Name: Kantitatif Spor Analizi İş Akışı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Öğrenin mikrobiyal uygunluk analizi için QFA yöntemini kullanarak genetik etkileşimleri ve büyüme eğrilerini değerlendirmeyi. Bu hesaplamalı yaklaşım, kanser ilaç geliştirme ve DNA hasarı yanıtı çalışmalarında yüksek verimli tarama sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz minnetle ve laboratuvar desteği ve yararlı tartışmalar için Yaşlılık ve Beslenme (CISBAN) Entegre Sistem Biyolojisi Merkezi&#39;nin tüm üyeleri kabul ediyorsunuz. Bu çalışma, Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC) (BB/C008200/1) ve Wellcome Trust (075.294, 093.088) tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Fitness+Analysis+shows+that+NMD+proteins+and+many+other+protein+complexes+suppress+or+enhance+distinct+telomere+cap+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects.</a> PLoS Genetics. 7 (4), e1001362(2011).</li>
<li>Addinall, S. G., Downey, M., Yu, M., Zubko, M. K., Dewar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomewide+suppressor+and+enhancer+analysis+of+cdc13-1+reveals+varied+cellular+processes+influencing+telomere+capping+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genomewide suppressor and enhancer analysis of cdc13-1 reveals varied cellular processes influencing telomere capping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 180, 2251-2266 (2008).</li>
<li>Lawless, C., Wilkinson, D., Young, A., Addinall, S., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonyzer%3A+automated+quantification+of+micro-organism+growth+characteristics+on+solid+agar%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Colonyzer: automated quantification of micro-organism growth characteristics on solid agar.</a> BMC Bioinformatics. 11, 287-28 (2010).</li>
<li>Colonyzer - Image analysis software [Internet]. , Newcastle University. Newcastle, UK. Available from:
 <a target="_blank" href="http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/">http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/</a> (2012).</li>
<li>Tong, A. H., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Bellay, J., Kim, Y., Spear, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
<li>qfa - An R Package for Quantiative Fitness Analysis [Internet]. , University of Vienna. Vienna, Austria. Available from:
 <a target="_blank" href="http://qfa.r-forge.r-project.org/">http://qfa.r-forge.r-project.org/</a> (2012).</li>
<li>Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+growth+rate+in+high-throughput+growth+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Measuring growth rate in high-throughput growth phenotyping.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22 (1), 94-102 (2011).</li>
<li>Maringele, L., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EXO1-dependent+single-stranded+DNA+at+telomeres+activates+subsets+of+DNA+damage+and+spindle+checkpoint+pathways+in+budding+yeast+yku70%CE%94mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Dev%22%5BJournal%5D)">EXO1-dependent single-stranded DNA at telomeres activates subsets of DNA damage and spindle checkpoint pathways in budding yeast yku70Δmutants.</a> Genes and Dev. 16 (15), 1919-1933 (2002).</li>
<li>Warringer, J., Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+in+environmental+arrays+allows+analysis+of+quantitative+phenotypic+profiles+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Automated screening in environmental arrays allows analysis of quantitative phenotypic profiles in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20, 53-67 (2003).</li>
<li>Hillenmeyer, M., Fung, E., Wildenhain, J., Pierce, S., Hoon, S., Lee, W., Proctor, M., St. Onge, R., Tyers, M., Koller, D., Altman, R., Davis, R., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320 (5874), 362-365 (2008).</li>
