td> BOR001 </td></tr><tr><td> Bromofenol mavi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8026 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> EM Bilim </td><td> EXO539-1 </td></tr><tr><td> HCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 38281 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Bioshop Kanada </td><td> HEP001 </td></tr><tr><td> LB broth </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L3022 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> EMDKimyasallar </td><td> B10149-34 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BioShop Kanada </td><td> SOD002 </td></tr><tr><td> NaOAc </td><td> Merck Kimyasallar </td><td> SXO255-1 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Merck Kimyasallar </td><td> SXO590-1 </td></tr><tr><td> SDS </td><td> BioShop Kanada </td><td> SDS001 </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> BioShop Kanada </td><td> TEM001 </td></tr><tr><td> Tris-bazlı </td><td> BioShop Kanada </td><td> BST666 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9416 </td></tr><tr><td> Üre </td><td> BioShop Kanada </td><td> URE001 </td></tr><tr><td> Xylenecyanol FF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X4126 </td></tr><tr><td> DNA konsantratör </td><td> Thermo Scientific </td><td> Savant DNA SpeedVac 120 </td></tr><tr><td> Millex filtre ünitesi </td><td> Millipore </td><td> SLGP033RS </td></tr><tr><td> Jel yükleme ipuçları </td&gt; <td> DiaMed </td><td> TEC200EX-K </td></tr><tr><td> ImageQuant yazılım </td><td> Moleküler Dinamik </td><td> Sürüm 5.0 </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly-Clark Professional </td><td> 34705 </td></tr><tr><td> Mini Vortexer </td><td> VWR </td><td> 58816-121 </td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> PECHINEY Plastik Ambalaj </td><td> PM996 </td></tr><tr><td> Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> Fisherbrand 08-757-12 </td></tr><tr><td> Stripettor Plus (Pipet tabancası) </td><td> Corning </td><td> 07764714 </td></tr><tr><td> Quartz küvetler </td><td> Varian Inc </td><td> 66-100216-00 </td></tr><tr><td> Shaker / İnkübatör </td><td> New Brunswick Scientific </td><td> Classic Serisi C24 </td></tr><tr><td> Typhoon Tarayıcı </td><td> GE Healthcare </td><td> 9200 Değişken modu </td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X22-R </td></tr><tr><td> UV Spektrofotometre </td><td> Thermo Scientific </td><td> GenesysUV 10 </td></tr><tr><td> Floresans Spektrofotometre </td><td> Varian Inc </td><td> Cary Eclipse </td></tr></tbody></table>

