Karbon Fiksasyon Potansiyel bir Kimyasal Tabakalı Antarktika Gölü ve Ölçme Mikrobiyal Ökaryotik Zenginleştirme Kültürlerinin Kurulması

Bu prosedürün genel amacı, Antarktika'daki Bonnie Gölü'nden protist zenginleştirme kültürleri üretmek ve metabolik çeşitlilik için başlangıç bir göstergenin parçası olarak karbon fiksasyonunu ölçmektir. Bu işlem, öncelikle Bonnie Gölü'nde protistlerin ve fitoplanktonların bilinen pik noktalarına karşılık gelen göl suyu derinliklerinden örnekleme yapılarak gerçekleştirilir. Göl suyu örnekleri daha sonra çeşitli büyüme ortamlarına inoküle edilir ve sıcaklık düzenleyici ile ışıklarla donatılmış bir büyüme kabininde dört ila altı hafta boyunca inkübe edilir.

Kültürler, ihtiyaç duyulduğunda dört derece Celsius'ta taşınabilir. Bir sonraki adım, zenginleştirme kültürlerinden ham hücre lizatlarının ekstrakte edilmesidir. Bu prosedürün son adımı, ribuloz bir beş bisfosfat karboksilaz oksijenaz veya Rubisco aktivitesi için bir radyoizotop analizi kullanarak hücre lizatındaki karbon fiksasyon potansiyelini değerlendirmektir.

Sonuç olarak, pro zenginleştirme kültürleri, doğal protist topluluğundaki karbon fiksasyon potansiyelinin değişkenliğini göstermektedir. Bu yöntem, göl mikrobiyal ekolojisine ilişkin temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Örneğin, katmanlı Antarktika göllerinde karbon döngüsünün çeşitli aşamalarında mikrobiyal ökaryotların rolü gibi.

Zenginleştirme kültürlerinin sonraki nesilleri için su sütunu örneklemesi sık kullanılan bir teknik olsa da, bu yöntem, öngörülemeyen komplikasyonların meydana gelebileceği aşırı soğuk bir ortamda çalışmak üzere modifikasyonlar içermektedir. Bu yöntemle ilgili fikri ilk kez, Redisco analizini doğal göl örneklerinde test etmenin yollarını düşünürken geliştirdim. Örnekleme alanlarının birçok araştırmacı için yabancı bir ortamda olması nedeniyle örnekleme adımlarını hayal etmek zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır.

Örnekler, Antarktika'daki McMurdo kuru vadilerinde bulunan ve kalıcı olarak buzla kaplı çok sayıdaki gölden biri olan Bonnie Gölü'nden toplanır; su kolonundan örnekleme yapmadan bir gün önce, örnekleme sahası seçilir ve hazırlanır. Bu işlem, sondaj ve buz deliği eritme nedeniyle oluşan bozulmanın ardından su kolonunun tabakalı katmanlarının yeniden oluşmasını sağlayacaktır. Su kolonuna erişebilmek için sondaj sahasının konumu GPS ile belirlenir.

Bir Jiffy Ice auger'ı, matkabın delikte donmasını önlemek için dört inçlik bir Jiffy uzatma mili ve kesici uca takarak buz üzerinde bir delik açmakla başlayın. Delme işlemini, su sütununun üst kısmının yaklaşık dört ila altı inç üzerinde durdurarak sıvı suya girmekten kaçınmaya çalışın. Numune alımı için matkap deliği, altı inçlik çapından iki fite kadar genişletilmelidir.

Bu işlem, bakır bir boru deliğinden ısıtılmış polietilen glikol sirküle eden bir sıcak deniz model deliği eritici kullanılarak gerçekleştirilir. Eritme işlemi genellikle su kolonundan örnekleme yapılmadan önceki gün, 18 saate kadar sürer. Gerekli tüm ekipmanların ve örnek saklama kaplarının örnekleme sahasında hazır olduğundan emin olun.

Örnekleme malzemeleri arasında beş ila 10 litre kapasiteli bir NICU şişesi, derinlik kalibrasyonlu kabloya sahip bir vinç, her örnekleme derinliği için yeterli sayıda örnek şişesi, bir haberci ağırlık ve örneklerin taşınması için soğutucular yer alır. Göl suyu filtrasyonu örnekleme gününde tamamlanması gerektiğinden, örneklemeye günün erken saatlerinde, yaklaşık saat 05:00'te başlayın. Kalibre edilmiş bir el vincine bağlı bir kin örnekleyici kullanın.

Bu çalışma için istenilen derinliklerden bir ila beş litre arasında su numuneleri toplayın. Numune alma derinlikleri, buz deliğindeki PI simetrik su seviyesinden itibaren ölçülen altı metre, 15 metre ve 18 metredir. Göl numunelerini soğutucularda saklayın ve numune alma alanından saha laboratuvarına nakledin.

A TV ünitesine bağlı bir kızak kullanılarak örnekler saha laboratuvarında işlenmeli veya stabilize edilmelidir. Örnekleme işleminin hemen ardından, örnekler saha laboratuvarına taşındığında zenginleştirme kültürlerinin üretimine başlanmalıdır. 0,5 ile bir litre göl suyu, 47 milimetrelik 0,45 mikron gözenek boyutuna konsantre edilmelidir.

