Name: Sıçan Embriyonik Nöral Hücre İzolasyonu ve Kültür: Bir Hızlı Protokol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Öğrenin sıçan embriyolarından hipokampal ve kortikal nöron izolasyonu için hızlı bir protokol. Bu yöntem, serum içermeyen koşullarda neredeyse saf nöronal kültürler elde etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz editoryal yardım için Jonna Ellis teşekkür ederim. Ruh Sağlığı Ulusal Enstitüsü: açıklanan proje Ödülü Numarası R01MH079751 (F. Peruzzi PI) tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ruh Sağlığı Ulusal Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmez.

1. Poli-D-Lizin (PDL): Hazırlanması <ol><li> 1 mg / ml &#39;lik bir stok solüsyonu elde etmek için PDL 5 mg steril GKD 2 O 5 ml ilave edilir. </li><li> Birkaç kez pipetleme tarafından stok solüsyonu karıştırın. </li><li> Hemen kullanın veya 2-8 Poly-D-Lizin Çözüm saklamak ° C </li></ol> 2. Poly-D-Lizin (PDL): Kaplama Plastik Hücre Kültürü Yemekleri <ol><li> Steril GKD 2 O ile 10 ug / ml &#39;lik nihai konsantrasyona PDL stok solüsyonu ile seyreltilir. </li><li> Kültür yüzey alanı (60 mm çanak için 3 ml) kapsayacak şekilde 60 mm çanak pipetleyin yeterli bir çözüm. </li><li> Kültür yüzey hatta kaplama sağlamak için hafifçe sallayın. </li><li> Gece boyunca oda sıcaklığında (RT) az kaplı inkübe edin. </li><li> Ertesi gün, genellikle diseksiyon gün, aspirasyon tarafından Poly-D-Lizin Çözüm kaldırmak ve steril GKD 2 O 3 ml kısaca yıkayın Bu adımı yineleyin. İkinci yıkamadan sonra, aspirasyon tamamen su çıkarmak. </li><li>Plakalar üç hafta için 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 3. Poly-D-Lizin (PDL) ve Laminin: Cam hazırlanması ve Kaplama İki odacıklı Slaytlar <ol><li> Sırasıyla, 10 ve 5 ug / ml, nihai konsantrasyon Steril GKD 2 O karışımı PDL (1 mg / ml) ve laminin (1 mg / ml) stok çözeltileri. </li><li> Cam bir kuyu iki odacıklı slayt kültür yüzey alanı (2 hatta cam çift odacıklı slayt her iyi için 1 ml) kapsayacak şekilde pipetleyin yeterli bir çözüm. </li><li> Kültür yüzey hatta kaplama sağlamak için hafifçe sallayın. </li><li> Gece boyunca oda sıcaklığında kaplı inkübe edin. </li><li> Ertesi gün, aspirasyon yoluyla Poly-D-Lizin-Laminin kaplama çözümü kaldırmak ve steril GKD 2 O. 1 ml ile iki kez kısaca yıkayın İkinci yıkamadan sonra, aspirasyon tamamen su çıkarmak. </li><li> Odacık slaytlarınızı üç hafta için 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> Not: Herhangi bir cam haznesi slayt izlemeye kaplanabilirg bu protokol. Her bir slayt kontrolü test Deneysel ortamda (örneğin tedavi edilmezse karşı tedavi, untransfected karşı transfekte) sağlar çünkü çoğu zaman çift odacıklı slaytlar kullanın. 