Name: Raman Spektroskopisi kullanarak Hücreler ve Ekstrasellüler Matriks Temassız, Etiket ücretsiz izleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Öğrenin, Raman spektroskopisi ile hücre ve dokuları temassız, etiketsiz izleme yöntemini. Bu teknik, biyokimyasal bileşime dayalı spektral parmak izleri oluşturarak canlı örneklerin çok değişkenli analizini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz el yazması üzerine yararlı önerileri için kendi teknik destek ve Shannon Lee Layland (Fraunhofer IGB hem Stuttgart) için Steffen Koch teşekkür ederim. Bu çalışma finansal Fraunhofer-Gesellschaft ve BMBF (KS-L hem de.) Ile Çekmek programı tarafından desteklenmiştir.

1. Biyolojik Numune Hazırlanması <ol><li> Yaşayan hücrelerin hazırlanması <ol><li> Yapışmış olan hücrelerin hazırlanması <ol><li> Cam bir alt çanak (Greiner BioOne / Almanya) ve 37 bunları tasarlamak üzerine in vitro-kültür veya taze izole hücrelerinde Tohum ° C ve% 5 CO 2 hücre eki tamamlanana kadar. </li><li> Kültür ortamı çıkartın ve PBS önce ölçümü ile yavaşça üç kere yıkayın. Bütün ölçüm işlemi boyunca PBS veya hücre kültür aracı ya kaplı hücreleri tutmak. </li></ol></li><li> Süspansiyon hücrelerin hazırlanması <ol><li> Ortak bir protokol (örn. tripsin-EDTA, hücre kazıma) &#39;ye göre vitro-kültürlenmiş hücrelerde ayırmak, hücreler santrifüj edilir ve elde edilen PBS içerisinde hücre peleti veya hücre kültür ortamı yeniden askıya. </li><li> Bir cam alt çanak için: hücre süspansiyonu 100 ul (max 100.000 hücre / ml. Konsantrasyon) aktarın. </li></ol></li></ol></li><li> Nat hazırlanmasıive dokuların <ol><li> Dokuların hasat edildikten sonra, 4 ° C&#39;de veya buz önce ölçümü 12 saatten daha steril, buz gibi soğuk PBS aktarmak ve artık onları tutun. Önceki deneyler uzun bir depolama süresi (4 ° C&#39;de soğuk iskemi zamanı&gt; 12 saat) doğal bozunma süreçleri nedeniyle spektral değişikliklere sebep olduğunu göstermiştir. </li><li> Ölçümler doku kurutma sonucu ECM proteinleri ve hücre hasarı önlemek için PBS veya orta kaplı doku ile gerçekleştirilmesi gerekir. </li></ol></li></ol> 2. Raman Spektrometresi Bizim özel Raman spektroskopisi Raman parlak alan ve floresan görüntülerin doğrudan karşılaştırma sağlayan bir Raman spektrometresi ile standart bir floresan mikroskop (Olympus IX 71) birleştirir. Temel set up 784 nm diyot laser (Toptica fotonik AG / Almanya), eksitasyon ışıktan Raman-dağınık ışık ayrılması için bir çentik filtresi, bir mikroskop, bir oluşurnd bir spektral bilgi (Yumuşak Görüntüleme Sistemleri / Almanya F-görüntülemek) tespiti için optimize edilmiş bir şarj bağlı cihaz (CCD kamera) ile spektrograf (Kaiser Optik Sistemleri A.Ş., Ann Arbor / Amerika). 3. Lazer Fonksiyon Kontrolü <ol><li> Yazılım Andor Solis (Andor / Birleşik Krallık) başlatın ve -60 CCD kamera sıcaklığını ayarlamak ° C kamera ısının neden akımların neden olduğu gürültüyü en aza indirmek için. </li><li> Kalibrasyon işlemi için mikroskop sahnede bir silikon yerleştirin. </li><li> Üzerine lazer açın ve gücü 85 mW ayarlanır. </li><li> XY görünene kadar gofret üzerine lazer odaklanmak için yazılım Hücre B (Olympus / Almanya) kullanın. </li><li> Bir 60x hava objektif kullanarak 1 sn tek bir entegrasyon süresi ile silikon ölçün. </li><li> Piksel sayısından Andor Solis yazılım Raman shift (cm -1) x-ekseninin birimini değiştirin. </li><li> 520 cm -1 silikon tepe lazer odak VaryBu Raman bandı için mümkün olan maksimum yoğunluğu bulmak için spektrum toplanır. Sayıları minimum tutar başarılı bir kalibrasyon için 11.000 &#39;den yüksek olmalıdır. </li></ol> 4. Raman Spektroskopik Ölçümler Tüm ölçümler oda sıcaklığında yapılır. <ol><li> Temel ayarlar <ol><li> Örneklerin spektrum toplamak için 1.2 sayısal bir diyafram ile 60x suya daldırma nesnel (Olympus / Almanya) kullanın. </li><li> Ölçümleri başına 100 saniye olmak üzere toplam 10 entegrasyonlar / 10 saniye satın ayarlarını değiştirin. </li></ol></li><li> Yapışkan hücreler ölçümü <ol><li> Hücreleri ile cam alt çanak alın ve mikroskop sahne üzerine yerleştirin. </li><li> Daha iyi bir sinyal almak ve tekrarlanabilirliği sağlamak, hücre çekirdeğinin üzerine lazer odaklanmak için, mikroskop ışık kapatın ve spektrum toplamaya başlar. </li><li> Arka e bir referans spektrumu ölçünHücrenin yanında lazer odak hareket ettirerek çok 10 spektrumları. Bu odak değiştirirken yeni bir arka plan her odak derinliği için toplanan gerektiğini dikkate almak önemlidir. </li></ol></li><li> Süspansiyon hücreleri Ölçümü <ol><li> Cam alt kabına hücre süspansiyonu 100 ul aktarın ve mikroskop sahneye yerleştirin. </li><li> Hücrenin merkezinde lazer odaklanın, mikroskop ışık kapatın ve spektrum toplamaya başlar. </li><li> Hücrenin yanında lazer odak hareket ettirerek arka planda bir referans spektrumu her 10 spektrumları ölçün. Odak değiştirirken, yeni bir arka