<li>Smith, A. M., Durbic, T., Oh, J., Urbanus, M., Proctor, M., Heisler, L. E., Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+Genomic+Screens+of+Barcoded+Yeast+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries.</a> J. Vis. Exp. (54), e2864(2011).</li>
<li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).</li>
<li>Queller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+ecology%3A+The+social+side+of+wild+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Behavioural ecology: The social side of wild yeast.</a> Nature. 456, 589-590 (2008).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

QFA birçok bakımdan bir doğrudan üç kurulan tezgah ölçekli mikrobiyolojik tekniklerin soyundan: kültür dilüsyon serisi nokta testleri 9, gazlı sıvı kültürleri 9 ve çoğaltma kaplama 13 büyüme eğrisi belirlenmesi. Bu üç yöntem özetlenmiş ve QFA ve Tablo 2&#39;de diğer yüksek verimlilik teknikleri ile karşılaştırılmıştır. Dilüsyon serisi nokta testleri inokulum dilüsyonları bir dizi yetiştirilen kültürlerin bir dizi koloniler kurma yeteneğini bir zorlanma fitness tanımlamak Oysa, tek bir kültür tekrarlanan gözlemlere QFA önlemler gerginlik spor bir büyüme eğrisi inşa etmek. Tek bir kültürden spor miktarının daha fazla sayıda suşları aynı koşullar altında, eş zamanlı olarak incelenmiştir izin verir. Farklı ortamlarda veya genetik kökenli kültür spor farklılıkların test ederken kültürlerin çoğaltılıyor diziler çoğu yararlı suşu koleksiyonları, tekrarlanan test yapılmasını sağlar. QFA protokolü sunduBurada, bağımsız kültürleri (robotik QFA, Tablo 2) binlerce büyüme gözlemlemek için uygun inkübe ve görüntü agar, çoğaltmak aşılamak için pahalı robotik ekipman kullanır. QFA köklü, geleneksel laboratuvar teknikleri dayanmaktadır Bununla birlikte, aynı zamanda manuel adımları (manuel QFA, Tablo 2) robot yardımı yerine daha ucuza çok daha yapılabilir. Manuel QFA manuel pin aracı ve ve fotoğraflar için inkübatör plakalarını manuel aktarma yöntemi kullanarak agar plaklarına kültürlerin çoğaltma ve aşılama içerir. Aynı bilişimsel analizi akışı ya deney tasarımı gelen büyüme eğrilerinin üretmek için uygulanabilir. QFA spor tahminleri nispeten kesin gibi görünüyor. Şekil 4&#39;te, işlevsel olarak ilgili genin delesyonları dört örneğin kümelerinin ortalama uyumu vurgulanmıştır. İki bağımsızlık her işlevsel ilişkili gen sınıfın üyelerinin yakınent genetik kökenden (ura3Δ ve cdc13-1) QFA spor tahminlerinin tekrarlanabilirlik gösterir. Örneğin, sadece 3 gen delesyonu (dışarı olası 4.300 ile) korunmuş MRX kompleksinin üç üyesi ayırın. Mikrobik suşların büyüme özellikleri test etmek için QFA Yüksek throughput alternatifler SGA 5,6, spektrofotometrik plaka okuyucuları optik yoğunluk kinetik yakalayarak rekabet barkodlu kütüphanelerde ekranlar 11,12 ve ekranlar dahil Tablo 2&#39;de ve daha tam olarak başka bir yerde 8 açıklanan 10 . QFA ve kültürler katı agar yüzeyler (agar temelli yöntemler, Tablo 2) büyümek SGA tabak, robot tarafından hızlı ve kolay işlenebilir. Katı agar yüzeyinden kültürleri de büyüme boyunca havalandırılmakta ve hücrelerin sosyal mikroplar bir topluluk 14 büyürse, sabit kültürlerde büyüyebilir. Sol bozulmamış, mikrobiyal topluluklar birkendi mikro-ortam, örneğin etanol gibi salgılayan toksinler, ve muhtemelen hücreleri arasındaki sinyal ffect. Ancak, yeterli havalandırma sağlamak için gerekli sıvı kültürleri, karıştırma sürekli, yapay büyüme tarzlarını etkileyebilir mikrobiyal topluluklar ve onların mikro-ortamlar bozar. Kültürler arasındaki hücreleri taşıyan sıvı sıçraması için daha az fırsat olmadığı için çapraz kontaminasyon katı agar yöntemleri daha az kaygı verici olduğunu. Kontaminasyon katı agar tayinlerde yabancı hava yoluyla bulaşan mikroplar tarafından meydana gelirse, genellikle katı agar görsel muayene ile tespit ve hesaba veya kaldırılabilir. QFA üretilen iki şekilde paralel sıvı yöntemlerine göre daha yüksektir. Öncelikle, QFA (ve SGA) tabaklarda, inoküle kültürleri plaka başına daha bağımsız kültür vererek, daha yoğun birlikte paketlenmiştir. QFA yılında 308 kültürleri deneysel olmayan kenar kültürler (Şekil 1) com saymazsak, genellikle vardırplaka başına 96 veya 100 kültürleri ile sıvı kültür paralel olarak hazırlandık. İkincisi, QFA deneyler plakaların çok daha büyük bir sayıya ölçeklendirilebilir. Tek bir QFA deneyde analiz plaka sayıda tek bir inkübatör ya sıcak bir odada, en az kabul edilebilir görüntü yakalama frekansı ve maksimum elde yakalama frekansı mevcut alan ile sınırlanmıştır ise, bir sıvı büyüme deneyde plakaların numarası kuvvetli sınırlıdır plaka okuyucu (tipik olarak bir ya da iki levha) veya plak okuyucu (tipik olarak 25-50 plakaları) eklenmiş istif bölmesi arasında kapasitesiyle. Yakın zamanda 37.884 eşzamanlı kültürleri vererek, 308 deneysel kültürleri olan 123 tabak, her bir tam otomatik QFA deney gerçekleştirdi. Biz sıvı büyüyen bağımsız kültürlerin maksimum elde edilebilir sayısı 96 (kültür / plaka) olduğu tahmin bizim QFA verimi az on misli civarındadır x 50 (tabak / istifleyici) = 4800. Sıvı kültür ekranları için alternatif bir çok otomatikleştirilmiş gro kullanmaktırparalel wth cihazları (8 Blomberg tarafından incelemesi ile Tablo 1), bir ya da iki levha bir kapasiteye sahip her. Her cihaz Sıcaklık kontrolü bağımsızdır ve bu nedenle şartlar aynı değildir, ama onlar olduğunu varsayarak, bu iş en az 190 tür cihazların QFA throughput (cihaz başına 200 sıvı kültürleri varsayarak) maç gerektirecektir. Özetle, QFA yararlı küçük ölçekli odaklanmış deneyler ve yüksek işlem ekranlar hem de nicel büyüme fenotipleri toplamak için uygulanabilir yüksek kaliteli bir iş akışıdır. Robotik ekipman için gereksinimleri değişen etkili uygulanacak esnektir. QFA iş akışının bilgisayar bileşeni serbestçe kullanılabilir, açık kaynak kodu dayanmaktadır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Replica Plater </td><td> Sigma </td><td> R-2508 </td><td> 1/8 &quot;çaplı iğneler ile 96 pin manuel pintool </td></tr><tr><td> Mate Mix </td><td> Eppendorf </td><td> 5353 000.014 </td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX </td><td> Beckman </td><td> A31842 </td><td></td></tr><tr><td> Teleshake </td><td> Thermo Scientific </td><td> 50095890 </td><td> Biomek FX Yüklendi </td></tr><tr><td> BM3-SC </td><td> S &amp; P Robotik A.Ş. </td><td> BM3-SC </td><td> 192 raf dönen atlıkarınca </td></tr><tr><td> spImager </td><td> S &amp; P Robotik A.Ş. </td><td> spImager </td><td> Yüksek çözünürlüklü görüntüleme kılavuzu </td></tr><tr><td> sitometride ile spImagerat </td><td> S &amp; P Robotik A.Ş. </td><td> Özel </td><td> Sıcaklık otomatik yüksek çözünürlüklü görüntüleme kontrol </td></tr><tr><td> Isı değiştirici ile Cytomat 6001 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 51022222 </td><td> SpImager Bağlı </td></tr><tr><td> Ecoline RE207 </td><td> Lauda </td><td> RE207 </td><td> Cytomat Bağlı </td></tr><tr><td> atlıkarınca ile spImager </td><td> S &amp; P Robotik A.Ş. </td><td> Özel </td><td> Otomatik yüksek çözünürlüklü görüntüleme </td></tr><tr><td> FP12pins için Robot pin aracı fikstürü </td><td> V &amp; P Bilimsel </td><td> AFIX96FP12 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 x FP12 pimleri </td><td> V &amp; P Bilimsel </td><td> FP12 </td><td> 50.4 mm uzunluğunda, 17 mm pin uzunluğunun maruz </td></tr><tr><td> Pin Aracı İstasyonu Yerleştirme </td><td> V &amp; P Bilimsel </td><td> VP425 </td><td> Docking istasyonu baz pin fan kurutma izin kaldırıldı </td></tr><tr><td>Temizleme Fırçası Pin </td><td> V &amp; P Bilimsel </td><td> VP425 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Replica Plater </td><td> Sigma </td><td> R-2508 </td><td> Manuel pin aracı </td></tr><tr><td> Kapaklı Nunc OmniTray </td><td> Nunc </td><td> 734-0490 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 steril polistiren levhalar </td><td> Greiner BioOne </td><td> 655161 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 steril polistiren kapakları </td><td> Greiner BioOne </td><td> 656171 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tablo 3. Özel reaktifleri ve ekipmanları.