flourogenik dnazymes kullanarak bakterilerin tespiti

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Salgınlar ölüm ve hastaneye milyonlarca yanı sıra muazzam ekonomik kayıpların her yıl gıda kaynaklı ve hastane kökenli patojenlerin hesabına bağlanmıştır. Devam eden bir salgın yerde doğru ilk aşamada suçlu patojenler tespit edebilir analitik yöntemler için giderek artan bir talebin etkisi bu tür salgınların önlenmesi ve azaltılması. Yüksek spesifite (faiz sadece bakteri tespit), yüksek hassasiyeti (düşük olarak tespit edebilen: patojen tespiti için etkili yöntemler büyük bir dizi olmasına rağmen, bunların hiçbiri ideal bir tespit yöntemi için somutlaşan tüm aşağıdaki beş önde gereksinimlerini tatmin edebilir tek bir canlı bakteri hücresi gibi), kısa zaman-sonuçları (saat dakika), büyük bir işlem kolaylığı (uzun örnekleme işlemleri ve özel ekipman kullanımı için gerek yoktur), ve maliyet etkinliği. Örneğin, klasik mikrobiyolojik yöntemlerle son derece özeldir ama uzun bir süre (da gerektirirhafta ys) 1-PCR ve antikor tabanlı teknikler daha kısa bekleme süreleri (gün saat) sunuyoruz. kesin sonuç elde etmek, ancak pahalı reaktifler ve / veya gelişmiş ekipman kullanımı. Sonuç 2-4 gerektiren, hala Yukarıda belirtilen şartların bir veya daha fazla gelişmiş özellikler sunan yenilikçi bakteriyel algılama yöntemleri geliştirmeye yönelik bilimsel araştırmalar için büyük bir talep. Laboratuvarımız bakteriyel algılama dahil biyoalgı uygulamalar için moleküler probların yeni bir sınıf olarak DNAzymes potansiyelinin incelenmesi ilgileniyor. 5 DNAzymes (ayrıca deoxyribozymes veya DNA enzimleri olarak da bilinir) insan yapımı kimyasal reaksiyonları katalize yeteneği ile tek iplikli DNA molekülleri. 6-8 Bu moleküller kadar 10 içeren geniş bir rastgele sırası DNA havuzu (izole edilebilir bir işlem ile tek tek 16 sekansları) o &quot;in vitro seçime&quot; olarak da bilinirr &quot;SELEX&quot; (üstel zenginleştirme tarafından ligandların sistematik evrim). 9-16 Bu özel DNA molekülleri yaygın biyoalgı uygulamaları için moleküler araçlar olarak son yıllarda incelenmiştir. 6-8 Laboratuvarımız RNA-yarma floresan DNAzymes (. RFDs; Şekil 1) izole etmek için in vitro seçim prosedürleri kurmuştur ve analitik araçları olarak RFDs kullanımı araştırılmıştır 17-29 RFDs tek ribonükleotid bir DNA-RNA kimerik substrat bölünme katalize. Bir fluorofor (F) ve bir quencher (Q) tarafından taarruz altında kalır bileşke (R). F ve Q yakın uncleaved substrat minimum floresans vermektedir. Bununla birlikte, bölünme olayı floresans yoğunluğunu ve önemli bir artış eşlik eder F ve Q, bir ayırma yol açar. Daha yakın zamanlarda, biz bakteriyel tespiti için RFDs izole bir yöntem geliştirdi. 5. Bu özel RFDs &quot;için izole edilmiştirkendi ortamında ya da kültüre ortama bakteri belirli bir türü (Şekil 1) geride bıraktığı ham ekstraselüler karışımı (CEM) varlığında &quot;yanar. ham karışımının kullanılması arındırıcı süreci sıkıcı circumvents ve biyosensör geliştirme (tamamlamak için aylar veya yıllar sürebilir) için ilgi mikrop uygun bir hedef belirleme. ekstrasellüler hedeflere kullanımı hücre içi hedefleri elde etmek için adımlar için gerek yoktur, çünkü test edilmesinden prosedürü basit anlamına gelir. Sadece E. tarafından üretilen CEM varlığında; yukarıdaki yaklaşım kullanılarak, (Şekil 2A. FS1) ile alt tabaka parçalayarak bir RFD türetilmiş coli (CEM-AT). 5 Bu E. RFD-EC1 (Şek. 2A) adlı coli algılama RFD, sıkı bir şekilde CEM-EC yanıt veren, ancak diğer bakterilerin bir ana (Şekil 3) den CEMS maddelere karşı karşılık vermeyen olduğu bulunmuştur. Burada PreseE. kurmak için önemli deneysel prosedürleri nt RFD-EC1 ve temsili sonuçları kullanılarak coli algılama testleri.

Biz son zamanlarda basit bir bakteriyel tespiti için floresan assay &quot;mix-ve-okuma&quot; kurmak için uygulanabilir Flourogenik DNAzyme probları üretmek için yeni bir yaklaşım bildirdin. Bu özel DNA sondaları böylece floresans sinyali kuşağa bakteriyel algılama çevirme belirli bakteri tarafından üretilen ham hücre dışı karışımı (CEM) varlığında, bir kromofor-değiştirilmiş-DNA RNA kimerik substratın bölünme katalize. Bu yazıda, &quot;RFD-EC1&quot; ifade belirli bir DNAzyme prob modeli bakterinin tespiti için kullanılır önemli deneysel prosedürleri açıklayacağız<em&gt; Escherichia coii&#39;nin (E. Coli)</em&gt;.