plan yeni odak derinliği için toplanan gerekir. </li></ol></li><li> Yerli dokuların Ölçümü <ol><li> Örnek al ve cam bir alt tabak içine yerleştirin. Faiz getirisi (ROI) bölgesi tabağın tabanına dönük odaklı olmalıdır. </li><li> Örnek karşılamak için yeterli PBS ile çanak doldurun. </li><li> Herhangi mov önlemek için numune üzerinde cam bir kapakla yerleştirinölçümler sırasında numunenin ement. </li><li> Faiz yapısına lazer odağı ayarlayın (derinlik çözünürlüğü lazer ve doku bağımlı) ve spektrumları toplamaya başlar. </li><li> Bütün doku alanının lazer dışarı odaklanmak hareket ettirerek arka planda bir referans spektrumu her 10 spektrumları toplayın. Odak değiştirirken, yeni bir arka plan yeni odak derinliği için toplanan gerekir. </li></ol></li><li> Immünfloresan ölçümü (IF) etiketli cryosections <ol><li> Standart bir cryotom ve silis kaplı kapak gözlük takar kullanarak Bölüm taze, ek dondurulmuş doku örnekleri. </li><li> Sadece kısa bir fiksasyon adım (% 4 paraformaldehit ile en fazla 10 dakika) istihdam ve faiz protein tespiti için uygun antikorları kullanarak, IF için rutin bir protokolü takip cryosections Leke. </li><li> Floresans meydana alanda odaklanarak Raman ölçümleri gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Elastin bozulması deneyler <ol><li> Place cam alt tabağın tabanına dönük disseke domuz aort kapakçık (elastin açısından zengin, kalp kapak broşürün kan akışını tarafı katmanı) ventricularis. </li><li> Fibril yapıları odaklanarak bütün doku yüzeyi boyunca 30 rastgele noktalarda bir &#39;non-İnkübe kontrolü&#39; olarak doğal dokuya ölçün. </li><li> 3 bölüme örnek bölün ve bir elastaz çözüm (5 U / ml, Worthington / Almanya) 2 ml ile dolu ayrı 2,5 ml Eppendorf tüpler içine koyun. </li><li> 37, 15 ya da 30 dakika ya için doku inkübe ° C. </li><li> 15 ya da 30 dakika inkübasyondan sonra ya için, Eppendorf tüpüne gelen doku kaldırmak ve tamamen enzimatik reaksiyonu durdurmak için PBS ile dikkatle yıkanır. </li><li> Fibril yapıları odaklanarak, 30 rastgele noktalarda her bir örnek ölçün. </li></ol></li></ol> 5.. Veri İşleme ve Analizi <ol><li> Raman işleme Bir ön-muameleoluşturulan spektrumları OPUS yazılım (Bruker Optik GmbH / Almanya) kullanılarak yapıldı. <ol><li> Ölçümler sırasında odak değişikliklere neden olduğu farklılıklar önlemek için cam ve orta yanı sıra ile müdahale sinyalleri azaltmak amacıyla, alınan spektrumları karşılık gelen arka tayfı çıkarılır. </li><li> Bilgi en yüksek miktar sunuyor 400-1800 cm -1 arasında wavenumber bölgeye spektrumları azaltın. </li><li> Gerekirse, maksimum pik için spektrumları normalleştirmek. Örnek spektrumu yapısal değişikliklerin saptanması basitleştirilmesi yoğunluk dalgalanmaları ve sistematik arızaları, dışarı Normalizasyon faktörler. </li><li> Farklı deneyler arasındaki karşılaştırılabilirlik artırmak için temel bir düzeltme yapın. </li></ol></li><li> Raman analizi Raman Unscrambler (CAMO / Norveç) yazılımı ile PCA kullanılarak analiz edildi. Bu değişkenli analizde spektral verilerin içinde benzerlik ve farklılıkları algılarsetleri. Her spektrum her Raman vardiya toplanan sayıları dayalı çok boyutlu bir uzayda tek bir nokta olarak çizilir. Her bir temel bileşen (PC), orijinal veri içerdiği toplam bilgi belli bir miktar açıklanmaktadır. Birinci bilgisayar varyasyon yüksek kaynağı içeren biridir. Her aşağıdaki PC, sırayla, bir öncekine göre daha az bilgi içerir. Her değişkenin her PC&#39;de bir puan ve bir yükleme var. PC&#39;ler (= puan) çizerek, önemli bir örnek korelasyon gösterilebilir. Yüklemeler PCA her analiz değişkenin katkıları açıklayınız. <ol><li> Her örneklem grubu için satır aralıkları oluşturarak ölçümler her grup etiketleyin. </li><li> PCA için aşağıdaki temel ayarları kullanın: çapraz doğrulama, NIPALS algoritması, hiçbir rotasyon ve analizi başlatın. Bu ayarlar spektrumları bağlıdır. </li><li> PCA gerçekleştirin. </li></ol></li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Raman spyapışık hücrelerinden oluşturulan ectra genellikle düşük sinyal-gürültü oranı ve düşük bir genel sinyal yoğunluğu (Şekil 1) lazer odak cam altında, müdahale etkisi yakın duzenlenmeli olması nedeniyle. 