kantitatif spor analizi İş akışı

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Kantitatif Spor Analizi (QFA) paralel 1,2,3,4 yetiştirilen mikrobiyal kültürlerin uyumu karşılaştırmak için bir deney ve hesaplama iş akışıdır. QFA tek kültür odaklı gözlem uygulandı, ancak bağımsız kültürlerin binlerce kadar araştıran genom genetik etkileşim veya ilaç ekranlar için en yararlı olabilir. Merkezi deneysel yöntem inkübe ve düzenli çekilmiştir katı agar plaklarına bağımsız, seyreltik sıvı mikrobiyal kültürlerin aşılama olduğunu. Her zaman noktasından fotoğraflar nicel spor önlemler elde izin vererek, büyüme eğrileri oluşturmak için kullanılır kantitatif hücre yoğunluğu tahminleri, üretim, analiz edilir. Kültür uyumu ölçmek ve genetik etkileşimin güçlü veya ilaç hassasiyetleri rütbe karşılaştırılabilir. Herhangi bir tedavi kültür fitness üzerinde etkisi substrat agar (örneğin küçük moleküller, antibiyotikler veya besin) olarak eklenir veya plakaları dışarıdan uygulananly (örn. UV radyasyon, sıcaklık) QFA ile belirlenebilir. QFA iş akışı büyüme oranı 96-veya 200-iyi plaka okuyucuları paralel sıvı kültürleri spektrofotometrik ölçülmesi ile elde edilen benzer tahmin üretir. Önemlisi, QFA tür yöntemleri ile karşılaştırıldığında daha yüksek hızı daha vardır. QFA kültürleri sağlam bir agar yüzeyinde büyür ve bu nedenle de Karıştıktan gerek kalmadan büyüme sırasında havalandırılmakta. QFA üretilen bazı Sentetik Genetik Array (SGA) tarama yöntemleri 5,6 o kadar yüksek değildir. QFA kültürlerin yoğun agara inoküle edilmeden önce seyreltilir beri Ancak, QFA 3 üstel ve doygunluk aşamaları da dahil olmak üzere daha kapsamlı büyüme eğrileri, yakalayabilir. Örneğin, büyüme eğrisi gözlemleri daha önce 1 anlatıldığı gibi kültür katlama süreleri, yüksek hassasiyetli doğrudan tahmin edilmesine olanak tanımaktadır. Burada bir sunuyoruzBelirli QFA protokol S. binlerce uygulanan otomatik inokülasyon, inkübasyon ve görüntüleme sırasında robotlar tarafından işlenir cerevisiae kültürleri. Bu otomatik adımları herhangi üretilen bir azalma ile ilişkilendirilmiş, bir eşdeğer, manuel prosedürü ile değiştirilir, ve bu da daha düşük bir verim kılavuzu protokolü mevcut olabilir. Aynı QFA yazılım araçları ya da iş akışı içinde çekilen resimlere uygulanabilir. Biz geniş bir deneyime tomurcuklanan maya kültürleri QFA uygulayarak var S. ama biz QFA fisyon maya kültürleri incelemek için eşit derecede yararlı olacağını bekliyoruz S. cerevisiae pombe ve bakteri kültürleri.

