Name: Protein Katlama Öğrenmenin mikroakışkan Mikserler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Öğrenin, mikroakışkan mikserlerle protein katlanma dinamiklerini yaklaşık 8 mikrosaniyede karıştırarak biyokimyasal reaksiyonları incelemeyi. Bu yöntem, konfokal floresan mikroskobisi ve FRET ile erken katlanma olaylarını yakalamanızı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı fibr (NSF EF-0.623.664) ve IDBR (NSF DBI-0.754.570) tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma kısmen Kooperatif Anlaşması PHY 0120999 altında Kaliforniya Üniversitesi, Davis tarafından yönetilen Biophotonics, bir NSF Bilim ve Teknoloji Merkezi Merkezi tarafından yönetilen Ulusal Bilim Vakfı fibr Hibe 0623664, fon tarafından desteklenmiştir. Lisa Lapidus, doktora ve araştırma Burroughs Hoşgeldiniz Fonundan Bilimsel Arayüz bir Kariyer Ödülü kısmen desteklenmektedir.

<ol><li>Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+kinetics+and+mechanisms+in+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Fast kinetics and mechanisms in protein folding.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 327-359 (2000).</li>
<li>Hertzog, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtomole+mixer+for+microsecond+kinetic+studies+of+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Femtomole mixer for microsecond kinetic studies of protein folding.</a> Analytical Chemistry. 76, 7169-7178 (2004).</li>
<li>Hertzog, D. E., Ivorra, B., Mohammadi, B., Bakajin, O., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+microfluidic+mixer+for+studying+protein+folding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of a microfluidic mixer for studying protein folding kinetics.</a> Analytical Chemistry. 78, 4299-4306 (2006).</li>
<li>Yao, S., Bakajin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+in+Mixing+Time+and+Mixing+Uniformity+in+Devices+Designed+for+Studies+of+Protein+Folding+Kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Improvements in Mixing Time and Mixing Uniformity in Devices Designed for Studies of Protein Folding Kinetics.</a> Analytical Chemistry. 79, 5753-5759 (2007).</li>
<li>Lapidus, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Hydrophobic+Collapse+and+Early+Folding+Steps+Observed+in+a+Microfluidic+Mixer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Protein Hydrophobic Collapse and Early Folding Steps Observed in a Microfluidic Mixer.</a> Biophysical Journal. 93, 218-224 (2007).</li>
<li>Bilsel, O., Kayatekin, C., Wallace, L. A., Matthews, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microchannel+solution+mixer+for+studying+microsecond+protein+folding+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">A microchannel solution mixer for studying microsecond protein folding reactions.</a> Review of Scientific Instruments. 76, (2005).</li>
<li>Chan, C. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submillisecond+protein+folding+kinetics+studied+by+ultrarapid+mixing%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Submillisecond protein folding kinetics studied by ultrarapid mixing.</a> PNAS. 94, 1779-1784 (1997).</li>
<li>Shastry, M. C. R., Luck, S. D., Roder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous-flow+capillary+mixing+method+to+monitor+reactions+on+the+microsecond+time+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A continuous-flow capillary mixing method to monitor reactions on the microsecond time scale.</a> Biophysical Journal. 74, 2714-2721 (1998).</li>
<li>Pollack, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compactness+of+the+denatured+state+of+a+fast-folding+protein+measured+by+submillisecond+small-angle+x-ray+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Compactness of the denatured state of a fast-folding protein measured by submillisecond small-angle x-ray scattering.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10115-10117 (1999).</li>
<li>Takahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+cytochrome+c+initiated+by+submillisecond+mixing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Folding of cytochrome c initiated by submillisecond mixing.</a> Nature Structural Molecular Biology. 4, 44-50 (1997).</li>
<li>Knight, J. B., Vishwanath, A., Brody, J. P., Austin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+focusing+on+a+silicon+chip%3A+Mixing+nanoliters+in+microseconds%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic focusing on a silicon chip: Mixing nanoliters in microseconds.</a> Physical Review Letters. 80, 3863-3866 (1998).</li>