Flourogenik DNAzymes kullanarak Bakterilerin Tespiti

Gıda kaynaklı ve hastane kaynaklı patojenlerle bağlantılı salgınlar, milyonlarca ölüme ve hastaneye yatırılmaya yol açtığı gibi devasa ekonomik kayıplara da neden olmaktadır...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yeni floresan DNAzim probları kullanarak E. coli gibi spesifik bakterilerin varlığını hızlı bir şekilde tespit etmektir. İlk olarak, genik DNAzim probları ligasyon yoluyla üretilir. Ardından, hedef molekül sayısını artırmak için bakteriler kültüre alınır ve supernatanttan hücre dışı karışım hazırlanır.Ardından, ham hücre dışı karışım DNA zim probu ile birleştirilir; DNA zim probu ile hedef moleküller arasındaki etkileşim, probun parçalanmasıyla sonuçlanır ve ardından prob floresan yayar. Prob ve hedef arasındaki etkileşim, bir florimetre kullanılarak bağıl floresan artışı olarak gözlemlenir. Sonuçlar daha sonra denatüre poliakrilamid jel elektroforez analizi kullanılarak doğrulanır.Bu tekniğin PCR veya antikor tabanlı yöntemlere göre temel avantajı, prosedürün daha basit ve uygulanmasının daha kolay olmasıdır. Bu yöntem model bakteri e coli ile geliştirilmiş olsa da, diğer tüm gıda kaynaklı veya nozokomiyal bakteriyel patojenlerin saptanmasında uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, sentetik DNA problarının ve bakterilerin kullanımıyla ilgili deneyimleri olmadığı için başlangıçta zorluk çekebilirler. Bu protokol için prosedürü, laboratuvarımdan araştırma asistanı Sergio Aguire ve doktora sonrası araştırmacı Monso Ali göstermektedir.Öne çıkan DNA Zyme, R-F-D-E-C one'dır. Bu yapı, siyahla altı çizili olan katalitik EC one dizisi ile yeşil ile altı çizili olan substrat FS one dizisinden oluşur; substrat içerisinde mavi r ile belirtilen bir RNA bağı, F ile belirtilen Flor işaretli bir DT ve queue ile belirtilen bir SÖNDÜRÜCÜ (QUENCHER) işaretli DT bulunur. RF SS one, katalitik EEC one dizisinin kısmen SS one içine karıştırıldığı, ancak FS one kısmının değişmeden kaldığı RFD EEC one'ın randomize edilmiş (scrambled) bir versiyonudur. R-F-D-E-C one için hedef olarak kullanılacak ham hücre dışı karışımları (CEM'ler) hazırlamak amacıyla RF DEC one ve RF SS one, LT one ligasyon şablonunun varlığında, oligonucleotid FS one'ın oligonucleotid EC one veya SS one ile şablon aracılı enzimatik ligasyonu yoluyla üretilir. İşleme, bir pipet tabancası kullanarak steril 14 mL'lik kültür tüplerine 2 mL LB dağıtarak başlayın.Ardından, steril bir pipet ucu kullanarak, bir agar plakadan tek bir e coli kolonisi alın ve bunu LB içeren bir kültür tüpüne aktarın. Tüpleri 37 °C'ye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin ve inkübasyon sonrası 14 saat boyunca 250 RPM'de çalkalayın. %1'lik bir inokülasyon kültürü oluşturmak için, 14 ml'lik kültür tüplerine iki mililitre taze LB dağıtın ve önceki adımdan elde edilen bakteriyel kültürden 20 µL ekleyin.Tüpleri, her bir bakteri solüsyonu yaklaşık bir OD 600 değerine ulaşana kadar 37 °C'de 250 RPM sallama ile inkübe edin. Her kültürden bir mililitre yeni bir 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri 11.000 G'de beş dakika santrifüjleyerek çöktürün. Santrifüj işleminden sonra berrak süpernatantı taze bir 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Süpernatantı -20 °C'de saklayın. DNA enzimlerinin ham hücre özütü ile etkileşimi sonucu floresan sinyal oluşup oluşmadığının belirlenmesi için hemen kullanılmayacaksa, numuneler spektrofotometre ile analiz edilir. Floresan spektrofotometreyi açın ve veri toplama parametrelerini 488 nm eksitasyon ve 520 nm emisyon olarak ayarlayın.Ayrıca, cihazı bir saat boyunca her dakika okuma yapacak şekilde ayarlayın. Üç adet kuvars kristal küveti önce distile deiyonize suyla, ardından %100 etanol ile yıkayın. Küvetleri azot gazı püskürterek kurutun.Küvetleri kontrol bir için C1, kontrol iki için C2 ve test için T olarak etiketleyin; ardından C1'e 24 µL distile deiyonize su, C2 ve T'ye ise hazırlanan e coli ham hücre dışı karışımından 24 µL aktarın. Her küvete 25 µL 2X RB ekleyin ve küvetleri floresan spektrofotometreye yerleştirin. Beş dakika sonra floresans verilerini toplamaya başlayın, floresans okumalarının kesilmediğinden emin olarak C2'ye 1 µL 5 µM RFS S1, T ve C1'e ise 1 µL 5 µM RFD eec1 ekleyin. Her çözeltiyi pipetleme yoluyla karıştırın, ardından reaksiyonun veri toplama süresinin geri kalanında devam etmesine izin verin.Verileri Excel dosya formatında kaydedin. Ardından verileri bir kişisel bilgisayara aktarın ve grafiksel bir görüntü oluşturmak için Excel'i kullanın. Spectra ile analiz için kullanılan reaksiyon karışımlarının aynısıdır.Fotometri, jel elektroforez ile analiz için kullanılabilir. Bir saatlik kazanım süresinin ardından, küvetleri spektrofotometreden çıkarın ve çözeltileri yeni mikro santrifüj tüplerine aktarın.Beş mikrolitre 3 M sodyum asetat ve 125 mikrolitre %100 etanol ekleyerek reaksiyonları durdurun. Her bir çözeltiyi vorteksleyerek karıştırın ve inkübasyon sonrası santrifüj öncesinde tüpleri -20 °C dondurucuda bir saat bekletin. Reaksiyon karışımlarını 4 °C'de 20 dakika boyunca 11.000 G'de santrifüjleyin ve süpernatantı pipetleme yoluyla dikkatlice uzaklaştırın.Peletleri bir DNA konsantratörü kullanarak 10 dakika boyunca kurutun. 