Kantitatif Spor Analizi (QFA) mikrobiyal kültür uyumu tahmin etmek için deneysel ve hesaplamalı yöntemleri tamamlayıcı bir dizi. QFA genetik mutasyonlar, uyuşturucu ya da mikrop büyümesi üzerine uygulanan diğer tedavilerin etkisi tahmin ediyor. Tek kültür odaklı analiz paralel kültürlerin binlerce deneyler ölçekleme dizayn edilebilir.

Kantitatif Spor Analizi İş Akışı

Kantitatif Fitness Analizi (QFA), paralel olarak büyütülen mikrobiyal kültürlerin fitness değerlerini karşılaştırmak için kullanılan deneysel ve hesaplamalı bir iş akışıdır1,2,3,4. ...

Bu prosedürün amacı, genom çapında kantitatif mikrobiyal kültür uygunluklarını paralel olarak, hassas ve yüksek verimli bir şekilde belirlemektir. Bu işlem, öncelikle 96 kuyucuklu plaklarda mikrobiyal koloni dizi kütüphanesi oluşturularak ve kültürün doygunluğa ulaşana kadar büyütülmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, doygun kültürler su ile seyreltilir ve katı agar plakalara damlatılır.Ardından, katı agar plaklarının fotoğrafları, mikrobiyal koloni büyümesi doygunluğa ulaşana kadar periyodik olarak çekilir. Son olarak, her kültürün büyümesine ait zaman serisi fotoğrafları hücre yoğunluğunun nicel ölçümlerine dönüştürülür; gözlemlenen büyüme eğrileri, büyüme modelleri ve mikrobiyal fitness'ın nicel ölçümleri ile birlikte özetlenir. Nihayetinde, mikrobiyal suşların farklı mutasyonlarla birleştirildiğinde veya farklı koşullar altında büyütüldüğünde farklı fitness değerlerine sahip olduğunun gösterilmesi yoluyla genetik etkileşimlere kanıt sunan sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin, SGA veya barkodlu rekabet deneyleri gibi yüksek yoğunluklu sabitleme yöntemleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, fitness ölçümlerinin daha doğru olmasıdır. Bu yöntem, kanser ilaç geliştirme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, DNA hasarına yanıt ve hücre döngüsü kontrolünde hangi genlerin ve süreçlerin önemli olduğu, bu tür araştırmaların ve temel mikroorganizmaların insan kanser hücrelerinde potansiyel ilaç hedefleri şeklinde anlaşılması ve dönüştürülmesi gibi. Bu yöntem, telomer fonksiyonu ve görünümleri hakkında bilgi sağlayabilse de.Bu yöntem, maya biyolojisinin diğer alanlarına veya fitness fenotiplerinin mikrobiyal biyoloji hakkında içgörü sağlayabileceği herhangi bir alana da uygulanabilir. QFA'nın, dizi kütüphaneleri mevcut olan birçok diğer mikrobiyal organizmaya uygulanabilmesini umuyoruz. Örneğin, povi e coli, orilla surplus. Doygun gece kültürlerinden başlanarak, 200 µL hacmindeki zengin sıvı besiyerinde 96 bağımsız maya suşu hazırlanmıştır.96 kuyucuklu bir kültür kabında, önce %100 ethanol içine daldırıp ardından alevle sterilize ederek ve soğumaya bırakarak, bir sekiz inç çapındaki manuel replika plater için 96'lı pini sterilize edin. 96 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına 200 µL steril su ekleyin; vortexlenmiş doymuş maya kültürlerini, sterilize edilmiş pin aracını suşların içine üç kez daldırarak seyreltin. Ardından, pini bir kez su içeren plakaya daldırın, pin aracını tekrar sterilize edin ve seyreltilmiş kültürlere üç kez daldırmadan önce soğumasını bekleyin. Son olarak, pini katı agar plakasına transfer edin.Agar plaklarını inkübe ettikten sonra, otomatik kültürleme için onları manuel olarak