Protein Katlama Öğrenmenin mikroakışkan Mikserler

Bu prosedürün genel amacı, mikrosaniye ölçeğinde biyokimyasal bir reaksiyonu başlatmak için iki çözeltiyi hızla karıştırmaktır. Bu işlem, öncelikle bir mikroakışkan karıştırıcı üretilerek gerçekleştirilir. İkinci adım, kanalları sızdırmaz hale getirmek için bir çipin bir örtü camına yapıştırılmasıdır.

Ardından, çip, çözelti rezervuarlarını içeren bir manifolda monte edilir. Son adım, karıştırılmış çözeltinin konfokal floresan mikroskobu ile görüntülenmesidir. Nihayetinde, çıkış kanalı boyunca katedilen mesafe zamana dönüştürülerek biyokimyasal reaksiyon mikrosaniye zaman ölçeğinde yakalanır.

Bu tekniğin stop flow karıştırma gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, karıştırmanın türbülans ile sınırlı olmaması ve birkaç mikrosaniye içinde gerçekleşmesidir. Bu yöntem, protein katlanması alanında, örneğin hidrofobik çöküşün ne zaman gerçekleştiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürü laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Ling Woo, mikroakışkan karıştırma çiplerinin imalatına başlayarak gösterecektir.

İlk olarak, dört inçlik FU silika wafer'ları, bu videoya eşlik eden yazılı protokolde açıklandığı şekilde taze piranha solüsyonu ile temizleyin. Ardından, nihai mikroakışkan kanalların hedeflenen her 10 mikron derinliği için yaklaşık bir mikron kalınlığında bir polisilikon kaplama uygulamak üzere düşük basınçlı kimyasal buhar biriktirme fırını kullanın. Wafer'ların metinde açıklanan ek işlemleri tamamlandıktan sonra, wafer'ların üzerine 900 nanometre kalınlığında bir Z 52 14 fotoresist tabakası spin-coat yöntemiyle kaplayın ve ardından doğrudan bir sıcak plaka üzerinde 90 santigrat derecede bir dakika boyunca veya bir fırında 110 santigrat derecede 30 dakika boyunca soft bake işlemi uygulayın.

Fotoğraf maskası hizalandıktan sonra, önce fotoğraforezisti birkaç saniye boyunca UV ışığına maruz bırakarak sert ve vakumlu bir temas sağlayın. Ardından, yazılı protokolde listelendiği şekilde fotoğraforezistteki deseni geliştirin. Wafer üzerindeki özellikleri bir mikroskopla inceleyin ve doğrudan bir sıcak plaka üzerinde iki dakika boyunca 115 °C'de sert pişirme (hard bake) işlemi uygulayın.

Ardından, gofretleri Asher veya oksijen plazması ile 100 watt RF güçte 2,5 dakika boyunca DCU işlemine tabi tutun. Derin reaktif iyon aşındırıcı kullanarak, poli silika tabakasını altındaki ergitilmiş silikaya kadar tamamen aşındırın. Kalan fotoresist tabakasını sökün ve gofreti metinde belirtildiği şekilde işleyin.

Aşındırma derinliğini ölçerek poli kaplamanın tamamen geçildiğinden emin olun. Oksit aşındırma kapasiteli bir derin reaktif iyon aşındırıcı kullanarak, poli kaplamanın her bir mikron kalınlığı için yaklaşık 10 mikron derinliğe kadar füzyon silikayı aşındırın. Gofretle dört dakika boyunca, 100 watt RF gücünde matriks Asher ile temizlik yapın ve delikler açmadan önce polisilikonu bir xenon diflorür aşındırıcı ile şeritlendirin; sonraki işlemler sırasında kanalları korumak için gofretin üzerine bir mikronluk yeni bir fotoresist tabakası spin kaplama ile uygulayın.

Ardından, wafer'ı Aqua Bond 55 kullanarak bir feda cam plaka üzerine özellik tarafı aşağı gelecek şekilde monte edin. Bonderin içinde kabarcık kalmamasına dikkat ederek, mikro 90 temizleme solüsyonu ile bilgisayar kontrollü elmas uçlu matkabı soğutun. Bu işlem, küçük cam parçalarının kanallara yapışarak kullanım sırasında çipi tıkamasını önler.

Her bir çipe giriş ve çıkış delikleri açma işlemine geçiniz. Her bir deliğe şırınga ile su enjekte ederek wafer'ı deiyonize su ile durulayınız. Ardından, fotoresist tabakası uzaklaştırıldıktan sonra bir saat boyunca sabunlu su içerisinde bekletiniz.