4. Nöronal Diseksiyon ve Kültür <ol><li> 37 ° C su banyosunda aşağıdaki reaktifler Isınma: <ul type="disc"><li> Orijinal 100 ml şişe üzerine TrypLE Express. </li><li> Neurobasal/B27 tam orta (tablo görüyorum). Isıttı hacmi (on 60 mm kaplamalı yemekler örneğin 30 ml) kaplamalı olarak yemeklerinin sayısına bağlıdır. </li></ul></li><li> Dört adet 60 mm&#39;lik kültür kaplarına ve 15 ml BD Falcon yüksek netlik polipropilen konik tüpe 13 ml soğuk Hazırda E çözeltisinden 3 ml ekleyin. </li><li> Üç 100 mm&#39;lik kültür kaplarına her birine soğuk diseksiyon orta (tablo II, Dr Olimpia Meucci, kişisel iletişim bakın) 25-30 ml ekleyin. Orta büyük bir hacmi içeren bu plakaları, hemen sonra embriyo yıkamak için kullanılacaktıramniyotik kese (adımları 4.7 ve 4.8) kaldırılması. </li><li> Laboratuvar Hayvanları Humane Bakımı ve Kullanımı Halk Sağlığı Hizmetleri Politikası&#39;na uygun olarak ve kurumsal olarak onaylanmış hayvan bakım altında CO 2 tarafından bir E17 zamanlı gebe sıçan Euthanize ve protokolünü kullanır. </li><li> % 70 EtOH ile alt karın püskürtün ve rahim ve embriyoların açığa bir makas ile deri ve kas yoluyla mediale kesti. </li><li> Bütün fetuslarda çıkarın ve soğuk diseksiyon orta (25-30 ml, adım 4.3 &#39;e bakınız) aşırı içeren steril 100 mm tabağına yerleştirin. </li><li> Amniyotik kese makas küçük bir çifti kullanılarak embriyo kesin ve soğuk diseksiyon orta içeren ikinci 100 mm tabağına yerleştirin. </li><li> 5-10 saniye hafifçe eğerek 100 mm çanak ile oda sıcaklığında embriyoların yıkayın. Daha sonra, diseksiyon orta içeren üçüncü 100 mm çanak Durulanmış embryo transfer. Aşırı orta İki yıkama genellikle kan tüm izlerini silmek için yeterlidir. Bununla birlikte, eğer imalatıaçıklı, soğuk diseksiyon orta 25-30 ml içeren taze bir 100 mm çanak ile bir kez daha yıkayın. </li><li> Stereomikroskopta ve kavisli bir forseps kullanarak, deri ve kafatası çekerek her rat embriyo beyni ayıklayın. Soğuk Hazırda E. ile 60 mm yemekleri (genellikle, tabağı başına en fazla 5 beyinleri ile) buz üzerinde bu plakalar tutun birinde bütün beyin yerleştirin. </li><li> Seferinde bir çanak alın ve bir mikroskop altında, hemisfer ayırmak ve orta beyin ve meninks çıkarmadan serebral korteks izole. </li><li> İsteğe Bağlı: orta hat boyunca kesme beyinleri, hipokampi ayıklamak ve hipokampal nöronlar yalıtmak için aşağıdaki prosedürü izleyin. </li><li> Tüm diseksiyonlar tamamlanıncaya kadar buz üzerinde serebral korteks bırakın soğuk Hazırda E. 13 ml içeren 15 ml berrak konik tüp tüm diseke korteksleri toplayın. Kendi küçük boyutları nedeniyle, disseke hipokampi yerine 15 ml tüp bir 1.5 ml Eppendorf tüp toplanabilir. Ya da bu adım korteksleri az, eğer istenirsehipokampi 1 ml&#39;lik bir şişe içinde cryotube yerleştirilebilir hazırda E + 2 +% B27 gentamisin (50 ug / ml) 2-4 korteksleri veya şişe başına 2-4 hipokampi oranında + Fungizone (250 ng / ml). Beyin dokusu kadar bir hafta (daha sonraki dönemlerde henüz test edilen değil) için karanlıkta 4 ° C&#39;de saklanabilir. Gerektiğinde, Hazırda E içeren 15 ml tüp için beyin dokusu aktarmak ve daha sonra nöronlar yalıtmak için aşağıdaki protokolü takip ince pens kullanın. </li><li> Bir doku kültürü kaput tüp aktarın. Korteksleri tüpün dibe sonra dikkatlice süpernatant kaldırmak için izin verin. </li><li> , 15 ml konik tüp taze Hazırda E 13 ml ekleyin korteksleri tüpün dibe çöktüğünden izin ve dikkatli supernatant çıkarın. Bu adım 2 kez daha tekrarlayın ve son yıkamadan sonra, özenle