Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Yüksek throughput Kristalizasyon için bir robot kullanımı

Merhaba, Membran Yapısal ve Fonksiyonel Biyoloji Grubu'na hoş geldiniz. Benim adım Martin Caffery. Bu, in meso veya lipidik kübik faz yöntemini kullanarak yapı tayini için membran proteinlerini kristalleştirme üzerine hazırlanan JoVE makaleleri serisinin bir diğer parçasıdır.

İlk makalede, JoVE 1 7 1 2, protein yüklü kübik fazın nasıl hazırlandığını ve viskoz ve yapışkan misa fazının kristalizasyon denemeleri için cam sandviç plakalara manuel olarak nasıl dağıtıldığını göstermiştik. Bu video makale, bir in meso kristalizasyon robotu kullanma yöntemlerini açıklayacaktır. Bir robot; hız, doğruluk, hassasiyet, minyatürleştirme ve karanlıkta veya düşük sıcaklıklarda olduğu gibi rahatsız edici koşullar altında uzun süreler boyunca çalışabilme avantajlarını sunar.

Robotlar, uygun şekilde kullanıldıklarında membran protein yapısı ve fonksiyonu araştırmalarının üretkenliğini büyük ölçüde artırabilirler. Bu video makalesinde, ticari olarak mevcut üç robotun kullanımını gösteriyoruz. İlk robot, membran yapısal ve fonksiyonel biyolojisi grubu tarafından geliştirilmiştir ve birinci referansta ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Diğer ikisi yakın zamanda erişilebilir hale gelmiş olup, eksiksizlik adına buraya eklenmiştir. Kristalizasyon denemesini robotik olarak gerçekleştirmek için kristalizasyon plakası hazırlığı, referansta detaylıca açıklanan cam sandviç kristalizasyon plakasının taban plakasının hazırlanmasıyla başlar; taban plakası önce silanize edilmeli ve kuyucukları oluşturan delikli çift taraflı yapışkan ara parçası plakaya uygulanmalıdır. Bunun için gereken malzemeler burada gösterilmiştir.

Bunlar; cam bir kristalizasyon taban plakası, delikli çift çubuklu bir ara parçası, kristalleştirme çözeltisi, bir rulo veya brayer, kağıt mendiller ve bir beher içerisinde ultra saf suyu içerir. Plaka, tezgah üzerindeki bir kağıt havlu üzerine yerleştirilir. Birkaç damla kristalleştirme çözeltisi uygulanır ve ardından bir kağıt mendil ile plaka yüzeyine eşit şekilde dağıtılır.

Plaka, bir beher dolusu suyun içine tamamen daldırılarak fazla silanlama çözeltisinden arındırılır. Plaka beherden çıkarılır ve kuru bir kağıt havlu üzerine yerleştirilir. Silanlanmış tarafı yukarı gelecek şekilde konumlandırılır ve açıkta kalan yüzey, kağıt havlularla hafifçe silinerek kurutulur.

Ardından, delikli çift yapışkanlı ara parçanın koruyucu kapağı çıkarılır ve ara parça, cam plakanın silize edilmiş yüzeyine uygulanır. Ara parçanın, sol üst köşesi ile ara parça ve plakanın birbirine komşu iki kenarı çakışacak şekilde taban plaka üzerine doğru konumlandırılması önemlidir. Ara parçayı taban plaka üzerine düzleştirmek ve aralarında sıkı bir sızdırmazlık oluşturmak için bir merdane veya brayer kullanılır.

Parantez içinde, referanslar bölümünde açıklandığı üzere, delikli ayırıcılarla birlikte siloize plakaların ticari olarak mevcut olduğunu belirtmek isteriz. Kristalizasyon taban plağını hazırladıktan sonra, in meso robotunun kurulumuna ve kullanımına geçiyoruz. Aşağıda belirtildiği üzere, üç farklı in meso robotunun kullanımını gösteriyoruz.

Gösterilen tüm durumlarda robotlar, bu videoda tanıtılan ilk in meso robotu olan meso robot one ile birlikte 20 °C'ye ayarlanmış sıcaklık kontrollü bir odada kurulmuş ve kullanılmıştır. Makale, PI'nin laboratuvarında geliştirilmiştir ve şu anda ticari olarak mevcuttur. Tüm detaylar referanslar bölümünde bulunabilir.

Bir kristalizasyon denemesinin robotik olarak kurulması için gerekli olan malzemeler ve ekipmanlar burada gösterilmiştir. Bunlar arasında bir laboratuvar defteri, Jo of Article 1 7 1 2'de açıklandığı gibi taze hazırlanmış ve bir Hamilton şırıngasında saklanan protein yüklü çözeltiler, ara parçaları olan silikonize taban plakaları ve uygun örtü camları, su şişesi ve mendiller ile in miso robotu yer almaktadır.

