Paralel Konfokal Mikroskop kullanarak birden fazla Hücre Kinetik Veri Kazanılması A Daha hızlı, Yüksek Çözünürlük, MTPA-GFP tabanlı Mitokondrial Füzyon Deneyi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, paralel olarak birden fazla hücrenin yüksek çözünürlüklü 3D görüntülerinde mitokondriyal füzyonu ölçmektir. Bu, ilk önce ilgilenilen hücrelerde mitokondriyal foto fotoable, GFP'nin eksprese edilmesiyle elde edilir. Daha sonra, GFP, her hücredeki mitokondriyal popülasyonun küçük bir bölgesinde foto aktive edilir.

Daha sonra, mitokondriyal füzyonun derecesini değerlendirmek için sinyal dengesine ulaşılana kadar her 15 dakikada bir her hücrenin altı optik bölümü toplanır, sonuçta mitokondri hedefli foto aktivatın seyreltilmesi, floresan sinyalinin nicelleştirilmesine dayalı olarak mitokondriyal füzyon geçiren hücrelerde GFP yoğunluğu değerlendirilebilir. Bu tekniğin temel avantajı, otomatik olması ve bu nedenle birden fazla hücrenin yüksek çözünürlüklü verilerinin daha hızlı toplanabilmesidir. Bu yöntem INS one hücreleri kullanılarak gösterilecek ve diyabet hakkında bilgi sağlayacak olsa da, yaşlanmanın yanı sıra metabolik ve nörodejeneratif hastalıklarda mitokondriyal füzyonun tamamını incelemek için diğer hücre tiplerine de uygulanabilir.

Görüntüleme otomasyonu adımları başka bir yerde açıklanmadığı için bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. INS bir hücreyi% 80 birleşmeye kadar kültürledikten sonra, kültürleri% 0.05 tripsin ile ayırın ve yeniden süspanse hücreleri üst poli de lizin kaplı kapak kayma tabanlı görüntüleme plakalarına yerleştirin. İki günlük kültürden sonra, plakalara mitokondriyal matriks hedefli adenoviral foto aktive GFP ekleyin.

Daha sonra hücreleri 24 saat kültürledikten sonra, ortamı değiştirin ve hücrelerin iki gün daha büyümesine izin verin. Görüntüleme gününde, görüntüleme plakalarına yedi ila 15 nano molar TMRE ekleyin ve kültürleri en az 45 dakika dengeleyin. Bu süre zarfında,% 5 karbondioksiti, inkübatörü ve mikroskop dengelendikten sonra mikroskobu açın.

Edinme sekmesi altında, manuel araçları göster'e tıklayın. Görüntüleme kurulum panelini açın ve ardından kanal modunu seçin ve geçiş yapın. Işık yolu panelindeki her kareyi izleyin.

LSM ve kanal modunu seçin. Ardından, yukarı doğru çalışan numune simgesinden panelin altındaki arka MBS six 90 plus ve MBS 4 88'i seçin, parlak alan veya DIC kanallarının görselleştirilmesini etkinleştirmek için TPMT'yi kontrol edin. GFP boyası aralığını 490 ila 540 nanometre ve TMRE boyası için 580 ila 700 nanometre olarak ayarlayarak ışık yolu parametrelerini ayarlamayı bitirin.

Son olarak, çekim modunu açın ve çerçeve boyutunda 512 x 512 piksellik bir tarama alanı ayarlayın, menüleri aşağı çekin ve ortalama sayı menüsünde ortalama dört x elde edin. Şimdi objektif bir lens kullanarak, halojen ışıkla hücrelere odaklanın. İğne deliğini maksimuma kadar açın ve parlak yeşil fotoğraf aktivat GFP ifade hücrelerini bulmak için tarayın.

Rastgele bir lazer gücü fotoğrafı seçin, hücreyi etkinleştirin ve ardından aktivasyonun yeterli olup olmadığını görmek için içinden bir Z serisi optik kesit alın. Ardından, iyi bir sinyal-gürültü oranı sağlamak için dedektör kazancını tamamen maksimize etmeden görüntüleme 488 nanometre lazerini düşük bir güce ayarlayın. Sinyalin doygun olmadığından emin olduktan sonra, fotoğraf etkinleştirme GFP sinyalinin TMRE sinyali ile birlikte lokalize olduğunu onaylayın.

Son olarak, iğne deliğini açın ve dedektördeki kazancı artırın ve ardından GFP ifade hücresinde yeni bir fotoğraf aktivasyonu bulun ve yakınlaştırma faktörünü belirtin. Ardından, altı dilim toplamak ve görüntüleme yöntemini kaydetmek için Z serisi aralığını ayarlayın. Şimdi sol paneldeki çok zamanlı pencereyi açın.

Kaydetme panelini seçin ve dosyaların kaydedileceği konumu belirtmek için görüntü klasörü seç'e tıklayın. Ardından, alım panelinde, yeni kaydedilen görüntüleme yöntemini seçin Tarama yapılandırması açılır menüsünde. Ardından, Z yığınının işaretli Z ortasını seçin.