tüm medya çıkarın. </li><li> Sıcak Tr; enzimatik 1-2 ml (hipokampi izolasyonu için daha az kullanın korteksleri sayısına bağlı olarak) ekleyerek serebral korteks sindirmekypLE Express. Parafilm ile tüp kap kapatır ve 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de su banyosu içinde tüp yüzer. </li><li> Kap açılmadan önce% 70 etanol ile tüp püskürtmek ve korteksleri borusunun alt kısmında yerleşir ve süpernatan kaldırmak için izin hazırda E. 10 ml ilave edilir. Bu adım TrypLE Express yıkanmaya üç kez tekrarlayın. Son adım olarak, dikkatle tüm medya çıkarın. </li><li> Yavaşça (4-5 kez) bir yangın-parlatılmış cam Pasteur (çapı yaklaşık 1 mm) kullanılarak Neurobasal/B27 tam medyum 2 ml korteksleri öğütmek. Kabarcıkları önlemek için dikkatli olun. </li><li> Çapında küçük bir steril cam Pasteur pipeti (yani çapı 1/2-3/4 mm pipet) ile başka bir 4-5 kez tekrarlayın. Bir Pasteur pipeti bu küçük kullanmayın veya hücreleri yok edecek. </li><li> Yerleşmek için (eğer varsa, genellikle çok az) doku kalan parçaları izin verin. </li><li> Doku parçaları yerleşmiş bırakarak, yeni bir 15-ml tüpüne üst tek bir hücre süspansiyonu transfer edin. KürkNeurobasal/B27 tam orta 10-12 ml hücre süspansiyonu kadar sulandırmak incele. </li><li> İyice karıştırın ve bir 1.5 ml Eppendorf tüp 50x Sayma Çözüm (Tablo III) 490 ul hücre süspansiyonu 10 ul ekleyerek sayım için hücre seyreltik. </li><li> 5.0 x 10 4 / cm 2 arasında derişimde PDL-kaplı levhalar üzerine plakası hücreleri. Nucleofection yapılmasını mümkün olmaması durumunda, daha yüksek bir konsantrasyonu (8-10 x 10 4 / cm 2) de hücrelerin kaplama önermektedir. </li><li> Yaklaşık 13 x 10 6 nöronların her E17 fetus türetilen Normal olarak, biz, Deneme başına 9-10 fetus incelemek. Daha fazla embriyoların gerekirse, tüm prosedürü iki saatten fazla sürecek olmadığından emin olun. </li><li> Eğer istenirse, 24 saat sonra izole, sitosin-β-D-arabinofuranoside (AraC) 10 uM glial proliferasyonu önlemek amacıyla, her bir çanak eklenebilir. Neurobasal/B27 orta glial proliferasyonu inhibe Bununla birlikte, bu adım gerekli değildirGibi üreticinin önerilerine (Invitrogen / Gibco). </li><li> Kesin zaman istenen türev aşaması bağlı olmasına rağmen, nöronlar, in vitro olarak 4-5 gün sonra deneyler için kullanılabilir. Biz hayatta önemli bir azalma (Şekil 1) olmadan 4 hafta için kültürlü nöronlar var. </li><li> Genişletilmiş kültür için, taze hazırlanmış Neurobasal/B27 tam orta her hafta kültür ortamı değiştirin. </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Cam haznesi slaytlar nöronlar üzerinde kültive immünsitokimya tabi tutulabilir. Şekil 1 kültüründe beş gün sonra sabit ve nöronal işlemleri gösteren anti-MAP-2 antikoru ile immunolabeled bir kortikal nöron tipik bir görüntüsü gösterilmektedir. Şekil 2 kültüründe 3 hafta sonra bir sıçan hipokampal nöron bir temsilcisi görüntüsünü gösterir. Tamamen farklılaşmış hücre nöronal morfoloji MAP-2 tarafından vurgulanır immunolabeling (MAP-2 nöronal belirteç, fare monoklonal antikor klonunun AP-20, Gene Tex, Irvine, CA), daha önce tarif edildiği