11 ortaya cam sinyali gerçek örnek sinyal maskeleme neden oldukça yüksektir. Bir sonraki geri çıkarma sırasında Bu nedenle, örneğin sinyal minimize olabilir veya hatta ortadan kaldırılmıştır. Onlar daha detaylı spektral bilgi algılanmasına izin olarak Böylece, biz, bizim Raman spektroskopik analiz için süspansiyon hücreleri kullanmayı tercih eder. Bununla birlikte, yapışık ve süspansiyon hücreleri spektrumları, sadece kendi yoğunluklarındaki farklı aynı temel zirveleri sergilerler. Bir süspansiyon içinde farklı hücre tiplerinin karakterizasyonu için, herhangi bir ön-muamele gereklidir. Süspansiyon ölçülen ortalama Raman ve insan fibroblastlar, mezenkimal kök hücreler (MKH), kondrosit ve keratinositlerin standart sapma olarakŞekil 2 içinde gösterildiği. Bütün Raman benzer zirveleri (bkz. Tablo 1) protein, nükleik asit ve lipidler gibi tipik biyomoleküllerin menşeyli, yapılandırılmıştır. Bu hücre türleri için 12, 600 ve 1800 cm -1 en ilgili spektral bilgi içeren arasındaki spektral bölgede tarafından hangi belirgin farklılıklar farklı hücre tipleri (Şekil 2A) arasında algılanabilen edilir. Örnek, biz kollajen ve lipid moleküler titreşimler atanabilir olduğunu açıkça yapısal farklılıklar sergileyen bir spektral bölgede (1280-1350 cm -1) vurgulanır. Buna karşılık, morfolojik analizler çoğu hücrelerin tanımlanması ve ayrım (Şekil 2B-I) için uygun değildir. Kondrosit ve cilt hücreleri arasındaki fark (Şekil 2B, H karşı B, F ve E, I) gözlemlenebilir edilirken, fibroblast ve MKH sadece parlak alan micrsoc kullanarak ayırmak zorduropyala (Şek. 2B, F karşılık C, G). 13 Özellikle ECM proteinleri doğal dokuya, Raman spektroskopik analizi ROI ilgili yapısına odaklanmak edebilmek için, parlak alan görüntüleme ile görülebilmesi gerektirir. Belirli bir parmak izi spektrumu için bir proteinin atama için, piyasada bulunan saf protein ve immunohistologically lekeli cryosections arasında Raman oluşturulur. Burada, liyofilize elastin ve elastin karşı bir antikor istihdam immünfloresan lekeli cryosections karşılaştıran doğal dokuların içinde elastik liflerin parmak izi spektrumları belirledi. Elastin Raman yansıyan bir yüksek otofloresansı, özellikleri beri Ancak, veri analizi (Şekil 3A) zordur. Nedeniyle bu tür otofloresansı, veri kümelerinin uygun bir işleme gibi örnek özgü özellikleri sistematik başarısızlığı azaltmak için önemlidir. Bizim veriler biralyses, biz saf elastin protein anlamlı olarak daha yüksek sinyal yoğunluğu ortadan kaldırmak için normalleşme kullanılır ve bu nedenle, biz (Şekil 3B) karşılaştırılabilir Raman oluşturmak başardık. Elastin vücutta en istikrarlı ECM ​​proteinleri biridir ve aşağılamak için bu nedenle çok zordur. Bizim deneysel set up yılında 14, biz bir enzimatik sindirimi gerçekleştirerek sağlıklı domuz aort kapakçık elastin bozulmaya bağlı. Çok değişkenli analiz PCA uygulamak, biz enzimatik tedavi edilen örnekleri ve yerel denetimleri (Şekil 3C) ve Raman arasında önemli farklılıklar tespit edilmiştir. Bu spektral farklar 861, 1003 ve 1664 cm -1 yükleme spektrumda gözlendi. Elastaz için uzun pozlama süreleri nedeniyle elastin lifleri içeren Beklenen yapısal değişiklikler de daha belirgin ayrılabilir skoru kümeler yansıdı HART Kullanıcı boyama (Şekil 4), (Şekil 3C) tarafından gösterildi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig1.jpg" /> Şekil 1. Müstakil ve yapışık fibroblastların Raman ortalama. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig2.jpg" /> Şekil 2. (A) Raman ve dört farklı ilköğretim izole hücre tipleri (fibroblastlar, MKH, kondrosit ve keratinositler) ve standart sapmalar. Yapısal farklılıklar ile 1350 cm -1 - çerçeve 1280 spektral bölgede vurgulamaktadır. Müstakil (B) fibroblast (BE) Parlak alan görüntüleri, (C) MKH, (D) kondrosit ve (E) keratinositler. Ölçek bar 20 mikron eşittir. Yapışık (F) fibroblast (FI) Parlak alan görüntüleri, (G) MKH, (H) kondrosit ve (I) keratinositler. Ölçek bar 200 mikron eşittir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig3.jpg" /> Şekil 3. Lyophili normalleşme olmadan (A) Ramanzed elastin (mavi çizgi), immünofloresan (IF) etiketli cryosections (turuncu çizgi) ve nativ aort kapakçık içinde ölçülen elastik lifler (kırmızı çizgi). Liyofilize elastin yüksek sinyal yoğunluğu otofloresans kaynaklanır. Normalleştirme sonrası (B) Raman sistemik hataları ortadan kaldırmak için. (C) skorları ve arıtılmamış kontrolü (kırmızı) ve enzimatik-bozulmuş (mavi ve yeşil) doğal doku içinde elastik lifler arasında karşılaştırma yükleri. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig4.jpg" /> Şekil 4. HART&#39;s lekeli domuz aort kapakçık. Elastik lifler siyah canlandırırlar. (A) ve (B) arıtılmamış kontrolü ve (C) ve (D) 30 dakika boyunca elastin-bozundurucu enzimi elastaz maruz bırakıldı doku örnekleri tasvir göstermektedir. <table border="1"><tbody><tr><td> Cm -1 wavenumber </strong&gt; </td><td colspan="2"> Atama 12 </td></tr><tr><td> 717-719 </td><td> CN </td><td> Fosfolipidler </td></tr><tr><td> 785-788 </td><td> DNA / RNA bazları, OPO omurgası </td><td> DNA / RNA </td></tr><tr><td> 1003 - 1005 </td><td> Fenilalanin </td><td> Protein </td></tr><tr><td> 1220-1280 </td><td> Amid III </td><td> Protein </td></tr><tr><td> 1445-1447 </td><td> CH2 </td><td> Protein / Lipid </td></tr><tr><td> 1655-1680 </td><td> Amid IC = C </td><td> Protein Lipid </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Bütün hücre tipleri (fibroblastlar, MKH, kondrosit ve keratinositler) spektrumu içinde algılanır Raman bantları.