<li>DeCamp, S. J., Naganathan, A. N., Waldauer, S. A., Bakajin, O., Lapidus, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Observation+of+Downhill+Folding+of+lambda-Repressor+in+a+Microfluidic+Mixer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Direct Observation of Downhill Folding of lambda-Repressor in a Microfluidic Mixer.</a> Biophysical Journal. 97, 1772-1777 (2009).</li>
<li>Waldauer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruggedness+in+the+folding+landscape+of+protein+L%5BTitle%5D)+AND+%22Hfsp+Journal%22%5BJournal%5D)">Ruggedness in the folding landscape of protein L.</a> Hfsp Journal. 2, 388-395 (2008).</li>
<li>Shastry, M. C. R., Roder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+barrier-limited+protein+folding+kinetics+on+the+microsecond+time+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence for barrier-limited protein folding kinetics on the microsecond time scale.</a> Nature Structural Biology. 5, 385-392 (1998).</li>
<li>Uzawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapse+and+search+dynamics+of+apomyoglobin+folding+revealed+by+submillisecond+observations+of+alpha-helical+content+and+compactness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Collapse and search dynamics of apomyoglobin folding revealed by submillisecond observations of alpha-helical content and compactness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1171-1176 (2004).</li>
<li>Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+Multiple+Folding+Pathways+for+the+Villin+Headpiece+Subdomain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Evidence of Multiple Folding Pathways for the Villin Headpiece Subdomain.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 115, 12632-12637 (2011).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Uzun biyomoleküllerin moleküler süreçlerin, piko saniye kadar zaman ölçeğindeki meydana geldiği kabul edilmiştir, çünkü Hızlı karıştırma yıllarca protein katlanması alan için bir gelişme hedefi olmuştur. Konvansiyonel durdu-akış karıştırıcılar başta türbülans ile sınırlıdır 1-5 ms ölü zamanları vardır. 30-300 ms&#39;den karıştırma süreleri ile Çalkantılı sürekli akış mikserler gruba az sayıda son 15 yılda geliştirilen ancak genellikle bu karıştırma süreleri elde etmek için yüksek debi gerektiren ve bu nedenle örnek 6-8 çok kullanmaya başlamıştır. Bu protokol laminer akış rejimindeki hızlı seyreltme ulaşmak için mikroakışkan karıştırma fiş kullanımı anlatılmaktadır. Orada bu rejim içinde çalışan birden çok avantajı vardır, ancak birincil bir bir karıştırma yanıt değiştirmenize olanak veren yüksek hassasiyet ile tüm karıştırma işlemi taklit yeteneğidir. Basit geom ile diğer gruplar tarafından geliştirilen T-mikserleretries öncelikle kanal 9-10 büyüklüğü ile sınırlı kaldı 100-200 ms&#39;den karıştırma kez gösterilmiştir. 10 mikron Knight kanallarının boyutunu ölçekleme By ~ 10 ms&#39;dan 11 karıştırma süresi azalır. Yao ve Bakajin geometri küçük değişiklikler karıştırma süresi 4 önemli gelişmelere yol açabileceğini gösterdi. Bununla birlikte, bu çalışma karıştırma olduğu ivme zamanda da yavaş fazlar yol açabilir gösterdi. Bu çalışmada 12-13 kullanılan tasarım denaturant konsantrasyon yavaş üstel çürüme en aza indirmek ve aynı zamanda Drie aşındırma bir özelliği daha tekrarlanabilir yapmak için referans 4&#39;te iki iyi tasarımları arasında bir uzlaşmadır. Karıştırma süresi tanımı içinde karıştırılması ultrahızlı bireylerde alanında bazı tartışmalara olmuştur. Bu &quot;karıştırma süresi&quot; ve &quot;ölü zaman&quot; arasındaki farkı fark etmek önemlidir. Ölü zaman zarfında bir ÖLÇME süre olarak çalkantılı bir mikser tanımlanırt yapılamaz ve aslında gerçek karıştırma süreden önemli ölçüde daha uzun olabilir. Bu, tipik olarak, çeşitli konsantrasyonlarda bir sahte-birinci dereceden iki moleküllü reaksiyonu (örneğin, N bromosuccinate tarafından triptofan floresans soğutmadan gibi) çeşitli ölçümler yapmak tarafından belirlenir. Gözlenen üstel çürükleri t = 0 s olarak kabul tek bir değerde yakınsama takılan ve bu noktadan ve ilk ölçülen nokta arasındaki zaman ölü bir zamanı vardır. Herhangi bir ölü zaman, sadece bir karıştırma süresi olacak şekilde laminar akış karıştırıcılar için ölçüm karıştırma işlemi sırasında yapılabilir. Karıştırma süresi gerçekte yeterli homojenlik elde edilene kadar iki çözüm birleştirme zamanı. Biz daha önce 90/10, karıştırılmamış değerinin% 10 ila% 90 azaltmak için denaturant konsantrasyonu için zaman olması karıştırma