İlk görünüm, robotun güvertesinin boş halidir. Sonraki görünüm ise robotun nemlendirici park istasyonu, kristalizasyon taban plakası ve çöktürücü çözeltiler içeren derin kuyucuk bloğu ile birlikte tamamlanmış halidir. Kuruluma, taban plakasını robotun güvertesine yerleştirerek başlıyoruz.

Taban plakası hizalaması amacıyla kuyu konumlarının belirgin şekilde işaretlendiği kendisine ait bir platformu vardır. Plaka, tanımlama amacıyla net bir şekilde etiketlenmelidir. Çöktürücü çözeltileri içeren 96 kuyucuklu blok, robotun güvertesinde kristalizasyon plakasının yanındaki kendi platformuna sabitlenmiştir.

Plastik tavan kapağı dikkatlice soyularak blok açılır. Nemlendiriciden gelen nem akışı, robotun güvertesindeki taban plakasının üzerine ve boyunca akacak şekilde yönlendirilir. Robotun kurulumu gerçekleştirilir. Robot, üretici talimatları takip edilerek başlatılır.

Kesin protokoller zamanla değişeceği için bunu burada ayrıntılı olarak göstermeyeceğiz. Temel olarak başlatma sırasında gerçekleşen işlem, robottaki dozajlama koluna x, Y ve Z olmak üzere üç dik yönde referyal konumların sağlanmasıdır. Ardından, dozajlama iğnesiyle birlikte protein yüklü meza fazı içeren bir Hamilton şırıngası, robotun birinci koluna takılır; meza fazının ve şırınganın nasıl hazırlanacağına dair tüm ayrıntılar JoVE Makale 1 7 1 2'de ve referans birde açıklanmıştır. Dozajlama şırıngasının iğne ucu, artık kristalizasyon plakasının sol üst köşesindeki en üstteki kuyucuğun altına ve merkezine hizalanmalıdır. Bu durum, ilk işlem olarak A1 kuyucuğu tanımlayıcısının A1 kuyucuğunun tabanıyla hizalanmasına karşılık gelir.

Bu işlem, iğne ucunun kuyucuk tabanına ne kadar yaklaştığı gözlemlenirken, dağıtım kolunun yüksekliği veya Z koordinatı ayarlanarak gerçekleştirilir. Ucun kuyucuk tabanına tam olarak değip değmediği, dağıtım kolunun yüksekliği çok hafifçe ayarlanırken plakanın platform üzerinde elle yanlara doğru hareket ettirilmesiyle belirlenebilir; iğne ucunun plakaya temas ettiği dağıtım kolu Z koordinatı bilgisayara girilir. Dağıtım işlemi, iğne ucunun, taban plakasının yüzeyine karşılık gelen bu referans Z konumundan birkaç mikrometre yukarıda olduğu şekilde programlanır. Ardından robot, iğne ucunu A1 kuyucuğunun merkezine konumlandırmak için kullanıcı tarafından yönlendirilen bir dizi adımı gerçekleştirmek üzere etkinleştirilir.

Ucun merkezlendiği dağıtıcı kolun referans XY koordinatları, robotu kontrol eden bilgisayarda saklanır. Bu koordinatlar, plaka üzerindeki kalan kuyucukların merkezini tanımlamak için kullanılır. Bu referans koordinatları bilgisayarda ayarlandıktan sonra, dağıtıcı kola başlangıç konumuna dönmesi talimatı verilerek şırınga hazırlanır.

Dağıtım şırıngası şimdi önceden doldurulmalıdır. Bu işlem, taze mease ile dağıtım iğnesinin dolmasını ve plaktaki ilk kuyucuğun tam miktar mease almasını sağlamak için yapılır. Robotu çalıştıran programda, aktivasyonu başlatan bir ön doldurma komutu bulunmaktadır.

Siringdeki pistonun kullanıcı kontrolünde kademeli olarak ilerlemesini sağlar. Bu işlem gerçekleşirken, iğne ucunda hava kabarcığı çıkıp çıkmadığı kontrol edilir ve çıkan hava bir peçete ile temizlenir. Bu, robotun çalıştırılmasından önceki hazırlama (priming) sürecini tamamlar.