<ol><li>Chan, J. W., Lieu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+biochemical+characterization+of+stem+cells+using+vibrational+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Label-free biochemical characterization of stem cells using vibrational spectroscopy.</a> J. Biophotonics. 2, 656-668 (2009).</li>
<li>Downes, A., Mouras, R., Elfick, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+spectroscopy+for+noninvasive+monitoring+of+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optical spectroscopy for noninvasive monitoring of stem cell differentiation.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2010, 101864-101864 (2010).</li>
<li>Gentleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+materials+differences+revealed+in+engineered+bone+as+a+function+of+cell-specific+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Comparative materials differences revealed in engineered bone as a function of cell-specific differentiation.</a> Nat. Mater. 8, 763-770 (2009).</li>
<li>Notingher, I., Hench, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+microspectroscopy%3A+a+noninvasive+tool+for+studies+of+individual+living+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Med.+Devices%22%5BJournal%5D)">Raman microspectroscopy: a noninvasive tool for studies of individual living cells in vitro.</a> Expert. Rev. Med. Devices. 3, 215-234 (2006).</li>
<li>Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+preservation+of+extracellular+matrix+in+cardiac+tissues%3A+implications+for+long-term+graft+durability%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Thorac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Optimized preservation of extracellular matrix in cardiac tissues: implications for long-term graft durability.</a> Ann. Thorac. Surg. 83, 1641-1650 (2007).</li>
<li>Raman, C. V., Krishnan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+type+of+secondary+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new type of secondary radiation.</a> Nature. 122, 12(1928).</li>
<li>Frushour, B. G., Koenig, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+scattering+of+collagen%2C+gelatin%2C+and+elastin%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Raman scattering of collagen, gelatin, and elastin.</a> Biopolymers. 14, 379-391 (1975).</li>
<li>Pudlas, M., Koch, S., Bolwien, C., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+as+a+tool+for+quality+and+sterility+analysis+for+tissue+engineering+applications+like+cartilage+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Artif.+Organs%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy as a tool for quality and sterility analysis for tissue engineering applications like cartilage transplants.</a> Int. J. Artif. Organs. 33, 228-237 (2010).</li>
<li>Votteler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+for+the+non-contact+and+non-destructive+monitoring+of+collagen+damage+within+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy for the non-contact and non-destructive monitoring of collagen damage within tissues.</a> J. Biophotonics. , (2011).</li>
<li>Wold, S., Esbensen, K., Geladi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principal+component+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemometrics+and+Intelligent+Laboratory+Systems%22%5BJournal%5D)">Principal component analysis.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 2, 37-52 (1987).</li>
<li>Pudlas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+Spectroscopy%3A+A+Noninvasive+Analysis+Tool+For+The+Discrimination+of+Human+Skin+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Raman Spectroscopy: A Noninvasive Analysis Tool For The Discrimination of Human Skin Cells.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 10, (2011).</li>
<li>Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U. Raman Spectroscopy of Biological Tissues. Applied Spectroscopy Reviews. 42, 493-541 (1080).</li>
<li>Pudlas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-contact+discrimination+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+and+fibroblasts+using+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Laser+Application%22%5BJournal%5D)">Non-contact discrimination of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and fibroblasts using Raman spectroscopy.</a> Medical Laser Application. 26, 119-125 (2011).</li>
<li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+elastic+tissue+biology%3A+elastin+isolation+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods in elastic tissue biology: elastin isolation and purification.</a> Methods. 45, 32-41 (2008).</li>
<li>Downes, A., Mouras, R., Bagnaninchi, P., Elfick, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+and+CARS+microscopy+of+stem+cells+and+their+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Raman+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy and CARS microscopy of stem cells and their derivatives.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 42, 1864-1870 (2011).</li>
<li>Krafft, C., Dietzek, B., Popp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+and+CARS+microspectroscopy+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Raman and CARS microspectroscopy of cells and tissues.</a> Analyst. 134, 1046-1057 (2009).</li>
<li>Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+multiphoton+imaging+of+extracellular+matrix+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Non-invasive multiphoton imaging of extracellular matrix structures.</a> J. Biophotonics. 1, 451-462 (2008).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Raman spektroskopisi doğal dokuların içinde in vitro-kültür hücreleri ve ECM proteinleri gibi hücrelerde gibi biyolojik örnekler, analiz için uygun bir araçtır. Burada 11,15,16, biz bu temassız, etiket serbest teknik olanak gösterdi farklı hücre tipleri ayrımcılık ve sadece bu biyolojik örneklerin içsel biyomoleküler bileşimine dayalı ECM protein yıkımı tespiti. Raman spektroskopisi büyük avantajı, non-invaziv bundan kaynaklanan Raman tarafından örnek bir biyokimyasal parmak izi ölçmek yeteneğidir. Benzer bilgiler verir kızılötesi spektroskopi, aksine, Raman zayıf su Raman saçılma olarak, sulu örneklerinden derlenen edilebilir. Buna ek olarak, Raman spektroskopisi, sadece tek renkli ışık saçılma tespit dayanmaktadır, bu nedenle, herhangi bir örnek işleme önceden ölçülmesi gereklidir. Bu nitelikler Ra yapmakin vivo görüntüleme uygulamaları potansiyel man spektroskopisi umut verici bir alternatif. Daha hızlı ve deneylerde kullanılan aynı titreşim sinyalleri dayalı verilerin daha duyarlı toplanmasını sağlayan beri bu gelince, tutarlı bir anti-Stokes Raman spektroskopisi (CARS) çok ilginç bir tekniktir. Multiphoton bağlı otofloresans dahil 15,16 Diğer alternatif yöntemler ve ikinci harmonik üretimi görüntüleme daha önce 17 Bununla birlikte, bu görüntüleme yöntemlerinin çok yüksek maliyetler ile ilişkilidir. olmayan veya minimal invazif biyolojik örneklerin izlenmesi için uygun olduğu kanıtlanmıştır ve otofloresans üreten molekülleri ile sınırlıdır. Buna ek olarak, Raman spektrometresi konvansiyonel optik mikroskop ile birleştirmek için kolaydır. Bu özellikler Raman spektroskopisi fizyolojik ortamlarda biyolojik örnekleri çalışmak için değerli bir araç haline getiriyor. Bizim Raman spektroskopisi mevcut kısıtlamalara biri kurmakyüksek sayısal açıklık objektif (NA = 1.2) tarafından oluşturulan nispeten küçük lazer odak (250 nm tam genişlikte yarı maksimum (FWHM) lateral ve 700 nm FWHM eksenel). Yüksek sayısal açıklık yüksek sinyal-gürültü oranı veren yayılan Raman ışık iyi bir miktar kapsayacak olanak sağlasa da, yüksek NA tipik bir hücre daha küçük örneklem içinde sadece küçük bir toplama odak üretir. Farklı hücre Raman karşılaştırmak amacıyla, temsili bir spektrum toplama küçük bir odak alanı ile elde edilmesi zor olan, esastır. Bu sorunu gidermek için, ortalama ve temsili bir spektrum veren bir spektral sonuçlanan hücre içerisinde farklı noktalarda (= Raman spektroskopisi haritalama), az sinyal toplama otomatikleştirmek için bir süreç üzerinde çalışıyoruz. Buna ek olarak, bu yöntem, bir hücre içinde proteinin dağılımının, örneğin belirli Raman gruplarından dağılımının bir özetini temin edecektir. Biological örnekleri derece karmaşıktır ve toplanan Raman katkı biyomoleküllerin heterojen bir karışım oluşur. Bu nedenle, spektral desen derece karmaşıktır ve bir Raman spektrumu içinde bir molekülün bir tek tip izleme farklı molekül sinyalleri ile birlikte üst üste binen başarmak zordur. Ayrıca, örnek intrinsik floresans zayıf Raman sinyallerinin değerli bilgiler maskeleyebilir. İlginçtir, önceki bazı çalışmalarda, biz uygun bir analiz aracı kullanarak hücre tipleri (MKH ve fibroblastlar) arasındaki en önemli ayırıcı faktör olarak Raman otofloresan belirlendi. 13 Biz de genel Raman sinyal yoğunluğundaki değişiklikler olarak hizmet verebildiğini tespit kollajen ve aort kapak broşür ECM içinde kollajen liflerinin durumu için bir gösterge. 9 Ancak, bu dokularda elastin devlet değerlendirirken, benzer sonuçlar tespit edemedik. Sonuç olarak bahsedilens bölümünde, sadece yerli kontrollerle karşılaştırıldığında elastazı verilen örneklerinde spesifik Raman bantların değişiklikler tespit edebildi. Biz beklendiği gibi enzimatik tedavi örneklerinde genel Raman sinyalinin bir azalma görmedim. Bu gözlemler, önceki çalışmada görüldüğü gibi net bir kümelenme oluşumu vermedi.Bu bir puan komplo sonuçlandı. Aksine 9, enzimatik tedavi etkisi PCA sonuçları içinde algılanabilen edildi. Biz iki ECM proteinleri, elastin ve kolajen arasındaki bu farklılıklar morfolojik farklılıklar ve farklı enzimatik yıkım süreçleri dayalı olduğunu varsayalım: aort kapak broşürün içinde, kollajen zengin bölgesi (fibröz) nedeniyle gevşeyen için olur sürekli bir tabakadır enzimatik tedavisinde, bu sayede bölgesi (ventricularis) içeren elastin elastaz maruz (Şekil 4) sonra parçalanır görünen bir ağ konfigürasyona sahiptir. Tek nokta ölçümleri bu appropri değildielastin ağı içinde böyle küçük kopmalar tespit yedik. Burada, bir doku Raman haritalama ağ arıza belirlenmesine yardımcı olacaktır. Biyolojik örneklerin Raman spektroskopisi bir başka zorluk ölçüm zamanlarında azaltmaktır. Bir çözüm biyolojik örnekler foto-hasarı etkilenmediği sürece uygun lazer gücü, artırmaktır. Mevcut deneylerin tüm temel araştırma odaklanan proof-of-prensibi çalışmalar olmakla birlikte, bizim genel amacı, rejeneratif tıp (doku mühendisliği ürünlerinin örneğin kalite kontrolü), ön nakli greft izleme ve dahil olmak üzere klinik uygulamalar için Raman spektroskopisi uygulamaktır kanser teşhisi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> elastaz </td><td> Worthington </td><td> LS006363 </td><td></td></tr><tr><td> anti-elastin antikor </td><td> Sigma </td><td> HPA018111 </td><td> 1:75, sitrat tamponu </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Lonza </td><td> 17-512F </td><td></td></tr><tr><td> Cam alt yemekleri </td><td> Greiner BioOne </td><td> 627860 </td><td></td></tr><tr><td> Unscrambler </td><td> CAMO </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Opus </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