gibi 1 standart bir prosedür izlenerek,. Görüntüleri EXi aqua kamera (Qimaging), motorlu Z ekseni ve SlideBook5 kazanım / Dekonvolüsyonun yazılımı (Akıllı Görüntüleme Yenilikler, Inc, Denver, CO) ile donatılmış Nikon Eclipse E400 dik floresans mikroskobu ile görüntülenmiştir. Her bir resmin üç boyutlu görüntüleri bir dizi birini iki boyutlu resme deconvoluted ve çözünürlüğü artırmak için yakın maksimal yoğunluğu sinyali kesme ayarlayarak çözüldü. Şekil 3 nöronal kültürlerin saflığı gösterir. Protein lizatları DIV7 sıçan nöronal kültürlerin (ctx) gelen ve insan glioblastoma (GBM) bir durumda elde edilmiştir. Beklenildiği gibi, nöronal lizat nöronal protein MAP-2 ve astrositik işaretleyici GFAP negatif için güçlü bir şekilde pozitif olduğu; GBM proteini lizat negatif f ikenya GFAP MAP-2 ve pozitif. Bizim protokol biz orta diseksiyon ve durulama olarak yıllarca Hazırda E kullanarak rağmen, son zamanlarda biz daha fazla kullanmak için beyin dokuları korumak için ek bir ve çok pratik kullanım incelemiş bulunuyoruz. Şekil 4 in vitro 5 (DIV5) bir gün göstermektedir embriyosu kendi orijinal Diseksiyon sonra hazırda E + B27 in bir hafta süreyle 4 ° C de muhafaza korteksleri izole sıçan kortikal nöronların kültürü. Nöronlar daha önce tarif edildiği gibi PDL ve laminin ile kaplanmış bir cam iki bölmeli kayar üzerine ekildi. Elde edilen görüntü SlideBook5 toplama / yukarıda tarif edildiği gibi Dekonvolüsyonun yazılımı (Şekil 2) kullanılarak deconvoluted edildi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3965/3965fig1.jpg" /> Şekil 1. PmaxGFP (Amaxa, Lonza, Walkersville, MD) ile nucleofected ve MAP ile immunolabeled bir kortikal nöron Temsilcisi görüntü-2 Antikor, kırmızı. Orijinal büyütme 100x. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3965/3965fig2.jpg" /> Şekil 2. Kültür 3 hafta sonra hipokampal nöronların, kırmızı, MAP-2 immün gösteren Temsilcisi görüntü. DAPI boyama, mavi, hücre çekirdeği gösterir. Orijinal büyütme 40x. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3965/3965fig3.jpg" /> Nöronal hücre kültürlerinin saflığı gösteren Şekil 3. Western blot. Sıçan ve insan nöronal protein GBM lizatlarının 30 ug elektroforez ile ayrılmış ve standart prosedürler takip 1 Western blot analizi tabi tutuldu. Anti-MAP-2 Hücre Sinyalleşme (Danvers, MA) ile bir tavşan poliklonal olarak, anti-GFAP antikoru Chemicon (Millipore, Billerica, MA) ile bir fare monoklonal, ve fare monoklonal antikoru, anti-Grb2 BD Transduction Laboratories (yapıldı Sparks, MD). Grb2 bir yükleme kontrol olarak kullanılmıştır. </p&gt; <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3965/3965fig4.jpg" /> Şekil 4. Temsilcisi in vitro 5 gün resimleri (DIV5) sol korteks elde edilen sıçan kortikal nöronların Hazırda E onların diseksiyonu sonrası bir hafta boyunca, 4 ° C + B27. Bir cam çift odacıklı slayt kültüre nöronlar A) Faz kontrast. Orijinal büyütme 20X. B) İmmünofloresan yeşil, nöronal süreçleri MAP-2 ekspresyonu gösteren; kültür astrositik işaretleyici GFAP negatif idi. DAPI boyama, mavi, hücre çekirdeği gösterir. Orijinal büyütme 40x.