süresi belirledik. Bununla birlikte, karıştırma eğrisi şekil küçük üstel bileşenine sahip çürüme kuyruk ile mükemmel simetrik değildir. Ayrıca, protein katlanması, bir vardenaturant konsantrasyonu üzerindeki yüksek doğrusal-olmayan bir bağımlılığının katlama genellikle denaturant sadece iki misli azalır bile başlaması böylece. Bu nedenle son zamanlarda% 80 oranında denaturant konsantrasyonunu azaltmak için zaman olarak karıştırma süresi belirledik. Kuşkusuz, diğer tanımları deney gereksinimlerine bağlı olarak kullanılabilir. Protein katlanması incelemek için bu mikser kullanımı sürekli şaşırtıcı sonuçlar ortaya koymuştur. Uzun sürekli akış mikserler ile çoklu katlama adımları ve erken sonuçlar almaya çalışılmıştır sitokrom c ve apomyoglobin katlanması ~ 100 s ölçeğinde 10,14-15 oluşmasına çöküşü gösterdi. Bu mikser ile yaptığımız ölçümler (olarak daha yavaş bir faz takip Mikserin karıştırma süre içinde, çok hızlı, muhtemelen spesifik olmayan, çökmek (as Trp floresans spektral vardiya ile ölçülen) bu ölçeğinde en az 2 adım olacaksa gösterdi ) toplam Trp emisyon soğutma ile ölçülen olasılıkla fdoğal yapısı 5 IRST oluşumu. Ayrıca, bu proteinin, bir 2-klasörün 13 durumu olduğu geleneksel yorumlama iptali için, protein, L B1 alanı içinde bir 50 μs işlemi araştırmacılar tarafından gözlenmiştir. Bu hızlı bir mikser bir avantajı, genellikle sadece nanosaniye T-atlama araçlar ile ölçülebilir olmuştur hızlı katlama proteinlerin katlama yoklamak olmasıdır. T-atlama genellikle katlama / protein erime sıcaklığına yakın rahatlama açılması ve bu nedenle bütün nüfusun katlanması aşağıdaki asla gözlem gerektirir. Bu mikser ile biz Trp toplam emisyon ve spektral vardiya her ikisi ile γ-repressör katlama (λ 6-86) baktım ve protein önceki T tarafından erişilebilir olmadığını güçlü katlama koşullarda katlama için hiçbir engel olmadığını kanıtlar buldular ölçümleri 12-atlamak. Son olarak, bir t villin başlık HP-35 ile katlama ölçülenO hızlı klasörleri henüz ölçülür ve karıştırma sonra ölçülen katlama oranı aynı şartlar altında 16 T-atlama ile ölçülen daha ~ 5 kat daha yavaş olduğunu buldu. Bu katlanma kinetikleri alanda büyük bir varsayımı devrilmesiydi başlangıç ​​şartlarına bağlı olduğunu göstermektedir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> AZ P4110 rezist </td><td> AZ Elektronik Malzemeler </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AZ 400 K Geliştirici </td><td> AZ Elektronik Malzemeler </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Baker PRS 2000 fotorezist striptizci </td><td> Avantor Performans Malzemeleri </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AquaBond </td><td> AquaBond Teknolojileri </td><td> AquaBond 55 </td><td></td></tr><tr><td> 500 mikron kapak gofret </td><td> SENSÖR Hazırlık Hizmetler </td><td></td><td> Ø: 100 mm ± 0.5 mm Kalınlık: 0.5 mm ± 0.025 mm Standart Toleranslar (Kaydetti sürece) Yüzey: SI: 4-8A; SII: 8-12a Daire: Bir İlköğretim YARI-STD; Bir Scribe Temiz ve Parlak, Her İki Tarafa </td></tr><tr><td> 170 mikron kapak gofret </td><td> SENSÖR Hazırlık Hizmetler </td><td> 7980 2G Gofret </td><td> Ø: 100 mm ± 0.5 mm Kalınlık: 0.17 mm ± 0.025 mm Standart Toleranslar (Kaydetti sürece) Yüzey: SI: 4-8A; SII: 8-12a Daire: Bir İlköğretim YARI-STD; Bir Scribe Temiz ve Parlak, Her İki Tarafa </td></tr><tr><td> Oksitler için derin reaktif iyon yakıcısı </td><td> ULVAC </td><td> ULVAC NL-6000 </td><td></td></tr><tr><td> Argon Lazer İyon </td><td> Cambridge Lazer Laboratuvarları </td><td> LEXEL 95-SHG </td><td> λ = 258 nm </td></tr><tr><td> Argon Lazer İyon </td><td> Melles Griot </td><td></td><td> λ = 488 nm </td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Olympus </td><td> IX-51</td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Amaç </td><td> Thor Labs </td><td> OFR LMU-40X-UVB 0.5 NA </td><td> λ = 258 nm </td></tr><tr><td> Mikroskop Amaç </td><td> Olympus </td><td> UPLSAPO 60XW 1,2 NA </td><td> λ = 488 nm </td></tr><tr><td> Nanopositioner </td><td> Mad City Labs </td><td> Nano-LP100 </td><td></td></tr><tr><td> Motorlu Çeviri Sahne </td><td> Semprex Corp </td><td> KL-12-6436 Serisi </td><td></td></tr><tr><td> GaAsP Foton Sayaç </td><td> Hamamatsu </td><td> H7421-40 </td><td></td></tr><tr><td> Monochrometer </td><td> Horiba Instruments Inc </td><td> MicroHR </td><td></td></tr><tr><td> CCD kamera </td><td> Andor Teknoloji </td><td> idus 420A-BU </td><td></td></tr><tr><td> Guanidin hidroklorür (GuHCl) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td&gt; G4505 </td><td></td></tr></tbody></table>