Hafif filtrasyon kullanarak POLİETER sülfon filtreler uygulayın. Doğal topluluğun çeşitliliği isteniyorsa, ikinci bir örneği 47 milimetre, 0,45 mikron gözenek boyutuna filtreleyin.

POLİETERSülfon filtreleri sıvı azot içerisinde hızlıca dondurun. Her bir filtreyi, filtrenin alındığı aynı örnekleme derinliğinden toplanmış yaklaşık 20 mililitre filtrelenmiş göl suyu içeren 50 mililitrelik steril falcon tüplere aktarın.

Farklı kültür ortamlarında zenginleştirme yapmak için hücre süspansiyonunu 25 santimetrekarelik steril bir hücre kültürü flaskına aktarın. Her örnekleme derinliği için birden fazla tekrar hazırlayın. Her bir kültür flaskını sırasıyla bold basil, medium, BG 11 ve F two kültür ortamlarının 50 x steril çözeltileri ile takviye edin.

Karışık atrofik organizmaların kültürlenmesi gerekiyorsa, iki adet F iki takviyeli kap hazırlayın ve gönderimden önce, ABD laboratuvarına gönderilmek üzere, düşük sıcaklıkta ve düşük radyans değerinde, sıcaklık kontrollü bir büyüme inkübatöründe en az dört hafta boyunca inkübe kültür erlenlerinden birine iki ila üç tane steril pirinç tanesi ekleyin. Zenginleştirme kültürlerini steril 50 mililitrelik Falcon tüplerine aktarın. Nakliye talebinde "dondurmayın" ve "serin tutun" şeklinde sevkiyat gereksinimlerini belirtin. ABD'ye ulaştığında, her bir zenginleştirme kültüründen beş mililitreyi, 125 mililitrelik bir kap içindeki 45 mililitrelik uygun büyüme ortamına aktarın.

Steril bir süngerle kapatılmış steril erlen may flask. Zenginleştirme kültürlerini, sıcaklığı kontrol edilen, dört derece santigrat derecenin altında olan bir çevresel büyüme odasında sabit kültürler olarak muhafaza edin ve her 30 günde bir taze medyuma aktarım yapın. Hücre lizat ekstraksiyonu prosedürüne başlamak için, beş litre zenginleştirme kültürünü hafif vakum kullanarak 25 milimetrelik bir watman GFF filtre üzerinden süzün.

Ardından, filtreyi steril çelik makasla dört ila beş bölüme ayırın. Daha sonra, parçaları steril pens yardımıyla, beşte biri oranında 0.1 millimeter çaplı çözelti ile doldurulmuş iki mililitrelik vidalı kapaklı tüpe aktarın.

Zirkonya silika boncuklar. Tüpe 1,25 mililitre filtre ekstraksiyon tamponu ekleyin ve ardından mini bead beader boncuğu kullanarak 48 hız ayarında 30 saniye boyunca hücreleri parçalayın, ardından bir dakika boyunca buzda bekletin. Numunenin ısınmasını önlemek için, her bead beating işlemi arasında bir dakikalık buz inkübasyonları uygulayarak 32. bead beating işlemini iki kez daha tekrarlayın ve ardından santrifüjleyin.

Filtre süspansiyonunu 4 °C'de 3000 ×g'de iki dakika boyunca santrifüjleyin. GFF filtre lifleri ve hücre duvarı kalıntılarından oluşan gevşek bir pelet oluşturun. Peletten 200 µL miktarında bir kısım alın ve 800 µL buz gibi soğuk %90 asetona daldırın.

Kalan süpernatantı 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ekstraktif klorofil A miktarını, spektrofotometre ile 664 nanometre ve 647 nanometre dalga boyu değerlerinde ölçün. Kalan süpernatantı 4 °C'de, 15.000 ×g hızla iki dakika boyunca santrifüjleyin.

Çözünmeyen hücre zarı peletinden ve kalan GFF filtre liflerinden kaçınarak S'yi temiz bir 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpüne aktarın. Bu çözünür hücre lizatı, şimdi bir sonraki adımda gösterilecek olan rubis karboksilaz aktivite analizinde kullanılabilir. Bu analize başlamak için, her bir çözünür lizattan 125 mikrolitre, buz üzerinde soğutulmuş 1,5 vidalı kapaklı mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Negatif kontrol örnekleri için, 1,5 mililitrelik vidalı kapaklı mikrosantrifüj tüpüne 125 µL çözünür lizat ekleyin ancak substrat eklemeyin. Daha sonra tüm örnekler ve negatif kontroller için çift paralel reaksiyonlar gerçekleştirin. 10 mL analiz tamponu hazırlayın, taze olduğundan emin olun ve buz üzerinde soğutun.

Tüm örnekler ve negatif kontroller için yeterli miktarda assay tamponunu beş mililitrelik bir tüpe ekleyin. Buradan itibaren tüm adımlar bir çeker ocak altında gerçekleştirilmelidir. Belirlenen tampona C 14 işaretli sodyum bikarbonat ekleyin ve tamponu buz üzerinde tutun.