<ol><li>Aprea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin-mediated+binding+of+human+immunodeficiency+virus-1+Tat+to+the+cytoskeleton+causes+proteasomal-dependent+degradation+of+microtubule-associated+protein+2+and+neuronal+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tubulin-mediated binding of human immunodeficiency virus-1 Tat to the cytoskeleton causes proteasomal-dependent degradation of microtubule-associated protein 2 and neuronal damage.</a> J. Neurosci. 26, 4054-4062 (2006).</li>
<li>Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+culture+of+rat+post-natal+and+fetal+brainstem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Dev.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Serum-free culture of rat post-natal and fetal brainstem neurons.</a> Brain Res. Dev. Brain Res. 120, 199-210 (2000).</li>
<li>Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+serum-free+culture+of+late+fetal+and+early+postnatal+rat+brainstem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Method for serum-free culture of late fetal and early postnatal rat brainstem neurons.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 6, 91-99 (2001).</li>
<li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+B27%2Fneurobasal+medium+supports+differentiated+growth+of+neurons+from+the+striatum%2C+substantia+nigra%2C+septum%2C+cerebral+cortex%2C+cerebellum%2C+and+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.</a> J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+nerve+cells%22">Culturing nerve cells</a>. , The MIT Press. Cambridge. (1998).</li>
<li>Eletto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+SNAP25+expression+by+HIV-1+Tat+involves+the+activity+of+mir-128a%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of SNAP25 expression by HIV-1 Tat involves the activity of mir-128a.</a> J. Cell Physiol. 216, 764-770 (2008).</li>
<li>Gualco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGF-IR-dependent+expression+of+Survivin+is+required+for+T-antigen-mediated+protection+from+apoptosis+and+proliferation+of+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">IGF-IR-dependent expression of Survivin is required for T-antigen-mediated protection from apoptosis and proliferation of neural progenitors.</a> Cell Death Differ. 17, 439-451 (2010).</li>
<li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+differentiation+of+adult+neuronal+progenitor+cells+transplanted+to+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cells transplanted to the adult brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 11879-11883 (1995).</li>
<li>Keyser, D. O., Pellmar, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+transmission+in+the+hippocampus%3A+critical+role+for+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Synaptic transmission in the hippocampus: critical role for glial cells.</a> Glia. 10, 237-243 (1994).</li>
<li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 (1997).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Rat hipokampal ve kortikal nöronların diseksiyon ve kültür yöntemi burada açıklanan kimyasal olarak tanımlanmış bir orta (Şekil 3) yetiştirilen yaklaşık saf nöronal kültürlerin kullanıldığı deneyler sağlar. Serumsuz medya kültürü neredeyse saf nöronlar için protokolleri daha önce 2,3,4 tanımlanmış olmasına karşın, bizim yöntem yapılan önemli değişiklikler vardır. Geleneksel protokolleri farklı (yani Banker ve ark.) 5, biz TrypLE Express, daha nazik bir ayrışma enzimi ile tripsin ye...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Konsantrasyon </td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> % 98 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> % 2 </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 0.5 mM </td></tr></tbody></table> Tablo I. Neurobasal/B27 tam medyum. <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Konsantrasyon </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> 16 mM </td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> 22 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 160 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> KH 2 PO 2 </td><td> 0,22 mM </td></tr><tr><td> Gentamisin </td><td> 50 mcg / ml </td></tr&gt; <tr><td> Fungizone </td><td> 250 ng / ml </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td> Osmolarite </td><td> 320-330 mOsm </td></tr></tbody></table> Tablo II. Diseksiyon orta. <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Hacim (ul) </td></tr><tr><td> Neurobasal/B27 tam medyum </td><td> 240 </td></tr><tr><td> Tripan Mavi% 0.4 Leke </td><td> 250 </td></tr><tr><td> Toplam </td><td> 490 </td></tr></tbody></table> Tablo III. Çözüm Sayma 50x. <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Şirket </td><td> Cat. numara </td></tr><tr><td> Hazırda D </td><td> Brainbits </td><td> 767171 </td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> Gentamisin sülfat </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1264 </td></tr><tr><td> Glutamax 200 mM </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> TrypLE Express w / o fenol kırmızısı </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 12604 </td></tr><tr><td> Sitosin-β-D-arabinofuranoside hidroklorür </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C6645 </td></tr><tr><td> Poli-D-Lizin </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminin 1 mg / ml </td><td> Millipore </td><td> CC095 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma Aldrich </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> Tripan Mavi% 0.4 Leke </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 15250 </td></tr></tbody></table&gt; Tablo IV. Özel reaktifler. <table border="1"><tbody><tr><td> Ekipman </td><td> Şirket </td><td> Cat. numara </td></tr><tr><td> Stereo Mikroskop </td><td> Olympus </td><td> SZ61 </td></tr><tr><td> Büyük Forseps </td><td> FST </td><td> 11022-14 </td></tr><tr><td> İnce uçlu bir pens </td><td> Moria </td><td> MC40B </td></tr><tr><td> Mikro ince uçlu pens </td><td> Moria </td><td> MC31 </td></tr><tr><td> Keskin makaslar </td><td> Roboz </td><td> RS-6820 </td></tr><tr><td> Mikro Kesme makas </td><td> FST </td><td> 91460-11 </td></tr><tr><td> Mikro Eğri makas Dissecting </td><td> FST </td><td> 14067-11 </td></tr><tr><td> Cam 2 odacıklı slaytlar </td><td> Lab-Tek </td><td> 154461 </td></tr><tr><td> 60 mm yemekleri </td&gt; <td> BD Falcon </td><td> 353002 </td></tr><tr><td> 100 mm yemekleri </td><td> Corning </td><td> 430167 </td></tr><tr><td> 15 ml&#39;lik tüplere </td><td> BD Falcon </td><td> 352099 </td></tr><tr><td> 1.5 ml cryo tüp flakon </td><td> Nunc </td><td> 375353 </td></tr></tbody></table> Tablo V. Spesifik ekipmanlar.

