Kantitatif Spor Analizi İş Akışı

Bu prosedürün amacı, genom çapında kantitatif mikrobiyal kültür uygunluklarını paralel olarak, hassas ve yüksek verimli bir şekilde belirlemektir. Bu işlem, öncelikle 96 kuyucuklu plaklarda mikrobiyal koloni dizi kütüphanesi oluşturularak ve kültürün doygunluğa ulaşana kadar büyütülmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, doygun kültürler su ile seyreltilir ve katı agar plakalara damlatılır.

Ardından, katı agar plaklarının fotoğrafları, mikrobiyal koloni büyümesi doygunluğa ulaşana kadar periyodik olarak çekilir. Son olarak, her kültürün büyümesine ait zaman serisi fotoğrafları hücre yoğunluğunun nicel ölçümlerine dönüştürülür; gözlemlenen büyüme eğrileri, büyüme modelleri ve mikrobiyal fitness'ın nicel ölçümleri ile birlikte özetlenir. Nihayetinde, mikrobiyal suşların farklı mutasyonlarla birleştirildiğinde veya farklı koşullar altında büyütüldüğünde farklı fitness değerlerine sahip olduğunun gösterilmesi yoluyla genetik etkileşimlere kanıt sunan sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, SGA veya barkodlu rekabet deneyleri gibi yüksek yoğunluklu sabitleme yöntemleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, fitness ölçümlerinin daha doğru olmasıdır. Bu yöntem, kanser ilaç geliştirme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, DNA hasarına yanıt ve hücre döngüsü kontrolünde hangi genlerin ve süreçlerin önemli olduğu, bu tür araştırmaların ve temel mikroorganizmaların insan kanser hücrelerinde potansiyel ilaç hedefleri şeklinde anlaşılması ve dönüştürülmesi gibi. Bu yöntem, telomer fonksiyonu ve görünümleri hakkında bilgi sağlayabilse de.

Bu yöntem, maya biyolojisinin diğer alanlarına veya fitness fenotiplerinin mikrobiyal biyoloji hakkında içgörü sağlayabileceği herhangi bir alana da uygulanabilir. QFA'nın, dizi kütüphaneleri mevcut olan birçok diğer mikrobiyal organizmaya uygulanabilmesini umuyoruz. Örneğin, povi e coli, orilla surplus. Doygun gece kültürlerinden başlanarak, 200 µL hacmindeki zengin sıvı besiyerinde 96 bağımsız maya suşu hazırlanmıştır.

96 kuyucuklu bir kültür kabında, önce %100 ethanol içine daldırıp ardından alevle sterilize ederek ve soğumaya bırakarak, bir sekiz inç çapındaki manuel replika plater için 96'lı pini sterilize edin. 96 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına 200 µL steril su ekleyin; vortexlenmiş doymuş maya kültürlerini, sterilize edilmiş pin aracını suşların içine üç kez daldırarak seyreltin. Ardından, pini bir kez su içeren plakaya daldırın, pin aracını tekrar sterilize edin ve seyreltilmiş kültürlere üç kez daldırmadan önce soğumasını bekleyin. Son olarak, pini katı agar plakasına transfer edin.

Agar plaklarını inkübe ettikten sonra, otomatik kültürleme için onları manuel olarak görüntülemek üzere bir s and p robotics SP imager kullanın. Katı agar üzerinde büyütülen bağımsız maya suşlarından oluşan dikdörtgen bir dizi ile başlayın. Bu örnekte başlangıç suşları, sıcaklığa duyarlı bir sorgu mutasyonunun maya delesyon koleksiyonu ile çaprazlanması sonucunda elde edilmiştir.