protein katlama Öğrenmenin mikroakışkan mikserler

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Kendi doğal yapısındaki bir proteini kıvrımlar biyoloji ve insan sağlığı hala henüz tam olarak anlaşılamamıştır oldukça alakalı olan süreçtir. Bunun bir nedeni, bu katlama protein 1 bağlı olarak, nanosaniye ile saniye ya da daha fazla, süresini çok geniş bir aralık içinde yer alan bir. Konvansiyonel durdu-akış mikserler katlama kinetik ölçümü yaklaşık 1 ms başlayan sağladı. Biz son zamanlarda ~ 8 μs 2 denaturant ~ 100 kat sulandırır bir mikroakışkan karıştırıcı geliştirdik. Durmuş bir akış mikser aksine, bu mikser türbülans oluşmaz hangi laminer akış rejimi çalışır. Türbülans olmaması 3-4 deneme için mükemmel bir anlaşma ile mikser içindeki tüm akımları hassas sayısal simülasyonu sağlar. Laminar akış ≤ 100 Re Reynolds sayıları için elde edilir. Sulu çözelti, bu mikron ölçeğinde geometri gerektirir. Bu tür silikon veya erimiş silikonlu yağla olarak, sert bir yüzey kullanımıca, (Bakınız Şekil 1) kanalları 5-10 mikron genişliğinde ve 10 mikron derin yapmak. Küçük boyutları, karıştırma bölgeye girişinde, boyutu 1 mikron mertebesinde vardır. Çip optik erişim için ince bir cam veya silika coverslip ile örtülmüştür. Tipik toplam doğrusal akım hızları ~ 1 m / s, akma Re ~ 10, fakat protein tüketimi sadece 0.5 ~ nL / s veya 1.8 uL / saat. Protein konsantrasyonu tespit yöntemi bağlıdır: triptofan floresans için tipik derişim 100 uM (1 Trp / protein) ve tipik konsantrasyonu ~ 100 nM&#39;dirki FRET için. Katlama işlemi 6 M 0.06 M guanidin hidroklorür denaturant hızlı seyreltme tarafından başlatılır. Yüksek denaturant bulunan protein merkezi bir kanal aşağı akar ve denaturant (bkz. Şekil 2) ~ 100 kat daha hızlı hareket ettirmeden tampon ile karıştırma bölgede iki tarafında karşılanmaktadır. Bu dar bir geometri içine proteini akışının hızlı daralma nedenjet ~ 100 nm çapında. Ağır protein moleküllerinin difüzyon çok yavaş 1 ms difüzyon az 1 mikron iken ışık denaturant moleküllerin difüzyon, çok hızlıdır. Proteini yaklaşık denaturant etkili konsantrasyonu azaltarak denaturant ve protein akışından denaturant hızlı dilüsyonu proteini sonuçların sabit bir difüzyon farkı,. Protein jet bir tarama mikroskobu konfokal 5 kullanılarak tespit edilebilir katlama sırasında protein gözlem kanalı ve floresans aşağı doğru sabit bir hızda hareket eder.

Bu çalışmada biz ~ 8 μs iki çözüm karıştırma yeteneğine sahip mikroakışkan mikser imalat ve kullanımının açıklanması. Ayrıca UV floresan ve floresan rezonans enerji transferi (FRET) kullanarak spektroskopik tespiti ile bu karıştırıcı kullanımını göstermektedir.

Protein Katlama Öğrenmenin mikroakışkan Mikserler

Bir proteinin doğal konformasyonuna katlanma süreci, biyoloji ve insan sağlığı açısından son derece önemlidir, ancak halen yeterince anlaşılamamıştır. Bunun bir nedeni...