sıçan embriyonik nöral hücre İzolasyonu ve kültür: bir hızlı protokol

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

Biz E15-17 rat embriyoları hipokampal veya kortikal nöronların ayırmak ve kültür için hızlı bir yöntem tarif edilir. Prosedürü fare ve insan birincil nöronlar ve sinir progenitörlerin izolasyonu başarıyla uygulanabilir. Ayrışmış nöronlar ila birkaç hafta serum içermeyen aracı madde içinde muhafaza edilir. Bu kültürler nucleofection, immünsitokimya, nükleik asit hazırlanması yanı sıra elektrofizyoloji için de kullanılabilir. Büyük nöronal kültürler da iyi bir verim lentiviral transdüksiyonu ile oranı ve daha az etkin bir şekilde, kalsiyum fosfat ya da bu gibi lipid lipofektamin bazlı yöntem ile transfekte edilebilir.

Biz kemirgen embriyolardan hipokampal ve kortikal nöronlar yalıtmak ve kültürüne hızlı bir metodoloji tanıtılmıştır. Bu protokol bize neredeyse saf nöronal kültürlerin gerekli olduğu deneyler yapmasına imkan tanıyor.

Sıçan Embriyonik Nöral Hücre İzolasyonu ve Kültür: Bir Hızlı Protokol

E15-17 sıçan embriyolarından hipokampal veya kortikal nöronların dissosiye edilmesi ve kültüre edilmesi için hızlı bir yöntemi tanımlıyoruz. Bu prosedür ... şeklinde uygulanabilir.

Bu prosedürün genel amacı, kortikal veya hipokampal nöronları serumsuz koşullarda izole etmek ve kültüre etmektir. Bu işlem, öncelikle korteksleri veya hipokampusları elde etmek için sıçan embriyolarının diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, beyin dokusunun nazik bir enzimatik sindirim için TrypLE Express ile inkübe edilmesidir.Ardından, dokular hibernate E ile durulanacak ve komplet kültür ortamı içerisinde mekanik olarak tritüre edilecektir. Tek hücre süspansiyonu elde etmek için son adım, disosiye edilen nöronların sayılması ve poli-D-lizin kaplı kaplara veya poli-D-lizin ve laminin kaplı cam lamlara ekilmesidir. Nihayetinde bu yöntem, nöronların serumsuz koşullarda ve glial destek olmaksızın izolasyonuna ve kültürlenmesine olanak tanır.Nöronal kültürler; immünokimya, nükleik asit preparasyonları ve elektrofizyoloji için kullanılabilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tripsin yerine daha yumuşak bir enzim kullanmış olmamızdır. Enzimatik sindirim öncesindeki doku işlemelerini ve DNase tedavisini devre dışı bıraktık.Ayrıca, diseke edilen korteks veya hipokampus, disosiyasyon işleminden önce dört derece sıcaklıkta hibernasyon medyumunda bir haftaya ka

isolation-and-culture-of-rat-embryonic-neural-cells-a-quick-protocol

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Omurilik fare embriyonik motor nöronlar izole alternatif bir yol tarif edilir. Bu yöntem, lektin düşük afinite sinir büyüme faktörü reseptör p75NTR bağlamak için aslında dikkate alır. Bu lektin tabanlı preplating p75NTR karşı spesifik antikor ile benzer bir arınma sağlar.

Fare Embriyonik motor nöronlar lektin tabanlı İzolasyon ve Kültür

Nöral tüpten embriyonik nöral krest izolasyonu kullanımını...

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

Bu video, yetişkin sıçanlarda omuriliğin periventriküler dokusundan nöral kök/progenitör hücreleri izole etmek için bir yöntem sunar. Teknik, hücre dışı matrisi bozmak ve hücreleri serbest bırakmak için doku parçalarının proteolitik enzimler içeren bir çözelti içinde inkübe edilmesini içerir. Daha sonra, salınan hücreler, nöral kök / progenitör proliferasyonunu artıran ve üç boyutlu nörosferlere agregasyonu teşvik eden spesifik büyüme faktörleri içeren bir ortamda kaplanır.