görüntülemek üzere bir s and p robotics SP imager kullanın. Katı agar üzerinde büyütülen bağımsız maya suşlarından oluşan dikdörtgen bir dizi ile başlayın. Bu örnekte başlangıç suşları, sıcaklığa duyarlı bir sorgu mutasyonunun maya delesyon koleksiyonu ile çaprazlanması sonucunda elde edilmiştir.384 bağımsız maya suşunun dört tekrarını temsil eden 1.536 kültür, 96 pinli, bir milimetre pin çaplı steril pin araç transferi yapan bir robot kullanılarak SGA plaklarında büyütülür; 1.536 suşun 384 tanesi, 200 µL seçici besiyeri içeren 4 adet 96 kuyucuklu kültür plakasına aktarılır ve kültürler doygunluğa ulaşana kadar 20 °C'de büyütülür. Doygun maya kültürlerini spotlamak için, öncelikle kültürler bir sıvı taşıma robotuna aktarılarak manyetik bir çalkalayıcı üzerinde yeniden süspande edilir; ardından steril 96 pinli robotik pin aracı kullanılarak 200 µL steril su içerisine pinleme yapılır ve kültürler yaklaşık 1:70 oranında seyreltilir.Pin aracı temizlenip sterilize edildikten sonra, seyreltilmiş kültürleri agar plaklarına nokta şeklinde aktarın. 384 kuyucuklu formatta olan plakları, otomatik karusel ve erişim kapağına sahip, sıcaklık kontrollü ve nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. Kültürlerin görüntülenmesi için; plakları inkübatörden tekrar tekrar çıkaran, kapaklarını alan, 35 milimetrelik bir kameranın altındaki tekdüze aydınlatılmış bir alana aktaran ve 5.184 x 3.456 çözünürlükte görüntü alan robotik bir otomatik görüntüleme sistemi kullanın.Pixel resolution kapağı yerine takar, ardından plakalardaki kültür konumlarını ve uygulanan işlemleri takip etmek için onları inkübatör carousel'ine geri yerleştirir. Plakalar; inkübatör adına, sıcaklığa, benzersiz ardışık parti numarasına ve inkübatördeki konumuna göre otomatik olarak barkodlanır. Görüntü isimleri, plaka adı ve zaman damgasının birleşiminden oluşur ve görüntü yakalama işlemiyle birlikte otomatik olarak oluşturulur.Robot carousel'leri arasında aktarım yapılırken plakaların aynı sırada kalmasını sağlamak için genellikle plakalar manuel olarak da etiketlenir. Metaveri dosyaları, manuel olarak oluşturulan sekmeyle ayrılmış metin dosyalarıdır. Deney açıklama dosyası FT iki.Tablo bir her deneye özgüdür, ancak kütüphane açıklaması FT üç, tablo bir kapsamlı bir şekilde yeniden kullanılabilir. Deney oluşturulduktan sonra, barkod veya otomatik olarak oluşturulmuş plaka adı, deney başlangıç zaman damgası, plaka işlemi, katı agar ortam içeriği, tarama adı, çoklu plakalara sahip kütüphaneler için kütüphane plaka numarası ve 1.536 kuyucuk formatından 384 kuyucuk formatına ölçeklendirme için tekrar kuadrant numarası sütunlarını içeren deney açıklama dosyası FT iki tablo bir içinde tanımlanır. E suşu kütüphanesi, her kültür konumunda yetiştirilen genotipi belirten bir kütüphane açıklama dosyası FT üç, tablo bir ile tanımlanmıştır.Kütüphanenin her bir plakası; dört sütun, kütüphane adı, ORF, plaka numarası, plaka satır-sütunu ve isteğe bağlı bir notlar sütunu içerir. Taranan suşların tanımlanması için, her bir sistematik ORF numarasıyla ilişkili standart gen adını açıklayan isteğe bağlı bir standart gen adı dosyası (FT dört, tablo bir) sağlanabilir. Bu dosya, verilerin analizi için ORF ve gen adı olmak üzere iki sütun içerir.QFA hesaplama iş akışı, üzerine kurulum yapılmış makul