Bu prosedürün genel amacı, mikrosaniye zaman ölçeğinde biyokimyasal bir reaksiyonu başlatmak için iki çözeltiyi hızla karıştırmaktır. Bu işlem, öncelikle bir mikroakışkan karıştırıcı imal edilerek gerçekleştirilir. İkinci adım ise kanalları mühürlemek için bir çipin bir örtü camına bağlanmasıdır.Ardından, çip, solüsyon rezervuarlarını içeren bir manifolda monte edilir. Son adım, karıştırılmış solüsyonun konfokal floresan mikroskopi ile görüntülenmesidir. Nihayetinde, çıkış kanalı boyunca katedilen mesafe zamana dönüştürülerek biyokimyasal reaksiyon mikrosaniye ölçeğinde kaydedilir.Bu tekniğin stop flow karıştırma gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, karıştırmanın türbülans ile sınırlı olmaması ve birkaç mikrosaniye içinde gerçekleşmesidir. Bu yöntem, protein katlanması alanındaki "hidrofobik çökkünme ne zaman gerçekleşir?" gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürü, laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan Ling Woo, mikroakışkan karıştırma çiplerinin imalatına başlayarak uygulamalı olarak gösterecektir.Öncelikle dört inçlik FU silika gofretleri, bu videoya eşlik eden yazılı protokolde açıklandığı şekilde taze piranha çözeltisi ile temizleyin. Ardından, nihai mikroakışkan kanalların hedeflenen her 10 mikron derinliği için yaklaşık bir mikron kalınlığında bir polisilikon kaplama uygulamak üzere düşük basınçlı kimyasal buhar biriktirme fırını kullanın. Gofretlerin metinde açıklanan ek işlemleri tamamlandıktan sonra, gofretlerin üzerine 900 nanometre kalınlığında bir Z 52 14 fotoresist tabakası spin kaplama yöntemiyle uygulayın; ardından doğrudan bir sıcak tabla üzerinde 90 °C'de bir dakika veya bir fırında 110 °C'de 30 dakika boyunca yumuşak pişirme (soft bake) işlemi gerçekleştirin.Bir foto maske hizalandıktan sonra, önce fotoresisti birkaç saniye boyunca UV ışığına maruz bırakarak sert ve vakumlu bir temas sağlayın. Ardından, yazılı protokolde belirtildiği şekilde fotoresistteki deseni geliştirin. Gofret üzerindeki özellikleri bir mikroskopla inceleyin ve doğrudan bir sıcak plaka üzerinde iki dakika boyunca 115 degrees Celsius sıcaklıkta sert pişirme işlemi uygulayın.Ardından, gofretleri Asher veya oksijen plazması ile 100 watt RF gücünde 2,5 dakika boyunca DCU işlemine tabi tutun. Derin reaktif iyon aşındırıcı kullanarak, poli silika tabakasını alttaki erimiş silikaya kadar tamamen aşındırın. Kalan fotoresist tabakasını temizleyin ve gofreti metinde belirtildiği şekilde işleyin.Aşındırma derinliğini ölçerek poli kaplamanın tamamen geçildiğinden emin olun. Oksit aşındırma kapasitesine sahip derin reaktif iyon aşındırıcı kullanarak, poli kaplama kalınlığının her mikronu başına yaklaşık 10 mikron derinliğe kadar erimiş silikayı aşındırın. Wafer'ı matrix Asher ile dört dakika boyunca 100 watt RF gücünde temizleyin ve wafer üzerine delikler açmadan önce polisilikonu bir xenon diflorür aşındırıcı ile şeritlendirin; sonraki işlemler sırasında kanalları korumak için yeni bir mikron kalınlığında fotoresist tabakasını spin coat yöntemiyle kaplayın.Ardından, gofretin özellik tarafı aşağı gelecek şekilde Aqua Bond 55 kullanılarak feda edilebilir bir cam plaka üzerine monte edin. Bağlayıcıyı kabarcıklardan uzak tutmaya özen göstererek, mikro 90 temizleme çözeltisi ile bilgisayar kontrollü elmas uçlu matkabı soğutun. Bu işlem, küçük cam parçalarının kanallara yapışmasını ve böylece kullanım sırasında çipin tıkanmasını önler.Her bir çipte giriş ve çıkış deliklerini delme işlemine geçin. Her bir deliğe şırınga ile su enjekte ederek gofretle deiyonize su ile durulama yapın. Ardından, fotoresist tabakasının kaldırılmasının ardından bir saat