Robot artık otomatik modda çalışmaya ve deneyi başlatmaya hazırdır. Robot XAP programı, robotun ikinci kolundaki çöktürücü dağıtma uçlarının yıkandığı ve derin kuyucuk bloğundan çöktürücü çözeltileri aspire etmek için hazırlandığı bir dizi yıkama adımını başlatır. Robot üzerindeki dağıtma fonksiyonunun etkinleştirilmesiyle, önce sekizerli kuyucuklara protein yüklü mease'in, ardından teslimatlar arasında çöktürücü çözeltilerin sıralı olarak yüklenmesi işlemi başlar. Mease dağıtma kolu, uçtaki mease'in kurumasını önlemek için iğnenin ucunun nemli bir süngere yerleştirildiği park konumuna geri döner.

Membran. Yapısal ve Fonksiyonel Biyoloji grubu tarafından gerçekleştirilen kristalleştirme denemelerinde en yaygın olarak kullanılan değerler, 50 nanolitre protein ve 800 nanolitre çöktürücü çözeltidir. Bu gösterimdeki robotu çalıştıran program, iki kolun aynı anda hareket edeceği şekilde ayarlanmıştır.

Bu sayede, 96 kuyucuklu bir plakanın ölçüm maddesi ve çöktürücü ile doldurulması işlemi beş dakika içinde tamamlanabilir. Plaka doldurulur doldurulmaz ve robot kolları park konumlarına döner dönmez, plaka robot platformundan alınarak düz ve sabit bir yüzeye yerleştirilir.

Bir lamel, ara parçanın üstteki yapışkan yüzeyiyle temas edecek şekilde taban plakasının üzerine nazikçe yerleştirilir. Tüm 96 kuyucuğun tamamen kaplandığından, lamelin taban plakasınınla kare şeklinde hizalandığından ve lamelin hiçbir kısmının taban plakasının izdüşümünün dışına taşmadığından emin olmak önemlidir. Lamel ile ara parça arasında sıkı ve üniform bir sızdırmazlık oluşturmak için bir rulo veya brayer kullanılır.

Kurulumun beklendiği gibi gerçekleştiğinden emin olmak için bu aşamada plaka incelenmelidir. Aranan görüntü, tavada kızarmış bir yumurta görünümüdür. Her kuyucukta, yumurtanın sarısı meza fazına karşılık gelir.

Yumurta akı çöktürücü çözeltidir ve tavanın kenarı ise kristalleşmenin çevresidir. İdeal olarak, bu üçü eş merkezlidir. Plaka artık kristal büyümesi için sıcaklık kontrollü bir saklama alanına yerleştirilmeye hazırdır.

Eğer başka plaka kurulmayacaksa, çöktürücü blok robotun platformundan çıkarılmalı, uygun şekilde mühürlenmeli ve tekrar depolama alanına konulmalıdır. Ölçü aparatını içeren şırınga robotun dağıtım kolundan çıkarılmalı; dağıtım iğnesi ve ferrül dahil olmak üzere çeşitli parçalarına ayrılmalıdır. Metanol ile dikkatle yıkanmalı ve Meso robot iki mosquito LCP'nin bir sonraki kullanımı için kurutulmalıdır.

Sıradaki video klip, in meso kristalleştirme deneylerinin kurulumunda kullanılabilen mosquito LCP robotunu göstermektedir. Bu robot, bu makalede daha önce açıklanan meph faz dağıtım sistemine benzer bir sistem içerir. Ancak, birinci robot için çöktürücü, tek kullanımlık uçlar kullanılarak dağıtılır.

Cihazın kendisi burada gösterilmektedir. Cihaz, nem kontrolü için pencereli bir hazne üzerinde kristalleşme plağının ve çöktürücü bloğun yerleştirildiği bir platform içerir. Bu görünümde, nem haznesindeki pencereler açılmıştır; dispenser uçlarının bulunduğu bir makara, bir ölçüm dozajlama kolu ve faz dozajlama iğnesinin konumunu belirlemek için kullanılan lazer tabanlı bir sensör görülmektedir.

Kristalleşme plakasının üzerine yerleştirildiği yükseltilmiş bir platform ve çöktürücü tarama bloğunu tutmak için alçaltılmış bir platform bulunmaktadır. Bu dizide, robot, cihaz açıldığında bir başlatma eylemleri dizisinden geçmiştir. Programlama yazılımı, cihazı belirli kristalleşme plakaları ve çöktürücü bloklarla çalışacak şekilde ayarlamak ve belirlenen bir sırada set hacimlerinde karışım ve çöktürücü dağıtmak için kullanılır.

Bu tür ayrıntılar üretici tarafından sağlanmaktadır ve burada gösterilmeyecektir. Robot kullanılarak bir kristalizasyon plağının hazırlanması şu şekilde başlar: İğnesi takılı ve protein yüklü mease ile doldurulmuş bir Hamilton şırıngası, yukarıda "in meso robot one" başlığı altında ve JoVE 1 7 1 2'de açıklandığı şekilde hazırlanır. Şırınga, robotun dağıtım kolunun altındaki konumuna sabitlenir.