20 µL jel yükleme tamponu ekleyin ve kısa süreliğine vorteksleyin. Masaüstü santrifüj ile kısa süreliğine çöktürün.Ardından, çalışma tamamlandıktan sonra %10'luk Dage jelinin her kuyucuğuna 10 µL reaksiyon örneği yükleyin. Cam plakaları çıkarın ve musluk suyuyla iyice yıkayın. Kalan jel parçalarını temizlemek için plakaları bir Kim wipe ile silin.Typhoon tarayıcı kullanarak jel plakayı floresan için tarayın. Sistemin hassasiyetini değerlendirmek için ortaya çıkan görüntüleri görüntü miktar belirleme (quant) yazılımı ile analiz edin. Seri dilüsyonlu kültürler, artan zaman aralıklarında büyütülür.Tek bir bakteriyi tespit etmek için gereken minimum inkübasyon süresini belirlemek amacıyla, iki mililitre LB içeren 10 kültür tüpü hazırlayın; her bir kültürü, E. coli gliserol stokundan mililitre başına 2 CFU içeren 100 mikrolitre ile inoküle edin ve 37 °C'de, 250 RPM hızında çalkalayarak 4, 8, 12, 16 ve 24 saat boyunca inkübe edin. 4, 8 ve 12. saatle ilgili zaman noktalarında hasat edilen örneklerde tespit edilebilir bakteri bulunmayabileceği için, inoküle edilen kültür tüplerinin her birinden 300 mikrolitre hasat edin.Bakteri içeren kültürleri belirlemek için kalan kültürün 24 saat boyunca büyümesine izin verin. OD 600 değerini ölçün ve hücreleri 11, 000 G'de beş dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün. CEMS içeren süpernatanı taze 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın ve ertesi gün kullanana kadar minus 20 degrees Celsius'ta saklayın.Kültürlerde büyüme olup olmadığını kontrol edin. İnokülasyon sonrası 10 kültürden sadece bir veya ikisi E. coli içerebilir ve geri kalan tüplerde herhangi bir hücre bulunmayacaktır. Belirlenen zaman noktalarında pozitif kültürlerden geri kazanılan CEMS'leri kullanarak RFD EEC one ile kesim reaksiyonları hazırlayın ve reaksiyon karışımlarını daha önce açıklanan DAGE jel elektroforezi ile analiz edin; hem RFD EEC one hem de RF SS one probları, DNAzim kısımlarının substrata enzimatik ligasyonu ile hazırlanmıştır.CEM EEC ile RFD EEC veya RF SS arasındaki etkileşim daha sonra spektrometri ile değerlendirilmiştir. Burada görülebileceği üzere, CEM ec eklenmesi üzerine R-F-D-E-C yüksek düzeyde floresan sinyali üretmiştir.Buna tam tersine, R FS S one güçlü bir floresan sinyali üretmedi. Böylece RFD EEC one'ın floresans üreten fonksiyonu, CEM EC ile temas ettiğinde dizilenir.Gözlemlenen floresan artışlarının RNA bağının kopmasından kaynaklandığını doğrulamak için spesifik bir işlem yapılmıştır. Reaksiyon karışımları, RFD eec'nin dage koparılmasıyla analiz edilmiştir; 0,25 molar sodyum hidroksit ile işlem yapıldığında, biri floresanı tutan beş prime fragmentı ve diğeri susturucuyu tutan üç prime fragmentı olmak üzere iki RNA fragmentı oluşması beklenir. Burada görülebileceği gibidir.RFD EEC CEM EEC reaksiyon karışımı gerçekten beklenen parçalanma ürününü oluşturdu. Dahası, sadece UNC, R-F-D-E-C'yi parçaladı ve beş-prime fragmanı floresan görüntüleme ile tespit edilebildi. RFD EEC'nin özgünlüğünü incelemek için, yalnızca diğer çeşitli gram-negatif ve gram-pozitif bakterilerden toplanan CEMS kullanılarak floresan analizleri gerçekleştirildi.CEM EC içeren örnekte floresan artışı gözlemlenmiştir. Diğer bakterilerden elde edilen CEMS ile çapraz reaksiyon görülmemesi, R-F-D-E-C one'ın E. coli için yüksek derecede seçici olduğunu göstermektedir. Tek bir E. coli hücresini tespit etmek için gereken minimum kültür süresini belirlemek amacıyla, mililitre başına bir CFU olacak şekilde seyreltilmiş E. coli, 100 µL büyüme ortamında 4, 8, 12, 16 ve 24 saat boyunca kültüre edilmiştir. Elde edilen CEMS'ler R-F-D-E-C one ile karıştırılmış ve burada gösterildiği gibi DAG-E ile parçalanma durumu değerlendirilmiştir.Dage testi görüntüsü, R-F-D-E-C birincisinin beklenen kesim ürününü oluşturmadığını göstermektedir. CEM ile reaksiyona girdiğinde, büyümenin dördüncü ve sekizinci saatlerinde toplanan ECS'ler, yöntemde uzmanlaşıldığında 12 saatlik kültür süresinin gerekli olduğunu göstermektedir.Bu tekniğin temel bileşeni, bu gelişmeden sonra doğru şekilde uygulandığında DA enzim tabanlı analizin 60 dakika içinde tamamlanabilmesidir. Bu prosedür, biyoanaliz alanındaki araştırmacıların geniş bir yelpazedeki bakteriyel patojenlerin tespiti için allojenik DNA enzimlerini keşfetmelerinin önünü açmıştır.

