Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Yüksek throughput Kristalizasyon için bir robot kullanımı

Merhaba ve Membran Yapısal ve Fonksiyonel Biyoloji Grubuna hoş geldiniz. Benim adım Martin Caffery. Bu, in mezo veya lipik kübik faz yöntemi kullanılarak yapılandırılmış belirleme için kristalleşen membran proteinleri üzerine bir dizi JO makalesinden bir diğeridir.

İlk makale olan JoVE 1 7 1 2'de, protein yüklü kübik fazın nasıl hazırlandığını ve viskoz ve yapışkan misa fazının kristalizasyon denemeleri için manuel olarak cam sandviç plakalara nasıl dağıtıldığını gösterdik. Bu video makalesi, bir mezo kristalizasyon robotu kullanma yöntemlerini açıklayacaktır. Bir robot, hız, doğruluk, hassasiyet minyatürleştirme ve karanlıkta veya düşük sıcaklıklarda olduğu gibi rahatsız edici koşullar altında uzun süre çalışabilme avantajları sunar.

Robotlar, doğru kullanıldığında, zar protein yapısı ve işlev araştırmasının verimliliğini büyük ölçüde artırabilir. Bu video makalesinde, piyasada bulunan üç robotun kullanımını gösteriyoruz. İlk robot, membran yapısal ve fonksiyonel biyoloji grubunda geliştirildi ve referans birde ayrıntılı olarak açıklandı.

Diğer ikisi yakın zamanda kullanıma sunuldu ve eksiksiz olması için buraya dahil edildi. Kristalizasyon plakasının hazırlanması Kristalizasyon denemesi yapmak için robotik olarak cam sandviç kristalizasyon plakasının taban plakasının hazırlanması ile başlar, taban plakasına göre ayrıntılı olarak tarif edilen kristalizasyon plakası önce silolanmalı ve kuyucukları oluşturan delikli çift çubuklu ara parça plakaya uygulanmalıdır. Bunun için gerekli malzemeler burada gösterilmektedir.

Bunlar arasında bir cam kristalizasyon taban plakası, delikli bir çift çubuklu ara parça haline getirme solüsyonu, bir rulo veya brayer kağıt mendil ve bir UE su kabı bulunur. Plaka, bir tezgah üstü üzerinde bir kağıt havlu üzerine yerleştirilir. Birkaç damla sessiz çözelti uygulanır ve daha sonra bir kağıt mendil ile plaka yüzeyine eşit olarak dağıtılır.

Plaka, bir su kabına tamamen daldırılarak fazla laştırıcı çözeltiden yıkanır. Plaka beherden çıkarılır, kuru bir kağıt havlu üzerine yerleştirilir. Silolaşmış yüzü yukarı bakacak şekilde ve açıkta kalan yüzeyi kağıt havlu ile hafifçe silinerek kurutulur.

Daha sonra, delikli çift çubuklu ara parça üzerindeki koruyucu kapak çıkarılır ve ara parça, cam plakanın silolanmış yüzeyine uygulanır. Ara parçanın, sol üst köşe ve ara parçanın iki bitişik tarafı ve plaka çakışacak şekilde taban plakasına düzgün bir şekilde yerleştirilmesi önemlidir. Taban plakasındaki ara parçayı düzleştirmek ve aralarında sıkı bir sızdırmazlık oluşturmak için bir silindir veya brayer kullanılır.

Parantez içinde, delikli ara parçalarla tamamlanmış silo plakalarının, referans bölümünde açıklandığı gibi ticari olarak mevcut olduğunu not ediyoruz. Kristalizasyon taban plakasını hazırladıktan sonra, iç mezo robotun kurulumuna ve kullanımına geçiyoruz. Aşağıda belirtildiği gibi, mezo robotlarda üçünün kullanımını gösteriyoruz.

Gösterilen tüm durumlarda robotlar, bu videoda gösterilecek olan ilk mezo robot olan mezo robot birde 20 santigrat dereceye ayarlanmış sıcaklık kontrollü bir odada kurulur ve kullanılır. Makale, PI'nin laboratuvarında geliştirilmiştir ve şu anda ticari olarak mevcuttur. Tüm detaylar referans bölümünde bulunabilir.

Robotik olarak bir kristalizasyon denemesi yapmak için gereken malzemeler ve ekipman burada gösterilmektedir. Bunlar arasında, Madde 1 7 1 2'deki Jo'da anlatıldığı gibi taze hazırlanmış ve bir Hamilton şırıngasına yerleştirilmiş bir laboratuvar defteri, protein yüklü bir bez bulunmaktadır. Ara parçalar ve uygun kapak camı, su şişesi ve mendiller ve miso robotu ile silolanmış taban plakaları.