boyunca sabunlu suda bekletin.Metinde açıklandığı şekilde direnç ve bağlayıcı uygulayın. Gofreti deiyonize su ve ılık sabunlu su ile durulayın. Gofret üzerine azot akıttıktan sonra, aşındırılmış özelliklere dikkat ederek her bir deliği şırınga ile tekrar durulayın.120 °C'ye ayarlanmış bir vakum fırınında kurutmaya devam edin. Deliklerin kum ve benzeri partiküllerden arındırılmış olduğundan emin olmak için kontrol edin ve gerekirse temizleme adımlarını tekrarlayın. İzleyen adımlar temiz odada gerçekleştirilmelidir.Kanalların derinliğini optik veya mekanik bir yüzey profilometresi ile ölçün. Gofreti ve füzyon silika kapak camını, temiz oda içerisinde metinde açıklandığı şekilde temizleyin. Gofreti azot gazı ile en az beş dakika boyunca iyice kurulayın.Ardından, gofretin özellikli yüzeyi yukarı bakacak şekilde, küçük bir cam levha gibi sert ve düz bir yüzey üzerine yerleştirilmiş üç ila dört adet temiz oda mendilinden oluşan bir yığının üzerine koyun. Aynı işlemi lamel için de tekrarlayın. Lameli kenarından tutun ve cilalı yüzeyi gofretin üzerinde aşağı bakacak şekilde ters çevirin.Düz kenarları dikkatlice hizalayın, lamine camı wafer üzerine bırakın ve yerleşmesine izin verin; hizalamayı ayarlamak için yalnızca yatay olarak hafifçe itiniz. Wafer'ın merkezine bir parmağınızla bastırın. Bir bağlanma hattının dışarıya doğru yayılmaya başladığı görülmelidir.Gerekirse, bağlama cephesini ilerletmek için wafer'ın çevresindeki diğer konumlara ek basınç uygulayın. Mühürlenmiş wafer'lar, metinde belirtilen sıcaklık profili ile programlanmış yüksek sıcaklıklı bir fırına yerleştirildikten sonra, bir wafer kesme testeresi ile tekil çiplere bölün. Karıştırma çipini ve çözeltileri tutacak manifold; lexan veya pleksiglas gibi plastiklerden ya da alüminyumdan yapılabilir.Sıcaklık kontrolü için, çipi manifolda küçük o-ringler yardımıyla sabitleyin ve çipin merkezinin net bir optik görünümüne izin veren bir tutucu halka ile yerinde tutun. O-ring kanalları, çipe çok fazla basınç uygulamadan iyi bir eşleşme sağlamak için standarttan daha sığ olmalıdır. Çip monte edildikten sonra, kuyucukların dibinde hapsolmuş hava kabarcıklarını salmaya dikkat ederek merkez ve yan rezervuarlara çözeltileri ekleyin.Manifoldu ters bir mikroskoba yerleştirin ve karıştırma bölgesini oküler veya kamera çıkışı ile inceleyin. Manifoldun üzerine yerleştirilen akkor bir el feneri yeterli ışığı sağlayacaktır. Jeti görüntülemek için merkez kanalında bir boya veya yüksek kırılma indeksli bir çözelti kullanın.Bu karıştırıcıda kullanılan hacimler çok küçük olduğundan, akış, çözelti kuyucuklarının üzerine uygulanan hava basıncıyla kontrol edilebilir. Jeti görselleştirmek için yan kanal basıncını sıfır psi değerinden başlatın ve merkez kanal ile eşit basınca ulaşana kadar yavaşça artırın. Yan kanallardan biri tıkalıysa, jet çıkış kanalının duvarlarından birine doğru itilecektir.Görünür bir tıkanıklık oluşursa, bir şırınga ile çıkış kanalına basınç veya vakum uygulanarak giderilebilir. Eğer çip protein veya diğer organik maddeler nedeniyle tıkanırsa, gece boyunca piranha çözeltisi içinde bekleterek temizlenebilir. Mikroskobun içinde veya hemen dışında bulunan dikroik bir ayna kullanarak, kaplanmış bir lazer ışınını araştırma düzeyindeki bir mikroskoba yönlendirin.Lazer odağının okülerde veya kamerada karıştırma bölgesine yakın bir yerde görülebileceği şekilde hizalamasını yapın. Karıştırıcıdaki proteinden gelen floresans, objektif tarafından toplanır, dikroik aynadan geçirilir, bir mercek tarafından odaklanarak iğne deliğine gönderilir ve bir foton sayacı üzerinde görüntülenir. Karıştırma bölgesini görüntülemek için x ve y