detection-of-bacteria-using-fluorogenic-dnazymes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Kim, H. ve ark., Yüksek verimli Genetik Enzim Tarama Sistemi Kullanarak Çok Enzimli Tarama. J. Vis. Exp. (2016)Bu video, metagenomik fosmid kütüphaneleri ve kromojenik substratlar kullanılarak enzim ifadesini tespit etmek için genetik tarama yöntemini göstermektedir. Akış sitometrisi, renkli ürünler üreten tek hücreleri tanımlar ve izole eder; böylece aktif enzim eksprese eden hücrelerin yüksek verimlilikte seçimini sağlar.

Genetik olarak Değiştirilmiş Bakteri Hücrelerinde Hedef Enzim İfadesinin Tespiti

Bu videoda, nanosensörler kullanarak gıda ve su numunelerindeki bakteriyel kirleticileri tespit etmek için kullanılan bir teknik gösterilmektedir. Hedef patojenik bakteriler, manyetik gevşeme ve floresan emisyon modalitelerinin bir kombinasyonu ile tespit edilir.

Manyeto-floresan nanosensörler kullanarak bakteriyel kontaminasyonu tespit etme

Bakteriyel patojenez alanı merkezinde mikroplar ökaryotik hücrelere maruz kaldıktan sonra hayatta nasıl olursa ve tanımlamak için yeteneğidir. Bu makalede, iç ve konakçı hücreler ile ilgili ayrı ayrı bakterilerin canlılığı ortaya floresan boyaların kullanımı için protokolleri özetlenmektedir.