İlk görünüm, güvertesi açık olan robotun görüntüsüdür. Bir sonraki görünüm, nemlendirici park istasyonu, kristalizasyon taban plakası ve çökeltici çözeltiler içeren derin kuyu bloğu ile tamamlanmış robotun görüntüsüdür. Taban plakasını robotun güvertesine yerleştirerek kuruluma başlıyoruz.

Taban plakası hizalaması amacıyla kuyu konumları ile açıkça işaretlenmiş kendi platformuna sahiptir. Plaka, tanımlama amacıyla açıkça etiketlenmelidir. Çökeltici çözeltiler içeren 96 kuyulu blok, kristalizasyon plakasının yanındaki robotun güvertesinde kendi platformunda sabitlenir.

Blok, plastik tavan kapağı dikkatlice soyularak açılır. Nemlendiriciden gelen nem akışı, robotun güvertesindeki taban plakasının üzerinden ve üzerinden akacak şekilde yönlendirilir Robotun kurulması. Robot, üreticinin talimatları izlenerek başlatılır.

Bunu burada herhangi bir ayrıntıyla göstermeyeceğiz, çünkü kesin protokoller zaman içinde değişecektir. Esasen başlatma sırasında olan şey, robot üzerindeki mease dağıtım kolunun, x, Y ve Z olmak üzere üç ortogonal yönde referans pozisyonları ile sağlanmasıdır.Daha sonra, dağıtım iğnesi ile tamamlanmış bir Hamilton şırıngasındaki protein yüklü meza fazı, robotun bir koluna takılır Meza fazının ve şırınganın nasıl hazırlanacağına dair tüm ayrıntılar, Madde 1 7 1 2'nin Jo'sunda açıklanmıştır ve referans birde, Dağıtım şırıngasının iğne ucu şimdi kristalizasyon plakasının sol köşesindeki en üst kuyunun alt ve merkezi ile hizalanmalıdır. Bu, kuyu tanımlayıcısı A'ya karşılık gelir, biri kuyunun dibi ile hizalanır, biri ilk iş sırası olarak.

Bu, iğne ucunun kuyunun dibine ne kadar yaklaştığını izlerken dağıtım kolundan sonra yüksekliği veya Z koordinatını ayarlayarak yapılır. Ucun sadece kuyunun dibine değdiği, plakayı platform üzerinde elle bir yandan diğer yana hareket ettirerek değerlendirilebilirken, dağıtım kolunun yüksekliğini çok az bir şekilde ayarlarken, ucun plakaya temas ettiği dağıtım kolunun Z koordinatı bilgisayara girilir dağıtım, bu referans Z konumundan birkaç mikrometre uzaklıktaki iğne ucu ile gerçekleşecek şekilde programlanmıştır, Bu, taban plakasının yüzeyine karşılık gelir. Robot daha sonra, kullanıcı tarafından iğnenin ucunu A kuyusunun ortasına yerleştirmesi istenen bir dizi adımdan geçmek üzere etkinleştirilir.

Ucun ortalandığı dağıtım kolunun referans XY koordinatı, robotu kontrol eden bilgisayarda saklanır. Plaka üzerinde kalan kuyucukların merkezini tanımlamak için kullanılır. Bu referans koordinatlarını bilgisayarda ayarladıktan sonra, mease dağıtım koluna, şırıngayı hazırlayarak başlangıç konumuna geri dönmesi talimatı verilir.

Dağıtım şırıngası şimdi astarlanmalıdır. Bu, taze şekerlemenin dağıtım iğnesini doldurmasını ve plakadaki ilk kuyucuğun tam kusurunu almasını sağlamak için yapılır. Programda robotu aktif hale getiren bir hazırlama komutu vardır.

Şırıngadaki pistonun kullanıcı kontrolü altında adım adım ilerlemesine neden olur. Bu olurken iğnenin ucu incelenerek mease görünümü elde edilir ve ekstrüde meza fazı bir doku ile çıkarılır. Bu, robotu çalıştıran astarlama işlemini tamamlar.