Metinde açıklandığı şekilde direnç (resist) ve yapıştırıcıyı (bonder) uygulayın. Gofreti deiyonize su ve ılık sabunlu su ile durulayın. Gofret üzerinden azot akıttıktan sonra, aşındırılmış kısımlara dikkat ederek her bir deliği bir şırınga yardımıyla tekrar durulayın.

120 °C'ye ayarlanmış bir vakum fırınında kurutmaya devam edin. Delikleri kontrol ederek grit içermediğinden emin olun ve gerekirse temizleme adımlarını tekrarlayın. Sonraki adımlar temiz oda içerisinde gerçekleştirilmelidir.

Kanal derinliğini optik veya mekanik bir yüzey profilometresi ile ölçün. Temiz oda içerisinde, metinde açıklandığı şekilde gofretle birlikte füze silika örtü camını temizleyin. Gofreti azot gazı ile en az beş dakika boyunca iyice kurutun.

Ardından wafer'ı, küçük bir cam levha gibi sert ve düz bir yüzeyin üzerine yerleştirilmiş üç ila dört adet temiz oda mendilinden oluşan bir yığının üzerine, özellik tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirin. Aynı işlemi lam için tekrarlayın. Lamı kenarından tutun ve cilalı tarafı wafer'ın üzerine gelecek şekilde ters çevirin.

Düz kenarları dikkatlice hizalayın, kapatma camını wafer'ın üzerine bırakın ve yerleşmesine izin verin; hizalamayı ayarlamak için yalnızca yatay olarak hafifçe itin. Bir parmağınızla wafer'ın merkezine bastırın. Dışa doğru yayılan bir bağlanma cephesinin oluştuğu görülmelidir.

Gerektiğinde, bağlama hattını ilerletmek için wafer çevresindeki diğer bölgelere ek basınç uygulayın. Mühürlenmiş wafer'lar, metinde belirtilen sıcaklık profiline programlanmış yüksek sıcaklık fırınına yerleştirildikten sonra, bir wafer kesme testeresi ile ayrı çipler halinde kesin. Karıştırma çipini ve solüsyonları tutacak manifold, lexan veya pleksiglas gibi plastiklerden veya alüminyumdan yapılabilir.

Sıcaklık kontrolü için çipi, küçük o-ringler aracılığıyla manifolda bağlayın ve çipin merkezinin optik olarak net görünmesini sağlayan bir sabitleme halkasıyla yerinde tutun. O-ring kanalları, çipe çok fazla basınç uygulamadan iyi bir eşleşme sağlamak için standarttan daha sığ olmalıdır. Çip monte edildikten sonra, kuyucukların tabanında hapsolmuş hava kabarcıklarını çıkarmaya dikkat ederek merkez ve yan rezervuarlara çözeltileri ekleyin.

Manifoldu ters bir mikroskoba yerleştirin ve karıştırma bölgesini okülerle veya kamera çıktısıyla inceleyin. Manifoldun üzerine yerleştirilen akkor bir el feneri yeterli ışığı sağlayacaktır. Jeti görüntülemek için merkez kanalda bir boya veya yüksek kırılma indisli bir çözelti kullanın.

Bu karıştırıcıda kullanılan hacimler çok küçük olduğundan, akış, çözelti kuyucuklarının üzerine uygulanan hava basıncı ile kontrol edilebilir. Jeti görselleştirmek için, yan kanal basıncını sıfır pound per square inch değerinden başlatın ve merkez kanal ile eşit basınca ulaşana kadar yavaşça artırın. Eğer yan kanallardan biri tıkanmışsa, jet çıkış kanalının duvarlarından birine doğru itilecektir.

Görünür bir tıkanıklık oluşursa, bir şırınga ile çıkış kanalına basınç veya vakum uygulanarak tıkanıklık giderilebilir. Eğer çip protein veya diğer organik maddeler nedeniyle tıkanmışsa, gece boyunca piranha solüsyonu içinde bekletilerek temizlenebilir. Kaplamalı bir lazer demeti, mikroskobun içinde veya hemen dışında bulunan dikroik bir ayna kullanılarak araştırma düzeyindeki bir mikroskoba yönlendirin.

Odak noktasının okülerde veya kamerada, karıştırma bölgesine oldukça yakın bir konumda görülebilmesi için lazeri hizalayın. Karıştırıcıdaki proteinden gelen floresans, objektif tarafından toplanır, dikroik aynadan geçirilir, bir mercek yardımıyla odaklanarak bir pinhole'a gönderilir ve bir foton sayıcı üzerinde görüntülenir. Karıştırma bölgesini görüntülemek için çipi x ve y yönlerinde piezoelektrik bir tarayıcı kullanarak tarayın.