384 bağımsız maya suşunun dört tekrarını temsil eden 1.536 kültür, 96 pinli, bir milimetre pin çaplı steril pin araç transferi yapan bir robot kullanılarak SGA plaklarında büyütülür; 1.536 suşun 384 tanesi, 200 µL seçici besiyeri içeren 4 adet 96 kuyucuklu kültür plakasına aktarılır ve kültürler doygunluğa ulaşana kadar 20 °C'de büyütülür. Doygun maya kültürlerini spotlamak için, öncelikle kültürler bir sıvı taşıma robotuna aktarılarak manyetik bir çalkalayıcı üzerinde yeniden süspande edilir; ardından steril 96 pinli robotik pin aracı kullanılarak 200 µL steril su içerisine pinleme yapılır ve kültürler yaklaşık 1:70 oranında seyreltilir.

Pin aracı temizlenip sterilize edildikten sonra, seyreltilmiş kültürleri agar plaklarına nokta şeklinde aktarın. 384 kuyucuklu formatta olan plakları, otomatik karusel ve erişim kapağına sahip, sıcaklık kontrollü ve nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. Kültürlerin görüntülenmesi için; plakları inkübatörden tekrar tekrar çıkaran, kapaklarını alan, 35 milimetrelik bir kameranın altındaki tekdüze aydınlatılmış bir alana aktaran ve 5.184 x 3.456 çözünürlükte görüntü alan robotik bir otomatik görüntüleme sistemi kullanın.

Pixel resolution kapağı yerine takar, ardından plakalardaki kültür konumlarını ve uygulanan işlemleri takip etmek için onları inkübatör carousel'ine geri yerleştirir. Plakalar; inkübatör adına, sıcaklığa, benzersiz ardışık parti numarasına ve inkübatördeki konumuna göre otomatik olarak barkodlanır. Görüntü isimleri, plaka adı ve zaman damgasının birleşiminden oluşur ve görüntü yakalama işlemiyle birlikte otomatik olarak oluşturulur.

Robot carousel'leri arasında aktarım yapılırken plakaların aynı sırada kalmasını sağlamak için genellikle plakalar manuel olarak da etiketlenir. Metaveri dosyaları, manuel olarak oluşturulan sekmeyle ayrılmış metin dosyalarıdır. Deney açıklama dosyası FT iki.

Tablo bir her deneye özgüdür, ancak kütüphane açıklaması FT üç, tablo bir kapsamlı bir şekilde yeniden kullanılabilir. Deney oluşturulduktan sonra, barkod veya otomatik olarak oluşturulmuş plaka adı, deney başlangıç zaman damgası, plaka işlemi, katı agar ortam içeriği, tarama adı, çoklu plakalara sahip kütüphaneler için kütüphane plaka numarası ve 1.536 kuyucuk formatından 384 kuyucuk formatına ölçeklendirme için tekrar kuadrant numarası sütunlarını içeren deney açıklama dosyası FT iki tablo bir içinde tanımlanır. E suşu kütüphanesi, her kültür konumunda yetiştirilen genotipi belirten bir kütüphane açıklama dosyası FT üç, tablo bir ile tanımlanmıştır.

Kütüphanenin her bir plakası; dört sütun, kütüphane adı, ORF, plaka numarası, plaka satır-sütunu ve isteğe bağlı bir notlar sütunu içerir. Taranan suşların tanımlanması için, her bir sistematik ORF numarasıyla ilişkili standart gen adını açıklayan isteğe bağlı bir standart gen adı dosyası (FT dört, tablo bir) sağlanabilir. Bu dosya, verilerin analizi için ORF ve gen adı olmak üzere iki sütun içerir.

QFA hesaplama iş akışı, üzerine kurulum yapılmış makul düzeyde güçlü, çok çekirdekli bir bilgisayar iş istasyonuna erişim gerektirir. Her ikisi de çevrimiçi olarak belgelenmiş olan Colonizer görüntü analiz yazılımı aracı ve QFAR paketi ücretsiz olarak sunulmaktadır ve çeşitli işletim sistemlerinde çalışmaktadır. Yakalanan her bir plaka görüntüsünü girdi olarak kullanarak Colonizer'ı çalıştırın; bu işlem, yakalanan her görüntü için bir Colonizer çıktı dosyası (FT beş, tablo bir) oluşturur. Colonizer çıktı dosyaları kültür yoğunluğu tahminlerini, kültür alanını, şeklini ve rengini belirtir.