eksenlerinde piezoelektrik bir tarayıcı kullanarak çipi tarayın.Jet üzerinde bir konum seçin ve kanalın merkezindeki dikey odağı bulmak için X ve Y eksenlerinde tarama yapın. Mikroskobun alan derinliği, kanal derinliğinden çok daha azdır ve akış hızı, duvarların bir mikron yakınındaki alanlar hariç kanal boyunca tekdüzedir. Bu nedenle, gözlemlenen floresansın zamansal çözünürlüğü öncelikle konfokal noktanın boyutu tarafından belirlenir.Jet boyunca, çıkış kanalı içerisinde 100 mikronluk artışlarla yatay tarama yaparak her pozisyonda yaklaşık bir milisaniye boyunca gözlemleyin. Daha sonraki zamanları yakalamak için mikroskop tablasını jet boyunca 80 ila 90 mikron hareket ettirin. Alternatif olarak, ışık, dikroik aynadan sonra bir lens kullanılarak giriş yarıklarına odaklanabilir ve bir spektrograf ile CCD tarafından tespit edilebilir.Veri toplama işlemi foton sayaca kıyasla daha yavaş olduğundan, genellikle önce jet foton sayacıyla görüntülenir ve ardından jet boyunca belirli noktalar spektrograf ile ölçülür. Foton sayacından elde edilen veriler, her konumda jetin etrafındaki üç ila beş piksel toplanarak şiddete karşı mesafe grafiği oluşturulmasıyla analiz edilir. Zaman, uygulanan basınçlara dayalı olarak hesaplanan hız kullanılarak mesafeden hesaplanır.Son adım olarak, spektrograftan gelen verileri metinde açıklanan yöntemlerden birini kullanarak analiz edin. Burada, foton sayacı tarafından ölçülen karıştırma bölgesindeki yoğunluğun bir kontur grafiği gösterilmektedir. Jetin dışındaki çıkış kanalındaki arka plan, detektörün gürültü tabanına yakın olmalıdır ve tipik olarak çıkarılmaz.Daha yüksek bir arka plan, zayıf hizalamaya veya proteinin kanal duvarlarına yapıştığına işaret edebilir. Aksine, özellikle karıştırma bölgesi yakınında bükülmüş veya eğri görünen bir jet, nozulların yetersiz aşındırıldığını gösterir. Alexa 488 ve Alexa 647 ile işaretlenmiş protein ACell koenzim a bağlayıcı protein veya A CBP'den elde edilen zamana bağlı bir spektrum gösterilmektedir.Yeşil ve kırmızı dikdörtgenler sırasıyla donör ve akseptör kanallar olarak belirlenen dalga boylarını göstermektedir. Bu veriler, karanlık yükü ve lazer sinyalini gidermek için arka plan çıkarma işlemine tabi tutulmuştur. Arka plan sinyali, merkez kanal basıncı sıfır pound per square inch olacak şekilde alınmıştır.Karıştırma süresi, potasyum iyodür ile triptofan floresan sönümlemesi gibi karıştırmadan çok daha hızlı gerçekleşen hızlı bir reaksiyon ölçülerek belirlenebilir. Jet, mikroskobun optik çözünürlüğünden daha küçük olduğu için karıştırma bölgesinde büyük bir yoğunluk düşüşü meydana gelir. Jet oluşurken, hiçbir çözelti koşulunun değiştirilmediği bir kontrol ölçümü yapılarak bu cihaz yanıtı ortadan kaldırılabilir.N-Asetil triptofan amid floresansının karıştırma ve karıştırmama deneylerinin oranı bu şekilde gösterilmektedir. Çizgi, konsol multiphysics modelleme ve simülasyonlarından elde edilen potasyum iyodür tahmini konsantrasyonunu göstermektedir. Konsantrasyonun %80 oranında azalması için geçen süre olarak ölçülen karıştırma süresi sekiz mikrosaniyedir.Bu grafik, denatüre edici konsantrasyonunun altı molar değerden 0,06 molar değere seyreltilmesi sonrası protein A CBP'deki FRET değişimlerini göstermektedir. Bu veriler için bir kontrol deneyine gerek yoktur. FRET halihazırda bir oran olduğu ve cihaz yanıtı önceden çıkarıldığı için, T sıfıra yakın bölgedeki hızlı sıçrama, karıştırma süresi içinde FRET sinyalindeki hızlı bir değişimi temsil etmektedir.Bu gelişmenin ardından, söz konusu teknik, protein katlanması alanındaki araştırmacıların protein yapısının oluşumundaki ilk aşamaları keşfetmelerinin yolunu açmıştır.