Dağıtıcı şırıngadaki iğnenin X ve y koordinatları, platforma monte edilmiş lazer sensörü kullanılarak belirlenir. Bu, kristalleştirme plakasındaki her kuyucuğun merkezine mease'nin doğru şekilde dağıtılmasını sağlamak için gereken önemli bir adımdır. Kontrol panelindeki bir düğmeye basılarak, şırınga mease'yi iğne ucundan dışarı atacak şekilde hazır hale getirilir.

Robotu, kristalizasyon plakası robot tablasına yerleştirilmeden önce kuyucukları doldurmak için kullanmaya hazırlanırken, taşan medya bir peçete yardımıyla temizlenir. Plakanın sabit kalmasını sağlamak için platform yüzeyi birkaç damla su ile nemlendirilir. Kapiler etkiyle koruyucu kapak plakadan çıkarılır ve iyi bir yapışma sağlamak için plaka platformuna sıkıca yerleştirilir.

Plaka üzerindeki üç köşe kuyucuğun merkezlendiği platformda üç adet referans noktası (fiducial) bulunmaktadır; plakanın dağıtım iğne ucuyla uyumlu şekilde doğru konumlandırılmasını sağlamak için cihaz artık bir kurulum döngüsüne girmeye hazırdır. Bu işlem, taze mease ile plakayı doldurma aşamasına geçmeden hemen önce, mease'in küçük bir cam plaka üzerine dağıtıldığı ikinci bir hazırlama (priming) adımıyla başlar. Bu dizide, robotun önce plaka üzerindeki sekiz kuyucuktan oluşan dikey bir sütunu mease ile doldurduğunu ve ardından tek kullanımlık uçları kullanarak mease bolusunun üzerine çöktürücü çözelti dağıttığını görüyoruz.

Bu işlem, tüm kuyucuklar dolana kadar plaka boyunca 11 kez tekrarlanır. Tüm sürecin tamamlanması yaklaşık beş dakika sürer. Bu videoda, her bir kuyucuğa 50 nanolitre Mease ve 800 nanolitre çöktürücü çözelti dağıtılmıştır.

Doldurulmuş plaka, tezgah üzerine yerleştirilmiş robotun platformundan çıkarılır. Örtü camı uygulanır ve plaka, Meso Robot 1 bölümünde yukarıda açıklandığı gibi bir braket ile mühürlenir. Uygun şekilde etiketlenmiş plaka, kristal büyümesi için Meso Robot 3'teki Griffin LCP sıcaklık kontrollü ortamına yerleştirilebilir.

Bu son video klip, in meso kristalizasyon deneylerinin kurulumunda kullanılan Griffin LCP robotunu göstermektedir. Griffin, robot bir için yukarıda açıklanan meph faz dağıtım sistemine benzer bir sistem içermektedir. Ancak bu durumda, 96 çöktürücü çözeltinin tamamı eş zamanlı olarak dağıtılır.

Cihazın kendisi burada gösterilmektedir. Cihaz, kristalleştirme plakası ve çöktürücü bloğun yerleştiği bir platform, bir ölçümleme dağıtım kolu ve bir Phoenix 96 uç başlığı içerir. Çöktürücü solüsyonların dağıtımı için robotun çalışması, bu son video sekansında gösterilmektedir.

96 uçlu başlığa önce çöktürücü çözelti yüklenir. Viskoz çöktürücülerin aspirasyonunu kolaylaştırmak için kullanıcı tanımlı bir geciktirme süresi sağlanır. MEA fazı, tamamlanması yaklaşık bir dakika süren bir işlemle 96 kuyucuğa sırasıyla dağıtılır.

Son olarak, 96 uçlu başlık, 96 çöktürücü çözeltisinin tamamını kristalleştirme kuyucuklarındaki MEA faz boluslarının üzerine aynı anda dağıtır. Tüm plaka doldurma işlemi iki dakika içinde tamamlanır. Doldurulan plaka robotun platformundan alınır, bir lam ile kapatılarak mühürlenir ve kristal büyümesi için kontrollü sıcaklık koşulları altında saklamaya alınır.

Makromoleküler kristalografi yoluyla yapı tayini genel sürecindeki sonraki adımlar; kristallerin toplanması ve kriyojenik olarak soğutulması ile bunlardan elde edilen x-ışını kırınım verilerinin kaydedilmesi ve işlenmesidir. Bu konular, bu serideki ayrı iş makalelerinde ele alınmıştır.I.