Jet üzerinde bir konum seçin ve kanal merkezindeki dikey odağı bulmak için X ve Y eksenlerinde tarama yapın. Mikroskobun alan derinliği, kanal derinliğinden çok daha azdır ve akış hızı, duvarların bir mikron yakını hariç kanal boyuncale üniformdur. Bu nedenle, gözlemlenen floresansin zamansal çözünürlüğü temel olarak konfokal noktanın boyutu tarafından belirlenir.

Jet boyunca, çıkış kanalı içerisinde 100 mikronluk artışlarla yatay tarama yapın ve her konumda yaklaşık bir milisaniye boyunca gözlemleyin. Daha sonraki zamanları yakalamak için mikroskop tablasını jet boyunca 80 ila 90 mikron hareket ettirin. Alternatif olarak, ışık, ışığı giriş yarıkına odaklamak için kullanılan bir mercek yardımıyla dikroik aynadan sonra bir spektrograf ve CCD tarafından tespit edilebilir.

Veri toplama işlemi foton sayıcıya göre daha yavaş olduğu için, genellikle jet önce foton sayıcıyla görüntülenir ve ardından jet boyunca belirli noktalar spektrograf ile ölçülür. Foton sayıcıdan elde edilen veriler, her konumda jetin etrafındaki üç ila beş piksel toplanarak yoğunluk-mesafe grafiği oluşturulacak şekilde analiz edilir. Zaman, uygulanan basınçlara dayalı olarak hesaplanan bir hız kullanılarak mesafeden hesaplanır.

Son adım olarak, spektrograftan elde edilen verileri metinde açıklanan yöntemlerden biriyle analiz edin. Burada, foton sayacı tarafından ölçülen karıştırma bölgesindeki yoğunluğun bir kontur grafiği gösterilmiştir. Jet dışındaki çıkış kanalındaki arka plan, dedektörün gürültü tabanına yakın olmalıdır ve genellikle çıkarılmaz.

Daha yüksek bir arka plan, kötü hizalamayı veya proteinin kanal duvarlarına yapıştığını gösterebilir. Aksine, özellikle karıştırma bölgesi yakınında bükülmüş veya eğri görünen bir jet, nozulların kötü aşındırıldığını gösterir. Alexa 4 88 ve Alexa 6 47 ile işaretlenmiş protein ACell koenzim a bağlayan protein veya A CBP'den elde edilen zamana bağlı çözünürlüklü bir spektrum gösterilmiştir.

Yeşil ve kırmızı dikdörtgenler sırasıyla donör ve akseptör kanallar olarak belirlenen dalga boylarını göstermektedir. Bu veriler, karanlık yükü ve lazer sinyalini gidermek için arka plan çıkarma işlemine tabi tutulmuştur. Arka plan sinyali, merkez kanal basıncı sıfır psi olacak şekilde alınmıştır.

Karıştırma süresi, potasyum iyodür ile triptofan floresans sönümlenmesi gibi karıştırmadan çok daha hızlı olan hızlı bir reaksiyon ölçülerek belirlenebilir. Jet, mikroskobun optik çözünürlüğünden daha küçük olduğu için karıştırma bölgesinde büyük bir yoğunluk düşüşü meydana gelir. Jet oluşurken, herhangi bir çözelti koşulunun değiştirilmediği bir kontrol ölçümü yapılarak bu cihaz yanıtı ortadan kaldırılabilir.

N-Asetil triptofan amit floresansının karıştırma ve karıştırmama deneylerinin oranı bu şekilde gösterilmiştir. Çizgi, konsol multifizik modelleme ve simülasyonlarından elde edilen potasyum iyodür öngörülen konsantrasyonunu göstermektedir. Konsantrasyonun %80 azalması için geçen süre olarak ölçülen karıştırma süresi sekiz mikrosaniyedir.

Bu grafik, denatürasyon konsantrasyonu altı molar değerden 0,06 molar değere seyrelttikten sonra protein A CBP'deki fret değişimlerini göstermektedir. Bu veriler için bir kontrol deneyine gerek yoktur. Fret zaten bir oran olduğu ve cihaz yanıtı önceden giderildiği için, T sıfıra yakın bölgedeki hızlı sıçrama, karıştırma süresi içinde fret sinyalindeki hızlı bir değişimi temsil eder.

Bu gelişmenin ardından, söz konusu teknik, protein katlanması alanındaki araştırmacıların protein yapısının oluşumundaki en erken aşamaları keşfetmelerinin önünü açmıştır.