microfluidic-mixers-for-studying-protein-folding

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Burada, bir mikroakışkan cihazda karıştırma homojenliğini ölçmek için mikro ölçekli schlieren tekniğini kullanan bir prosedürü açıklıyoruz. Kalibrasyon yoluyla, konsantrasyon gradyanının dağılımı mikro-schlieren görüntüsünden türetilebilir.

Mikro Schlieren Tekniği ile bir mikroakışkan Aygıt karıştırma homojen Analizi

Bu protokolü nasıl imal ve mikrosıvısal cihazlar x-ışını kırınım veri toplama oda sıcaklığında için ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Ayrıca, protein kristalizasyon tarafından dinamik ışık saçılma izlemek açıklar ve nasıl işlemek ve analiz kırınım veri elde.

Mikrosıvısal çip Situ Crystal x-ışını kırınım ve in Situ dinamik ışık saçılma seri kristalografisi için için

Biz imalat ve birden çok parçacık tekrarlanan faz geçişleri yumuşak konuda rheological etkilerini incelemek için microrheology ölçümleri izleme sağlayan bir mikrosıvısal aygıt kullanımını göstermektedir.

Havacilik ve Microrheology tekrarlanan faz geçişleri sırasında yumuşak madde Rheological özellikleri belirlemek için birleştirme

Bu makalede, diyaliz yöntemi ve yerinde X-ışını kırınım deneyleri ile çip üzerinde protein kristalizasyonu için geliştirilen mikroakışkan çiplerin imalat protokolü ayrıntılı olarak açıklenmektedir. Mikrofabrikasyon işlemi, yarı geçirilebilir yenilenmiş selüloz diyaliz membranın, çipin iki katmanı arasında herhangi bir moleküler ağırlık kesme ile entegre olmasını mümkün kılar.

In Situ X-ışını Kırınım Çalışmaları için Mikrodiyaliz ile Çip Üzerindeki Proteinlerin Kristalizasyonu

Burada sunulan protokol, sıvı kriyojende vitrifikasyondan önce en az 90 ms karıştırılan kendi kendine fitillenen nanotel ızgaraya iki ilgi örneği sunmak için yeni bir robotik sistem olan Spotiton'un kullanımını açıklamaktadır.

Yeni Bir Robotik Sistem Kullanarak Zaman Çözümlenen Çalışmalar için Kriyo-Elektron Mikroskobik Izgara Hazırlığı, Spotiton

Basit aktin filament mikroakışkan tahlilleri için, floresan mikroskobu ile birlikte, bireysel aktin filamentlerini gerçek zamanlı olarak doğru bir şekilde izlemeyi ve sırayla farklı protein çözeltilerine maruz bırakmayı sağlayan protokoller sunuyoruz.

Tek Aktin Filamentlerin ve Demetlerin Montaj Dinamiğini İncelemek için Mikroakışkanlar ve Floresan Mikroskobu Kullanma

Bu protokol, düşük afiniteli protein-protein etkileşimlerini araştırmak için kütle fotometrisini yeni bir mikroakışkan sistemle birleştirir. Bu yaklaşım, düşük afiniteli ölçümleri mümkün kılan ve kütle fotometrisinin uygulanabilirliğini genişleten çözelti içindeki yüksek konsantrasyonlu komplekslerin hızlı bir şekilde seyreltilmesine dayanmaktadır.

Mikroakışkanların Kütle Fotometrisi ile Birleştirilmesiyle Mikromolar Derişimlerde Protein Kompleksi Oluşumunun Analizi

Yağda su emülsiyonlarında (tapalar) kombinatoryal kütüphanelerin üretimi için polidimetilsiloksan (PDMS) bazlı iki katmanlı bir cihazın imalatı burada sunulmaktadır. Fiş üretimini otomatikleştirmek için gerekli donanım ve yazılım protokolde detaylandırılmıştır ve kantitatif bir floresan fiş kütüphanesinin üretimi de gösterilmiştir.

Kombinatoryal Fiş Üretimi için İki Katmanlı Mikroakışkan Cihaz

Bu protokol, mikrotübül polimer mekaniğini araştırmak için uygun bir mikroakışkan cihazın tasarımını ve üretimini detaylandırır. Mikrofabrikasyon, otomatik akış kontrolü ve hesaplamalı modelleme tekniklerinin sentezi, hücresel hücre iskeletini in vitro olarak araştırmak için ideal olan esnek bir sistem sağlar.

Mikrotübül Polimer Mekaniğinin İncelenmesi için Mikroakışkan Tabanlı Bir Yaklaşımın Geliştirilmesi

Bu makalede, hidrodinamik akış dayalı parçacık hapsi mikroakışkan tabanlı bir yöntem mevcut. Biz böylece entegre bir microdevice keyfi parçacıkların hapsi ve mikromanipülasyon sağlayan bir geribildirim kontrol mekanizması kullanılarak bir sıvı durgunluk noktasında kararlı parçacık yakalama göstermektedir.

Tek Parçacıklar için mikroakışkan tabanlı Hidrodinamik Tuzak

Öğrenin, mikroakışkan mikserlerle protein katlanma dinamiklerini yaklaşık 8 mikrosaniyede karıştırarak biyokimyasal reaksiyonları incelemeyi. Bu yöntem, konfokal floresan mikroskobisi ve FRET ile erken katlanma olaylarını yakalamanızı sağlar.

Protein Katlama Öğrenmenin mikroakışkan Mikserler

Daha fazla video keşfet