raman spektroskopisi kullanarak hücreler ve ekstrasellüler matriks temassız, etiket ücretsiz izleme

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Hücre ve doku kültürleri izlemek için tahribatsız, temassız ve etiket içermeyen teknolojilerin biyomedikal araştırma alanında ihtiyaç vardır. 1-5 Ancak, şu anda rutin işleme yöntemleri gerektiren adımları ve örnek bütünlüğünü değiştirebilir. Raman spektroskopisi daha fazla işlem adımı için gerek olmaksızın biyolojik örneklerde ölçüm sağlar hızlı bir yöntemdir. . Bu lazer tabanlı teknoloji monokromatik ışık inelastik saçılma algılar 6 her kimyasal titreşim belirli bir Raman bant (cm -1 dalga sayısı) atanan gibi, her biyolojik örnek kendi içsel biyokimyasal bileşimi nedeniyle tipik bir spektral desen özellikleri 7. - Raman içinde 9, pik şiddetlerini mevcut moleküler bağlar miktarı ile ilişkilidir. 1 Benzerlikler ve spektral veri kümelerinin farklılıkları çok değişkenli bir analiz (örneğin temel bileşenler analizi (PCA)) kullanılarak tespit edilebilir. 10 </sup&gt; Burada, canlı hücreler ve doğal dokuların Raman spektroskopisi gerçekleştirin. Hücreler iki cam alt tabaklarının üzerine ekildi veya normal hücre kültürü koşulları altında süspansiyon muhafaza (37 ° C&#39;de,% 5 CO2) ölçümü önce uygulanır. Doğal dokular 4 ° C de önceden ölçümleri (PBS) tamponlu tuzlu kesilir ve fosfat içinde depolanır. Bizim deney seti kadar bağlı, biz sonra da hücre çekirdeğinde veya elastin ve kollajen gibi ekstrasellüler matriks (ECM) proteinleri üzerine odaklanmıştır. Tüm çalışmaları için, 30 hücreleri veya ECM içinde ilgi 30 rastgele noktaları en az ölçülür. Veri işleme adımları arka plan çıkarma ve normalleşme dahildir.

Raman spektroskopisi temassız için uygun bir tekniktir, canlı hücreler, doku mühendisliği yapıları ve doğal dokuların etiket ücretsiz analizidir. Kaynak özgü spektral parmak izi oluşturulur ve çok değişkenli analiz kullanılarak analiz edilebilir.

Raman Spektroskopisi kullanarak Hücreler ve Ekstrasellüler Matriks Temassız, Etiket ücretsiz izleme

Biyomedikal araştırma alanında, hücre ve doku kültürlerini izlemek için tahribatsız, temassız ve etiketsiz teknolojilere ihtiyaç duyulmaktadır.1-5 Ancak, ...