Memeli Hücreleri ile Derneği&#39;nin Bakterilerin Canlılık belirlenmesi için Floresan Mikroskopi Yöntemleri

Burada, DIG etiketli 16S rRNA hedefli DNA probları kullanılarak parafine gömülü dokulardaki bakterileri lokalize etmek için bir yöntem açıklanmıştır. Bu protokol, periodontitis, kanserler ve inflamatuar bağışıklık hastalıkları gibi çeşitli hastalıklarda bakterilerin rolünü incelemek için uygulanabilir.

16S rRNA Hedefleme Digoksin-etiketli DNA probu kullanılarak Parafine gömülmüş dokular içinde Bakterilerin in situ tespiti

RNA parçalayan DNAzime, üreaz ve manyetik boncuklardan yararlanan modifiye bir turnusol testi kullanarak E. coli'nin kolorimetrik tespiti için bir protokol açıklıyoruz.

Turnusol Testi kullanarak Bakterilerin Kolorimetrik Tespiti

Bakterilerde temel süreçleri işlevini anlamak zordur. Floresans mikroskobu hedef özel boyalar ile mikrobiyal hücre büyüme ve hücre döngüsü ilerleme içine anahtar anlayışlar sağlayabilir. Burada, Agrobacterium tumefaciens yöntemleri canlı hücre görüntüleme için gerekli işlemleri karakterizasyonu için vurgulamak için bir model bakteri kullanılmaktadır.

Temel işlemler sırasında mikrobiyal hücre büyümesini gözlemlemek için hücre Floresans mikroskobu canlı

Geçerli Zika, chikungunya ve dang virüs karmaşık numune hazırlama ve pahalı araçları gerektirir ve düşük kaynak ortamlarda kullanmak zor tespit etmek için teşhis multiplexed. Algılamak ve yüksek duyarlılık ve özgüllük ile bu virüs ayırt etmek için hedef özgü strand displaceable probları ile izotermal amplifikasyon kullanan bir tanı gösteriyoruz.

Çoğaltılmış izotermal amplifikasyon Zika, Chikungunya ve dang 1 tespit etmek için teşhis platformu dayalı

Burada, floresan peptidler yerli protein yerine parçalanabilir substrat olarak kullanıldığı bir değiştirilmiş zymographic teknik için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Elektroforez floresan peptid zymograms Biyolojik örneklerin daha önceki zymographic teknikleri geniş proteaz tespiti sağlar.

Floresan peptid Zymography tarafından proteaz aktivitesinin algılama

Floresan etiketli antibiyotikler antimikrobiyal direnç birden fazla yönünü incelemek için kullanılabilecek güçlü araçlardır. Bu makalede floresan etiketli antibiyotiklerin hazırlanması ve bakterilerde antibiyotik direnci eğitimi için uygulama açıklanmaktadır. Problar spektrofotometri, akış sitometrisi ve mikroskopi ile bakteriyel direnç (örn. efflux) mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir.

Floresan Antibiyotik Probları Kullanılarak Bakteriyel Direncin Görüntülenmesi

Burada floresan görüntüleme yaklaşımı için bir protokol, D NA, RNA ve protein'in (MICDDRP) multiplex immunofloresan cell bazlı detectionu, viral protein ve farklı tip ve karaya oturmuş nükleik asitlerin eşzamanlı floresan tek hücreli görselleştirmesini yapabilen bir yöntemdir. Bu yaklaşım çok çeşitli sistemlere uygulanabilir.

Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme

DNAzyme tabanlı nanomakineler, nükleik asitlerin son derece seçici ve hassas tespiti için kullanılabilir. Bu makale, özgür yazılım kullanılarak 10-23 çekirdekli DNAzyme tabanlı nanomakinelerin tasarımı için ayrıntılı bir protokolü ve örnek olarak bir Epstein-Barr virüs parçasının tespitinde uygulanmasını açıklamaktadır.

DNAzyme 10-23 - Nükleik Asit Tanıma için Tabanlı Nanomakineler

Öğrenin, florojenik DNAzim probları kullanarak Escherichia coli gibi bakterileri hızlı ve basit bir şekilde nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, PCR ve antikor tabanlı tekniklere göre daha kolay uygulanır.

Flourogenik DNAzymes kullanarak Bakterilerin Tespiti

Daha fazla video keşfet