Robot artık otomatik modda çalışmaya hazırdır ve koşuyu başlatır. Robot XAP programı, robotun ikinci kolundaki çökeltici dağıtım uçlarının yıkandığı ve robot setleri üzerinde dağıtım fonksiyonunu etkinleştiren derin kuyu bloğundan çökeltici çözeltileri aspire etmek için hazırlandığı bir dizi yıkama adımı başlatır, protein yüklü kuyuların sıralı yüklenmesi bir seferde ilk sekiz kuyuyu bozar, ardından teslimatlar arasında hızlı çözümler. Tıraş dağıtma kolu, uçtaki aşındırıcının kurumasını önlemek için iğnenin ucunun nemli bir süngere yerleştirildiği bir park konumuna geri döner.

En yaygın olarak, membranda gerçekleştirilen kristalizasyon denemelerinde kullanılan değerlerdir. Yapısal ve fonksiyonel biyoloji grubu 50 nanolitre mease ve 800 nanolitre çökeltici çözeltidir. Bu gösteride robotu çalıştıran program, iki kolun aynı anda hareket edeceği şekilde ayarlanmıştır.

Bu şekilde, 96 kuyulu bir plakanın mease ve presantant ile yüklenmesini beş dakika içinde tamamlamak mümkündür. Hemen plaka doldurulur ve robot kolları park pozisyonlarına geri döner. Plaka, robotun güvertesinden çıkarılır ve düz sağlam bir yüzeye yerleştirilir.

Bir kapak camı, ara parçanın üst yapışkan yüzeyi ile temas edecek şekilde taban plakasının üzerine nazikçe yerleştirilir. 96 kuyunun tamamının tamamen kaplandığından, kapak camının taban plakası ile kare şeklinde hizalandığından ve kapak camının hiçbirinin taban plakasının ayak izinin ötesine uzanmadığından emin olmak önemlidir. Kapak camı ile ara parça arasında sıkı ve düzgün bir sızdırmazlık oluşturmak için bir rulo veya brayer kullanılır.

Kurulumun olması gerektiği gibi gittiğinden emin olmak için plaka bu aşamada incelenmelidir. Aranan şey, tava görünümünde kızarmış bir yumurtadır. Her kuyucukta, yumurtanın boyunduruğu meza fazına karşılık gelir.

Yumurtanın beyazı çökeltici çözeltidir ve tavanın kenarı kristalleşmenin çevresidir. İdeal olarak, üçü eş merkezlidir. Plaka artık kristal büyümesi için sıcaklık kontrollü bir depolama alanına yerleştirilmeye hazırdır.

Daha fazla plaka kurulmayacaksa, çökeltici blok robotun güvertesinden çıkarılmalı, uygun şekilde kapatılmalı ve tekrar depoya konulmalıdır. Mease içeren şırınga, robotun dağıtım kolundan çıkarılır, dağıtım iğnesi ve yabani hayvan dahil olmak üzere çeşitli parçaları sökülür. Metanol ile dikkatlice yıkanır ve bir sonraki Kullanım için hazırlık olarak kurutulur: Meso robot iki sivrisinek LCP'de.

Bu sonraki video klip, mezo kristalizasyon denemelerinin kurulumunda kullanılabilecek sivrisinek LCP robotunu göstermektedir. Bu makalede daha önce açıklanana benzer bir meph fazı dağıtım sistemi içerir. Bununla birlikte, robot bir için, çökeltici tek kullanımlık uçlar kullanılarak dağıtılır.

Enstrümanın kendisi burada gösterilmektedir. Kristalizasyon plakasının ve çökeltici bloğun nemin kontrolü için pencereli bir oda oluşturduğu bir güverte içerir. Bu görünümde, nem odasındaki pencereler, dağıtım uçları olan bir makara, bir mease dağıtım kolu, meph fazı dağıtım iğnesinin yerini belirlemek için lazer tabanlı bir sensör açılmıştır.

Kristalizasyon plakasının, çökeltici elek bloğunu tutmak için batık bir platform üzerine oturduğu yükseltilmiş bir platform. Bu dizide, robot, cihaz açıldığında bir başlatma eylem dizisinden geçtiğini gördü. Programlama yazılımı, cihazı belirli kristalizasyon plakaları ve çökeltici bloklarla çalışacak şekilde ayarlamak ve belirli bir sırayla ayarlanan hacimlerde kırıcı ve çökeltici dağıtmak için kullanılır.

Bu tür ayrıntılar üretici tarafından sağlanır ve burada gösterilmeyecektir. Bir kristalizasyon plakası oluşturmak için robotun kullanılması şu şekilde başlar: İğne ile tamamlanmış ve protein yüklü mease ile doldurulmuş bir Hamilton şırıngası, yukarıda aşağıda mezo robot birinde ve 1 7 1 2'nin Jo'sunda anlatıldığı gibi hazırlanır. Şırınga, robotun dağıtım kolunun altındaki yerine kenetlenir.