Bu prosedürün genel amacı, temassız ve markörsüz bir yöntemle hücreleri ve dokuyu izlemektir. Bu, standart bir Raman spektrometresine bağlı floresan mikroskop kullanılarak, monokromatik ışığın inelastik saçılmasını saptayan lazer tabanlı bir teknoloji olan Raman spektroskopisi aracılığıyla gerçekleştirilir ve her biyolojik numune için kendi doğal biyokimyasal bileşimine dayalı tipik bir spektral desen üretilir. Çok sayıda biyolojik numuneyi izlemek için parlak alan ve floresan görüntülerin Raman spektrumları ile doğrudan karşılaştırılması kullanılır.Her bir kimyasal titreşim belirli bir Raman bandına atanır ve pik yoğunluğu, mevcut moleküler bağların miktarıyla ilişkilidir. Spektral veri setlerinin benzerlikleri ve farklılıkları tespit edilir. Çok değişkenli analiz kullanılarak, elde edilen spektrumlar bir biyopsi alındıktan sonra dokuların bütünlüğünü kontrol etmek veya izole edilen hücrelerin sterilitesini kanıtlamak için kullanılabilir.Ayrıca, bu teknik in vitro ortamda farklı hücre tiplerinin karakterizasyonuna ve tanımlanmasına olanak tanır. Sonuç olarak Raman spektroskopisi, temassız ve etiketsiz analiz yoluyla doku mühendisliği ve klinik uygulamalar için gelecek vadeden lazer tabanlı bir tekniktir. Prosedür, laboratuvarımdaki teknisyen Daniel Cabal Barrio ve doktora öğrencisi Miriam Tala tarafından gösterilecektir. Bu tekniğin histoloji ve immunofloresan görüntüleme gibi mevcut rutin yöntemlere göre temel avantajı, herhangi bir numune işleminin gerekmemesidir.Bu yöntem tek hücreli durum ve matriks bileşenleri hakkında bilgi sağlayabilse de, çok hücreli dokular ve organlar için de uygulanabilir. Özelleştirilmiş raman spektrumları hazırlamak için, floresan görüntülerin raman spektrumları ile doğrudan karşılaştırılmasına olanak tanıyan standart bir floresan mikroskobu, bir raman spektrometresine bağlanır. Temel düzenek; 784 nanometre diyot lazer, raman saçılan ışığını eksitasyon ışığından ayırmak için bir çentik filtre, bir mikroskop ve spektral bilgilerin tespiti için optimize edilmiş şarj coupled cihazlı bir spektrograftan oluşur.Lazer fonksiyonunu kontrol etmek için yazılımı ve/veya solace'ı başlatın ve kameradaki termal kaynaklı akımların neden olduğu gürültüyü minimize etmek için CCD kameranın sıcaklığını negatif 60 °C'ye ayarlayın. Kalibrasyon prosedürü için mikroskop tablasına bir silikon gofret yerleştirin. Lazeri açın ve gücü 85 mW olarak ayarlayın.XY görünene kadar lazeri gofret üzerine odaklamak için yazılım hücresi B'yi kullanın. Silikon gofreti bir saniyelik tek bir entegrasyon süresiyle ölçün. 60 X hava objektifi kullanarak, X ekseninin birimini piksel numarasından ramen'e değiştirin.Soli yazılımındaki kaydırmalar, toplanan spektrumdaki 520 dalga sayısındaki Silikon Pikinin lazer odağını değiştirir. Bu Raman bandı için mümkün olan maksimum yoğunluğu bulmak amacıyla, spektral ölçüm öncesinde başarılı bir kalibrasyon yapılması için minimum sayım miktarının 11.000'den yüksek olması gerekir; biyolojik örnekleri, bu videoya eşlik eden yazılı protokolde belirtildiği şekilde hazırlayın. Tüm ölçümler oda sıcaklığında gerçekleştirilmiştir.1,2 sayısal açıklığa sahip 60x su daldırma objektifi kullanılarak, her ölçüm için toplam 100 saniye boyunca 10 saniyelik aralıklarla 10 entegrasyon şeklinde spektrumlar toplanmalıdır. Adherent hücrelerin ölçümünü gerçekleştirmek için, hücreleri içeren cam tabanlı bir petri kabını mikroskop tablasına yerleştirin. Daha iyi bir sinyal elde etmek ve tekrarlanabilirliği sağlamak için lazeri hücre çekirdeğine odaklayın, mikroskop ışığını kapatın ve spektrumu toplamaya başlayın.Lazer odağını hücrenin yanına taşıyarak her 10 spektrumda bir arka planın referans spektrumunu ölçün. Odağı değiştirirken, her odak derinliği için yeni bir arka plan verisinin toplanması gerektiğini dikkate almak önemlidir. Alternatif olarak, hücreleri ve süspansiyonu ölçmek için, hücre süspansiyonundan 100 µL miktarını cam tabanlı bir kaba aktarın.Mikroskop tablasına yerleştirdikten sonra lazeri hücrenin merkezine odaklayın, mikroskop ışığını kapatın ve spektrumu yeniden toplamaya başlayın. Lazeri hücrenin yanına odaklayarak her 10 spektrumda bir arka planın referans spektrumunu ölçün. Doğal dokuların spektrumlarını ölçmek için örneği cam tabanlı bir kaba yerleştirin.İlgi bölgesi, kabın altına bakacak şekilde yönlendirilmelidir. Kabı, örneği örtecek miktarda PBS ile doldurun. Örneğin herhangi bir hareketini önlemek için üzerine bir lameli yerleştirin.Ölçümler sırasında, lazer odağını ilgilenen yapıya ayarlayın ve spektrumları toplamaya başlayın. Lazer odağını tüm doku alanının dışına taşıyarak her 10 spektrumda bir arka plan referans spektrumu toplayın; immünofloresan işaretli kriyokesitlerin spektral ölçümü için her odak derinliğinde daima yeni bir arka plan toplayın. Taze şoklanmış doku örneklerini kesin.Standart bir kriyotom kullanarak, kesitleri silika kaplı lamel camlara monte edin. Kriyokesitleri, yalnızca kısa bir fiksasyon adımı uygulayarak ve ilgilenilen proteinin tespiti için uygun antikorlar kullanarak, immünofloresans için rutin bir protokolü takip ederek boyayın. Floresansın gerçekleştiği bölgeye odaklanarak Raman ölçümlerini gerçekleştirin.Elastin bozunma deneylerini göstermek için, diseke porcine aort kapağı yaprakçıklarının ventriküler yüzeyleri cam kap tabanına bakacak şekilde yerleştirilir. Yerli dokunun ölçümü, inkübe edilmemiş bir kontrol olarak, tüm doku yüzeyi boyunca rastgele seçilmiş 30 noktada yapılır.Fibriler yapılara odaklanarak numuneyi iki bölüme ayırın ve bunları iki mililitre elastaz çözeltisi ile doldurulmuş ayrı 2,5 mililitrelik ependorf tüplerine yerleştirin. Dokuyu 37 °C'de 15 veya 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası dokuları ependorf tüpünden çıkarın ve enzimatik reaksiyonu tamamen durdurmak için PBS ile dikkatlice yıkayın.Her bir örneği, fibriler yapılara odaklanarak 30 rastgele noktadan ölçün. Raman Spektra işlemesi, oluşturulan spektraların Opus yazılımı kullanılarak ön işlemden geçirilmesiyle başlar. İlk olarak, camdan ve ortamdan gelen girişim yapan sinyalleri azaltmak ve ayrıca odak değişimlerinin neden olduğu varyasyonlardan kaçınmak için toplanan spektralardan ilgili arka plan spektrumu çıkarın.