Şimdi bloklar panelini açın ve her konumda tek bir blok seçin. Ardından, ölçülecek her aralık için blok ekle'ye tıklayın, zamanlama panelini açın, ağırlık aralığını seçin ve ardından yalnızca ilk konumdaki bloktan önceki ağırlık aralığına sıfır yazın. Konum panelini seçtikten sonra, konumlar arasındaki konumu yüklemek için odağı hareket ettir'i seçin ve LO'ya veya sonraki LO'ya geçtiğinde yükleme tarama yapılandırmasını seçin Konumları düzenle listesinin altında, tümünü temizle'yi seçin ve ardından birden fazla konum seçin Ağartıcı panelinin altındaki motorlu sahne, ağartma kutusuna tıklayın ve yapılandırma açılır menüsünde yapılandırma dosyasını belirleyin.

Ardından ana yazılımın ağartma penceresinde, uygun fotoğraf aktivasyon yöntemini bölge paneline kaydedin. Bu belirli hücre için yatırım getirisini seçin ve mevcut bölgeyi yatırım getirisi listesi penceresine ekle'yi seçerek bu yatırım getirisini çok kez ekleyin. ROI açılır menüsünde aynı konumu seçtiğinizden emin olun.

Son olarak, zaman içinde izlenecek 10 hücrenin her biri için aşağıdaki sırayı gerçekleştirin. İlk olarak, bir hücre bulurken, konum panelinde sahne konumunu belirtin ve edinme panelinde özel tarama yapılandırma yöntemini belirtin. Tüm bloklar için tarama yapılandırmasını belirttiğinizden emin olun.

Ardından ana bölgeler panelinde, fotoğrafın etkinleştirileceği ilgilenilen bölgeyi seçin. Ardından, çamaşır suyu panelinde, ROI'yi kaydedin ve ROI penceresine yükleyin. Ardından ana bölgeler penceresindeki ROI'yi silin ve taramayı sıfırlayın.

Bire yakınlaştırın, son olarak bir sonraki hücreyi bulun ve yakınlaştırmayı ayarlayın. Sonraki dokuz hücre için işlemi tekrarladıktan sonra, her aşama konumunun ve tüm blokların uygun tarama konfigürasyonuna sahip olduğunu ve her konumdaki ilk bloğun uygun fotoğraf etkinleştirme yöntemine karşılık geldiğini, geri kalanının ise sahte bir yöntem içerdiğini kontrol edin. Ardından, foto aktivat GFP sinyalinin çoğunlukla kırmızı TMRE sinyaliyle birlikte lokalize olduğu hücreler için çalıştır'ı seçin.

Fotoğraf etkinleştirme GFP görüntülerindeki arka planı çıkarın, ardından ortalama yoğunluğu bildirmek için bölge ölçümlerini yapılandırın. Ardından, ZS yığınının her dilimi için verileri bir Excel dosyasına aktarın. Sinyali olmayan düzlemleri atladıktan sonra, her bir zaman noktasının ZS yığın yoğunluğunu ilk foto ile etkinleştirilen yoğunluğa bölün ve INS bir hücredeki orijinal sinyalin yüzdesini elde edin.

Mitokondriyal füzyonun dengesine ulaşılana kadar bir saat boyunca her 15 dakikada bir sinyal yoğunluğunda önemli bir azalma meydana gelir. Tipik bir mitokondriyal füzyon testi sırasında her 15 dakikada bir ölçülen altı optik bölümün bu yansıtılan görüntülerinde gösterildiği gibi. Bu tahlillerde, foto aktivat GFP foto aktivasyonunu hedeflemeye yardımcı olmak ve hücre sağlığını izlemek için çok düşük bir TMRE konsantrasyonu kullanılır.

Hücrenin fotonun neredeyse tamamen kolokalizasyonunun yeşil renkte GFP'yi ve kırmızı renkte TMRE sinyallerini aktive ettiğini ve boyaların cos boyamasının mitokondrinin aktif olduğunu ve düşük milimolar konsantrasyonlarda depolarize olmadığını gösterdiğini unutmayın. Palmitat mitokondriyi parçalar ve mitokondriyal füzyonu inhibe eder. Bu nedenle, palmitat ile muamele edilmiş bir hücrenin bu optik bölümlerinde görüldüğü gibi, mitokondri parçalanır ve matris hedefli foto aktivat GFP'nin sinyal yoğunluğu, önceki şekilde gösterildiği gibi normal koşullar altında olduğu kadar değişmemiştir.

Bu nedenle, bu şekilde görülen fotoaktivat GFP sinyalinin seyreltilmesinin fisyondan ziyade mitokondriyal füzyondan kaynaklanması muhtemeldir Bu yöntemi kurarken, bir sinyali sürdürmek için GFP'yi yeterince fotoaktif hale getirmek için GFP ve TMRE kokalize hücrelerini seçmeyi unutmayın, ancak mitokondriyal füzyon olaylarını kaçırmamak ve tüm mitokondriyal hacminizi optik bölümler içinde toplamak için çok fazla değil Mitokondriyal ağlara ne olduğunu belirlemek. Belirli düzenleyici proteinlerin veya sinyal moleküllerinin yokluğunda, bu test, genlerin susturulduğu veya hücrelerin çeşitli ajanlarla tedavi edildiği bir dizi deney grubunda çalıştırılabilir. Mitokondriyal füzyonu ölçme ve parametreleri istatistiksel olarak analiz etme yeteneği, hastalık durumlarında mitokondriyal dinamiklerin incelenmesine izin verir ve terapötik tedavilerin geliştirilmesini sağlar.