C 14 içeren analiz tamponundan 10 µL alın ve bir mL analiz tamponu içerisinde seyrelterek ters çevirerek karıştırın. Karıştırmak için, seyreltilmiş karışımdan 100 µL'yi bir sintilasyon tüpündeki üç mL bios safe two sintilasyon sayım kokteylinin üzerine ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin. C 14 sayımlarını Beckman LS 6, 500 sayıcı ile ölçün; analize devam etmeden önce sintilasyon sayımları dakikada 18, 000 sayımın üzerinde olmalıdır.

Analiz tamponuna yeterli miktarda C 14 işaretli sodyum bikarbonat eklendiğinde, reaksiyon tüplerini 25 °C'ye önceden ayarlanmış kuru banyoya taşıyın ve üç ila beş dakika inkübe edin. Ardından, lizatlara 100 µL analiz tamponu ekleyin ve 25 °C'de beş dakika inkübe edin. Beş dakika sonra, her örneğe ribuloz bifosfat ekleyin ve reaksiyonun 25 °C'de beş ila 10 dakika boyunca ilerlemesini sağlayın.

Reaksiyonu durdurmak için 100 µL %100 probiyotik asit ekleyin; bağlanmamış C 14'ü uzaklaştırmak için 2000 ×g'de bir saat boyunca santrifüjleyin. Son olarak, örneklerin toplam hacmini, üç mL bios. Safe iki sintilasyon sayım kokteyli içeren sintilasyon şişelerine aktarın ve asit stabil dakikadaki sayımı belirleyin.

Sintilasyon sayımı ile uç ürünler belirlenmiştir. Antarktik Bonnie Gölü'nden üç farklı derinlikten yeni soğuk uyumlu fototrofik ve miksatrofik protistleri izole etmek için zenginleştirme kültürü kullanılmıştır. Daha geniş bir organizma çeşitliliğini seçmek için çeşitli büyüme ortamı türleri kullanılmıştır: Bold'un minimal ortamı, BBMF iki si, deniz ortamı ve BG 11 ortamı.

Bu tabloda gösterilen besin konsantrasyonu ve fotosentetik olarak aktif radyasyon veya PAR, örnekleme anındaki koşulları temsil etmektedir. Zenginleştirme kültürlerinin ışık mikroskopu ile görsel incelemesi, çoğu hücredeki klorofil pigmentinin varlığının gösterdiği üzere, kültürlerin fototrofik protistler tarafından domine edildiğini ortaya koymuştur. Kültürler ayrıca, inokülumun alındığı örnekleme derinliğine ve kültürde kullanılan besiyeri türüne bağlı olarak çeşitli hücre morfolojileri barındırmıştır.

Karbon fiksasyonuna dair bir gösterge olarak, rubis enzimi tarafından katalize edilen karboksilaz aktivitesinin maksimum hızları zenginleştirilmiş kültürlerde ölçülmüştür. Burada gösterildiği üzere, fototrof protist biyokütlesinin bir tahmini olarak potansiyel klorofil a bolluğu da izlenmiştir.

Tüm kültürlerin aynı sıcaklık ve ışık rejimi altında yetiştirilmesine rağmen, karbon fiksasyon potansiyeli ve fototrofik biyokütle zenginleştirme kültürleri arasında çarpıcı farklılıklar göstermektedir. Maksimum rubis O aktivitesi, BBM medyumunda büyüyen dört ve altı numaralı zenginleştirme kültürleri ile BG 11 medyumunda büyüyen 13 ve 14 numaralı zenginleştirme kültürlerinde gözlemlenmiştir. Buna karşılık, F iki büyüme medyumunda zenginleştirilen 1921 ve 23 numaralı kültürler, dört ila 34 kat daha düşük maksimum karboksilaz aktiviteleri sergilemiştir.

Karboksilaz aktivitesi klorofil a bazında ifade edildiği için bu farklar, F iki kültürlerindeki daha düşük biyokütle seviyelerinden kaynaklanmamaktaydı. Ayrıca, Pearson korelasyon analizi, rubis co aktivitesinin klorofil a konsantrasyonu ile korelasyon göstermediğini ortaya koymuştur. Altı metre ve 15 metreden alınan göl suyu ile inoküle edilen BBM kültürleri.

Zenginleştirme çalışmasının beşinci forumu en yüksek klorofil A seviyelerine sahipken, diğer tüm kültürler rubis enzim aktivitesinden bağımsız olarak nispeten düşük klorofil a sergilemiştir. Uzmanlaşıldığında, göl örnekleme tekniklerinin uygulanması yaklaşık iki saat sürer. Alınan örnek sayısına bağlı olarak, doğru şekilde uygulandığında karboksilaz analizi de iki saat sürer. Bu prosedürün ardından, heterotrofların hangi derinlikte bulunduğuna dair ek soruları yanıtlamak için heterotrofik enzim aktivite analizi gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Tamam, bu videoyu izledikten sonra göl örneklerinin nasıl toplanacağı, üretimi artırmak için nasıl zenginleştirileceği ve rubis karboksilaz aktivitesi için nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.