Ölçümler sırasında, gerekliyse en yüksek bilgi miktarını sunan 401-800 dalga sayısı bölgesine spektrumları indirgeyin. Spektrumları maksimum pik normalizasyonuna tabi tutun; bu işlem, sistematik hatalardaki yoğunluk dalgalanmalarını ortadan kaldırarak örnek spektrumlarındaki yapısal değişikliklerin tespitini kolaylaştırır. Farklı deneyler arasındaki karşılaştırılabilirliği artırmak için taban çizgisi düzeltmesi gerçekleştirin.Raman spektrumlarını, Unscrambler yazılımı ile temel bileşen analizi veya PCA kullanarak analiz edin. Bu çok değişkenli analiz, spektral veri setleri içindeki farkları ve benzerlikleri tespit eder. Her spektrum, her bir Raman kayması için toplanan sayımlara dayanarak çok boyutlu bir uzayda tek bir nokta olarak çizdirilir.Kısaca PC olarak adlandırılan her bir temel bileşen, orijinal verilerin içerdiği toplam bilginin belirli bir miktarını tanımlar. İlk PC, en yüksek varyasyon kaynağını içeren bileşendir. Sonraki her bir PC, bir öncekine göre sırasıyla daha az bilgi içerir.Her değişkenin her bir PC üzerinde bir skoru ve yüklemesi vardır. PC'ler grafiklendiğinde, önemli örnek korelasyonları ortaya çıkarılabilir. Yüklemeler, analiz edilen her bir değişkenin PCA'ya olan katkısını tanımlar. Her örnek grubu için satır aralıkları oluşturarak ölçüm gruplarını etiketleyin; PCA çapraz doğrulaması için NipAl algoritması, rotasyon yok şeklinde temel ayarları kullanın ve analizi başlatın.Bu ayarlar spektrumlara bağlıdır. Son olarak, PCA işlemini gerçekleştirin; adherent hücrelerden elde edilen ham Raman spektrumları genellikle düşük bir sinyal-gürültü oranı ve düşük bir genel sinyal yoğunluğu sergiler. Lazer odağının cam tabana yakın ayarlanması gerekir, bu da gerçek numune sinyalini maskeler.Sonuç olarak, sonraki bir arka plan çıkarma işlemi sırasında örnek sinyali minimize edilebilir veya tamamen ortadan kalkabilir. Aksine, hücreler ve süspansiyonlar daha ayrıntılı spektral bilgilerin tespit edilmesine olanak tanır. Bununla birlikte,lezyonlu ve süspansiyondaki hücrelerin spektrumları, yalnızca yoğunlukları bakımından farklılık gösteren aynı ana pikleri sergiler; bir süspansiyon içindeki farklı hücre tiplerinin karakterizasyonu için herhangi bir ön işlem gerekmez.Süspansiyon içinde ölçülen insan fibroblastlarının, mezenkimal kök hücrelerinin, kondrositlerin ve keratinositlerin ortalama Raman spektrumları ve standart sapmaları burada gösterilmiştir. Tüm Raman spektrumları, proteinler, nükleik asitler ve lipidler gibi tipik biyomoleküllerden kaynaklanan piklerle benzer şekilde yapılandırılmıştır. Bu hücre tipleri için, 601 ile 800 dalga sayısı arasındaki spektral bölge, farklı hücre tipleri arasında net farkların tespit edilebildiği en ilgili spektral bilgileri içermektedir.Örneklemdeki bir spektral bölge, kolajen ve lipidlerin moleküler titreşimlerine atfedilebilen belirgin yapısal farklılıklar göstermektedir. Buna karşılık, morfolojik analizler çoğu hücrenin tanımlanması ve ayırt edilmesi için uygun değildir. Kondrositler ile cilt hücreleri arasındaki fark gözlemlenebilirken, fibroblastlar ile mezenkimal kök hücreleri birbirinden ayırmak zordur.Yerli dokuların belirli bir parmak izi spektrumuna atanması için yalnızca parlak alan mikroskopisi kullanarak, ticari olarak mevcut saf proteinlerin ve immünohistokimyasal olarak boyanmış kriyokesitlerin Raman Spektrumları oluşturulmuştur. Burada, elastik fiberlerin parmak izi spektrumları; liyofilize elastin ve elastin karşıtı bir antikor kullanılarak işaretlenmiş immünofloresan boyalı kriyokesitlerle karşılaştırılarak yerli dokular içinde tanımlanmıştır. Ancak, Elastin'in Raman Spektrumlarına da yansıyan yüksek bir otofloresansa sahip olması nedeniyle, otofloresans gibi örneğe özgü özelliklerden kaynaklanan sistematik hataları azaltmak için veri analizi zorlayıcıdır ve veri setlerinin uygun şekilde işlenmesi kritik önem taşımaktadır.Veri analizinde, saf elastin proteininin belirgin şekilde daha yüksek olan sinyal yoğunluğunu ortadan kaldırmak ve karşılaştırılabilir Raman spektrumları elde etmek için normalizasyon kullanılmıştır. Elastin, vücuttaki en stabil hücre dışı matriks proteinlerinden biridir ve bu nedenle yıkımı oldukça zordur.Sağlıklı porsin aort kapakçıklarında elastik yıkım, enzimatik sindirim gerçekleştirilerek indüklenmiş ve çok değişkenli analiz (PCA) uygulanarak enzimatik olarak işlem görmüş örneklerin Raman spektrumları ile doğal kontroller arasında anlamlı farklar belirlenmiştir. Bu spektral farklar, yükleme spektrumunda 861, 1003 ve 1.664 dalga sayılarında gözlemlenmiştir; elastaza uzun süre maruz kalma nedeniyle elastin içeren liflerde beklenen yapısal değişiklikler, burada gösterilen daha belirgin ve ayrılabilir skor kümelerine yansımıştır. Bu kümeler, doğal doku içindeki işlem görmüş elastik lifler ile işlem görmemiş kontrol grubu arasındaki karşılaştırmanın skorlarıdır. Beklenen bu yapısal değişiklikler, işlem görmemiş kontrol ile elastin entegre eden enzim olan elastaza 30 dakika boyunca maruz bırakılan doku örneklerinin karşılaştırıldığı bu ek görüntüde, boyanmış porsin aort kapakçıklarında da açıkça görülmektedir.Bu teknik, hücre ve matriks biyolojisinin yanı sıra rejeneratif tıp ve doku mühendisliği alanındaki araştırmacıların yalnızca gerçek zamanlı hücre fenotip analizi yapmalarına değil, aynı zamanda doğal bir ortamda Z iki boyutundaki kritik hücre-hücre ve hücre-matriks etkileşimlerini belirlemelerine de olanak sağlar.