Erişkin Bir Sıçanın Omurilik Periventriküler Bölgesinden Nöral Kök Progenitör Hücrelerin İzolasyonu

Video, fare embriyolarının orta beyninden dopamin nöronlarını izole etme ve kültürleme sürecini göstermektedir. İzole edilmiş ventral orta beyin tabanları enzimler kullanılarak ayrıştırılır. Elde edilen dopamin nöronları toplanır ve çok kuyulu plakalar içindeki mikro adalara aktarılır. Hücreler, mikro adaların içinde yüksek yoğunlukta tutmak için bir dopamin nöron ortamı ile inkübe edilir.

Primer Embriyonik Fare Orta Beyin Dopamin Nöronlarının İzolasyonu ve Kültürü

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler), birincil kortikal nöronlardan ve astrositlerden türetilen nöronlardan oluşan bir ko-kültür sistemi oluşturmak için bir protokol tanımlanmıştır. Bu ko-kültür sistemi, yeni, iPSC'den türetilmiş nöronlar ve channelrhodopsin-2'yi eksprese eden önceden var olan kortikal nöronlar arasında sinaptik kontakların ve devrelerin oluşumunun tespit edilmesini sağlar.

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Yetişkin memeli omuriliği, kültürde izole edilebilen ve genişletilebilen nöral kök/progenitör hücreler (NSPC'ler) içerir. Bu protokol, erişkin omuriliğinin periventriküler bölgesinden sıçandan ve insan organ nakli donörlerinden üretilen NSPC'lerin toplanmasını, izolasyonunu, kültürünü ve geçişini açıklar.

Periventriküler Yetişkin Rat Bölgesinde ve İnsan Omurilik gelen Nöral Kök / Progenitör Hücreler izolasyonu

Biz değiştirmek ve uyarıcı kortikal nöronların 12 içine insan kaynaklı pluripotent Kök Hücre (hiPSCs) arasında hızlı, tekrarlanabilir ve verimli farklılaşma anlatan bir önceden yayınlanmış protokolü uygulamak. Özellikle, modifikasyon ağ düzeyinde elektrofizyolojik özelliklerini ölçmek için, mikro-elektrot dizileri üzerinde nöronal hücre yoğunluğu ve kullanım kontrol edilmesini sağlar.

Mikro-elektrot dizileri Ağ Aktivite Ölçüm uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Rapid Nöronal Farklılaşma

Burada, E13 fare embriyo ganglionic itibar bir roman mikrocerrahi teknik nöral kök hücrelerin izolasyonu için tanıtmak.

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Burada bir iletişim kuralı için Ca2 + sinyaller hücre altı çözünürlükte diseksiyon sağlayan Ca2 + düşsel nöronlar ve gliyal hücreler, mevcut. Bu işleme genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri ifade izin tüm hücre tipleri için geçerlidir.

Yerel Ca2 + sinyalleri membran hedefli Ca2 + göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon

Burada, nöron ve astrositle zenginleştirilmiş kültürlerin veya embriyonik korteksten nöron-glia kültürlerin kurulmasını sağlayan, yüksek verim ve tekrarlanabilirlik ile özel kültür ortamı nı kullanarak basit bir yaklaşım salıyoruz.

İskemide Nöron-Glia Etkileşimlerinin Rolünü Nörade İncelemek İçin Hücre Kültürü Modeli

Kullanıma hazır dondurulmuş bir nöron stoğu, sinaptik fonksiyonları değerlendirmek için güçlü bir araçtır. Burada, 96 delikli bir plaka kullanarak dondurulmuş stoktan kolay, düşük yoğunluklu bir birincil kültürü tanıtıyoruz.

Embriyonik Hipokampal Nöronların Dondurulmuş Stoğunu Kullanarak Kolay ve Tekrarlanabilir Düşük Yoğunluklu Birincil Kültür

Öğrenin sıçan embriyolarından hipokampal ve kortikal nöron izolasyonu için hızlı bir protokol. Bu yöntem, serum içermeyen koşullarda neredeyse saf nöronal kültürler elde etmeyi sağlar.

Sıçan Embriyonik Nöral Hücre İzolasyonu ve Kültür: Bir Hızlı Protokol

Daha fazla video keşfet