Dağıtım şırıngası üzerindeki iğnenin X ve y koordinatları, güverteye monte lazer sensörü kullanılarak belirlenir. Bu, yumuşatıcının kristalizasyon plakası üzerindeki her bir kuyucuğun merkezinde doğru bir şekilde dağıtılmasını sağlamak için gerekli olan önemli bir adımdır. Kontrol panelindeki bir düğmeye dokunulduğunda, şırınga iğnenin ucundan kalıntıyı dışarı atacak şekilde hazırlanır.

Ekstrüde edilmiş tortu daha sonra, kristalizasyon plakasını robotun güvertesine monte etmeden önce kuyuları yüklemek için robotu kullanmaya hazırlık olarak bir doku ile çıkarılır. Plakayı yerinde tutmak için platformun yüzeyi birkaç damla su ile nemlendirilir. Kılcal damar ile koruyucu kapak plakadan çıkarılır ve iyi bir yapışma sağlamak için plaka platformuna sıkıca yerleştirilir.

Platform üzerinde, plakanın dağıtım iğnesi ucuna göre uygun şekilde konumlandırılmasını sağlamak için üç köşe kuyusunun yakında ortalandığı üç referans vardır, cihaz artık bir kurulum döngüsüne girmeye hazırdır. Bu, plakayı taze mease ile yüklemeye geçmeden hemen önce Mease'in küçük bir cam plaka üzerine dağıtıldığı ikinci bir hazırlama adımıyla başlar. Bu sırada, robotun önce plaka üzerinde sekiz kuyucuktan oluşan dikey bir sütun olan mease ile yüklendiğini ve ardından mease bolusunun üzerine çökeltici çözelti dağıtmak için tek kullanımlık uçları kullandığını görüyoruz.

Bu işlem, tüm kuyucuklar dolana kadar plakanın uzunluğu boyunca 11 kez tekrarlanır. Tüm sürecin tamamlanması yaklaşık beş dakika sürer. Bu özel videoda, her bir kuyucuğa 50 nanolitre Mease ve 800 nanolitre çökeltici çözelti dağıtıldı.

Doldurulan plaka, bir tezgah üzerine yerleştirilen robotun platformundan çıkarılır. Kapak camı uygulanır ve plaka, yukarıda miso robot one'da anlatıldığı gibi bir sütyen ile kapatılır. Düzgün bir şekilde etiketlenmiş plaka artık Meso robot üç, Griffin LCP'de kristal büyümesi için sıcaklık kontrollü bir ortama yerleştirilebilir.

Bu son video klip, Griffin LCP robotunun mezo kristalizasyon denemelerinde kullanıldığını gösteriyor. Griffin, robot için yukarıda açıklanana benzer bir meph fazı dağıtım sistemi içerir. Bununla birlikte, bu durumda, 96 çökeltici çözeltinin tümü aynı anda dağıtılır.

Enstrümanın kendisi burada gösterilmektedir. Kristalizasyon plakasının ve çökeltici bloğun oturduğu bir güverte, bir mease dağıtım kolu ve bir Phoenix 96 uç kafası içerir. Çökeltici çözeltilerin dağıtılması için, robot bu son video sekansında hareket halindeyken gösterilmektedir.

96 uçlu kafa önce çökeltici çözelti ile doldurulur. Viskoz çökeltilerin aspire edilmesini kolaylaştırmak için kullanıcı tanımlı bir gecikme sağlanmıştır. MEA fazı, tamamlanması yaklaşık bir dakika süren bir işlemle 96 kuyuya sırayla dağıtılır.

Son olarak, 96 uçlu kafa, kristalizasyon kuyularındaki MEA faz boluslarının üzerine aynı anda 96 çökeltici çözeltinin tümünü dağıtır. Tüm plaka yükleme işlemi iki dakika içinde tamamlanır. Doldurulan plaka robotun güvertesinden çıkarılır ve plaka bir kapak camı ile kapatılır ve kristal büyümesi için kontrollü sıcaklık koşulları altında depoya yerleştirilir.

Makromoleküler kristalografi ile genel yapılandırılmış belirleme sürecindeki bir sonraki adımlar, kristalleri hasat etmek ve kriyo soğutmak ve bunlardan x-ışını kırınımını kaydetmek ve işlemektir. Bu konular, bu serideki ayrı iş makalelerinde ele alınmıştır.