non-contact-label-free-monitoring-cells-extracellular-matrix-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Etiket lignin bitki hücre duvarlarında görselleştirme ve farklı dokuları, numune veya türlerin lignification karşılaştırılması sağladığını konfokal Raman mikroskobu dayalı bir yöntem sunulmaktadır.

Etiket- In situ</emBitki Hücre Duvarlar Lignification> Görüntüleme

Biz ultrafast tüm optik anahtarlama floresan sinyallerine karşı Raman izole etmek için kullanan bir karmaşık doğrusal olmayan optik sistem inşası ve işletilmesi tartışacağız. Bu sistemi kullanarak, başarılı bir darbe enerjileri ve biyolojik olarak güvenli kalır ortalama yetkileri kullanan, Raman ve floresan sinyalleri ayrı edebiliyoruz.

Rezonans ve spontan Raman Microspectroscopy Floresan Arkaplan reddi

Nanoyapılı substratları hareketsizleştirilmiş proteinler ve aptamerlerle arayüzleyen nano-biyolojik sistemlerin üretimini ve karakterizasyonunu tanımlıyoruz. Nanoyapılı substratların litografik üretimi, biyo-işlevselleştirme ve yüzey geliştirilmiş Raman spektroskopisi (SERS) karakterizasyonunu içeren ilgili deneysel adımlar rapor edilmiştir. Yüzeyde hareketsizleştirilmiş proteinlerin SERS tespiti ve protein-ligand ve aptamer-ligand bağlanmasının araştırılması gösterilmiştir.

Yüzey EBL Fabrikasyon Nanostructured Alt Tabakalar Kullanma biyomoleküllerin Raman Spektroskopisi Algılama Geliştirilmiş

Arası hücresel iletişim içinde ve hücre dışında çeşitli fizyolojik aktiviteleri kontrol edilmesi için çok önemlidir. Bu kağıt tek hücre salgılarının uzay-zamansal yapısını ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır. Bunu başarmak için, bir multidisipliner bir yaklaşım canlı hücre görüntüleme ile algılama etiket içermeyen nanoplasmonic entegre olan kullanılır.

Tek Hücre Salgıları uzay-zamansal Görüntüleme için bir etiket içermeyen Tekniği

Bu yazıda, SRS deneysel kurma işleminin lazer tarama mikroskobu ile entegrasyonu ile elde edilen, stimüle edilen Raman saçılma (SRS) mikroskobu uygulaması açıklanmıştır. SRS mikroskobu iki femtosaniye (FS) lazer kaynakları, bir TI-safir (TI: sa) ve senkronize optik parametrik osilör (OPO) dayanmaktadır.

Stimululated Raman saçılma dayalı doğrusal olmayan mikroskop uygulanması

Bu protokol, tek hücreli çözünürlüğe ulaşabilen entegre bir Raman spektroskopi-kütle spektrometresi (MS) platformu sunar. Raman spektroskopisi ilaçlara hücresel yanıt çalışma için kullanılabilir, MS ilaç alımı ve metabolizma hedefli ve kantitatif analizi için kullanılabilir iken.

Tek Hücreli İlaç Alımı, Metabolizması ve Etkileri Üzerine Entegre Raman Spektroskopisi ve Kütle Spektrometresi Platformu

Uyarılmış Raman saçılma (SRS) mikroskopisi, spesifik kimyasal moieties'in seçici, etiketsiz görüntülenmesini sağlar ve lipit moleküllerini in vivo olarak görüntülemek için etkili bir şekilde sunulmuştır. Burada, SRS mikroskopi prensibine kısa bir giriş sağlıyoruz ve Caenorhabditis elegans'talipid depolama görüntülemede kullanımı için yöntemleri açıklıyoruz.

Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskopisi Kullanılarak Caenorhabditis elegans Lipid Depolama Dinamiklerinin Etiketsiz Görüntülenmesi

Bu çalışmada, etiketsiz canlı hücre biyogörüntülemesini göstermek ve iki bakteri suşunu tespit etmek için uygun biyouyumluluğa sahip, düşük maliyetli, yüzeyde geliştirilmiş Raman saçılımı (SERS) tabanlı bir parmak izi nanoprobu geliştirdik ve canlı hücrelerin SERS spektrumlarının tahribatsız bir yöntemle nasıl elde edileceğini ayrıntılı olarak gösterdik.

Au@Carbon noktalı nanoproblara dayalı etiketsiz yüzeyde geliştirilmiş Raman saçılma biyoanalizi

Bu protokol, canlı insan meme kanseri hücrelerinin etiketsiz, non-invaziv fenotiplemesi için Raman spektroskopisi ve tomografik faz mikroskobunu birleştiren multimodal bir yaklaşım sunar. Hızlı, kantitatif morfo-kimyasal analiz için kullanıcı dostu, insan yanlılığı içermeyen bir analiz hattı içerir ve kanser araştırmaları ve hücre biyolojisindeki uygulamalarla ayrıntılı moleküler ve yapısal bilgiler sağlar.

Canlı Etiketsiz Meme Kanseri Hücrelerinin Fenotiplemesini Geliştirmek için Multimodal Bir Görüntüleme Çerçevesi

Kompakt ve ultra stabil bir çift kırma interferometresine dayanan geniş alanlı Fourier dönüşümlü mikroskobu, 2D dedektörün tüm pikselleri için paralel spektrum elde edilmesini sağlar. Zaman alanı yaklaşımı, fotolüminesans ve Raman sinyallerinin çözülmesini sağlar ve ~1-μm uzaysal ve 23-cm-1 spektral çözünürlükle hızlı Raman eşlemesi (~5 ms/piksel) sağlar.

Multimodal Geniş Alanlı Fourier Dönüşümlü Raman Mikroskobu

Öğrenin, Raman spektroskopisi ile hücre ve dokuları temassız, etiketsiz izleme yöntemini. Bu teknik, biyokimyasal bileşime dayalı spektral parmak izleri oluşturarak canlı örneklerin çok değişkenli analizini sağlar.

Raman Spektroskopisi kullanarak Hücreler ve Ekstrasellüler Matriks Temassız, Etiket ücretsiz izleme

Daha fazla video keşfet