Görüntü plakasındaki 384 konumun her biri için, çıktı dosya adı kaynak görüntü dosya adından otomatik olarak kopyalanır. QFAR paketi, gözlemlere genelleştirilmiş lojistik popülasyon modellerini uydurmak ve grafiğe dökmek için her bir kültürün zaman seyri verilerini seçen fonksiyonlar içerir. Örnekler için şekil iki ve üçe bakınız.

Uyumlanmış parametre değerleri QFA lojistik parametre dosyalarına yazılır. QFAR paketi ayrıca kalite kontrol için fonksiyonlar da içerir. Plaka kenarlarındaki besinlerin daha fazla bulunması ve görüntü analizindeki zorluklar nedeniyle kenar kolonileri elenir.

Plak duvarlarının yakınındaki ve SGA'dan geçemeyen kültürler ile tarama spesifik marker genleri ile bağlantı gösteren genotipler analizden çıkarılır. Her bir kültür için lojistik popülasyon model parametrelerinden çeşitli kantitatif uygunluk ölçümleri elde edilir. Bunlar, her bir tekrarlı kültür seti ve her bir uygunluk tanımı için maksimum popülasyon iki katlanma hızlarını ve inokülasyondan doygunluğa kadar olan bölünme sayısını içerir.

Kondisyon tahminlerine ilişkin çeşitli özet istatistikler hesaplanır: ortalama ve medyan kondisyon, kondisyon standart sapması ve gözlemlenen replika sayısı. Özet istatistikler, daha sonraki analizler için QFA kondisyon özet dosyaları FT sekiz, tablo bir'e aktarılır. Örneğin, genetik etkileşim skorlarının hesaplamaları FT dokuz tablo bir'dir.

Bu şekil, 384 QFA üzerinde logaritmik ölçekte gösterilen tipik bir büyüme eğrisini göstermektedir. Katı agar üzerinde 20 °C'de büyüyen kültürler colonizer ile nicellendirilmiş olup, hücre yoğunluğundaki artış yaklaşık iki gün sonra ilk kez tespit edilebilmektedir. Bu gecikme, muhtemelen katı besiyerine inokülasyon sonrası kültür lag fazı ile hücre yoğunluğu için geçerli olan alt tespit sınırının birleşik etkisidir.

Burada, tek bir plakadan 308 benzer büyüme eğrisi elde edilmiştir. Düz bir çizgi oluşturan suşların oldukça hasta veya ölü olduğunu unutmayın. Bu şekil, genetik etkileşim güçlerini belirlemek için iki genom çapındaki QFA taramasının karşılaştırılmasını göstermektedir.

QFAR paketi ayrıca, önceki büyüme eğrisi şeklini oluşturmaya ve incelenen genotiplerin sıralanmış listelerini ve genetik etkileşim gücü tahminlerini çıktı olarak vermeye yönelik fonksiyonlar da içerir. Gözlemlenen GIS'in anlamlılığı için bir Q değeriyle birlikte, dört tekrarlı tam bir genom çapında QF.A deneyi, prosedür kavrandığında üç hafta içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, tüm plakaların ve görüntülerin takibi ve adlandırılmasında organize olmayı hatırlamak önemlidir.

Tüm plaklar doğru yönlendirme ve sırayla ekilmeli ve nokta şeklinde damlatılmalıdır. Veri analizi, deney yapan bilim insanı tarafından oluşturulan yardımcı metin dosyalarının doğruluğuna dayanmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, binlerce bağımsız mikrobiyal kültürün uygunluğunun nasıl tahmin edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Fitness değerleri, katı agar plaklarında büyütülmüş lekeli kültürlerin tekrarlanan fotoğraflarının çekilmesi, yakalanan görüntülerin hücre yoğunluğu tahminlerine dönüştürülmesi ve büyüme eğrilerinin oluşturulmasıyla tahmin edilir. Büyme eğrilerinin matematiksel modellemesi, genom çapında gen ürünleri arasındaki fonksiyonel ilişkileri belirlemek için kullanılabilecek nicel fitness tahminleri sağlar.