düzeyde güçlü, çok çekirdekli bir bilgisayar iş istasyonuna erişim gerektirir. Her ikisi de çevrimiçi olarak belgelenmiş olan Colonizer görüntü analiz yazılımı aracı ve QFAR paketi ücretsiz olarak sunulmaktadır ve çeşitli işletim sistemlerinde çalışmaktadır. Yakalanan her bir plaka görüntüsünü girdi olarak kullanarak Colonizer'ı çalıştırın; bu işlem, yakalanan her görüntü için bir Colonizer çıktı dosyası (FT beş, tablo bir) oluşturur. Colonizer çıktı dosyaları kültür yoğunluğu tahminlerini, kültür alanını, şeklini ve rengini belirtir.Görüntü plakasındaki 384 konumun her biri için, çıktı dosya adı kaynak görüntü dosya adından otomatik olarak kopyalanır. QFAR paketi, gözlemlere genelleştirilmiş lojistik popülasyon modellerini uydurmak ve grafiğe dökmek için her bir kültürün zaman seyri verilerini seçen fonksiyonlar içerir. Örnekler için şekil iki ve üçe bakınız.Uyumlanmış parametre değerleri QFA lojistik parametre dosyalarına yazılır. QFAR paketi ayrıca kalite kontrol için fonksiyonlar da içerir. Plaka kenarlarındaki besinlerin daha fazla bulunması ve görüntü analizindeki zorluklar nedeniyle kenar kolonileri elenir.Plak duvarlarının yakınındaki ve SGA'dan geçemeyen kültürler ile tarama spesifik marker genleri ile bağlantı gösteren genotipler analizden çıkarılır. Her bir kültür için lojistik popülasyon model parametrelerinden çeşitli kantitatif uygunluk ölçümleri elde edilir. Bunlar, her bir tekrarlı kültür seti ve her bir uygunluk tanımı için maksimum popülasyon iki katlanma hızlarını ve inokülasyondan doygunluğa kadar olan bölünme sayısını içerir.Kondisyon tahminlerine ilişkin çeşitli özet istatistikler hesaplanır: ortalama ve medyan kondisyon, kondisyon standart sapması ve gözlemlenen replika sayısı. Özet istatistikler, daha sonraki analizler için QFA kondisyon özet dosyaları FT sekiz, tablo bir'e aktarılır. Örneğin, genetik etkileşim skorlarının hesaplamaları FT dokuz tablo bir'dir.Bu şekil, 384 QFA üzerinde logaritmik ölçekte gösterilen tipik bir büyüme eğrisini göstermektedir. Katı agar üzerinde 20 °C'de büyüyen kültürler colonizer ile nicellendirilmiş olup, hücre yoğunluğundaki artış yaklaşık iki gün sonra ilk kez tespit edilebilmektedir. Bu gecikme, muhtemelen katı besiyerine inokülasyon sonrası kültür lag fazı ile hücre yoğunluğu için geçerli olan alt tespit sınırının birleşik etkisidir.Burada, tek bir plakadan 308 benzer büyüme eğrisi elde edilmiştir. Düz bir çizgi oluşturan suşların oldukça hasta veya ölü olduğunu unutmayın. Bu şekil, genetik etkileşim güçlerini belirlemek için iki genom çapındaki QFA taramasının karşılaştırılmasını göstermektedir.QFAR paketi ayrıca, önceki büyüme eğrisi şeklini oluşturmaya ve incelenen genotiplerin sıralanmış listelerini ve genetik etkileşim gücü tahminlerini çıktı olarak vermeye yönelik fonksiyonlar da içerir. Gözlemlenen GIS'in anlamlılığı için bir Q değeriyle birlikte, dört tekrarlı tam bir genom çapında QF.A deneyi, prosedür kavrandığında üç hafta içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, tüm plakaların ve görüntülerin takibi ve adlandırılmasında organize olmayı hatırlamak önemlidir.Tüm plaklar doğru yönlendirme ve sırayla ekilmeli ve nokta şeklinde damlatılmalıdır. Veri analizi, deney yapan bilim insanı tarafından oluşturulan yardımcı metin dosyalarının doğruluğuna dayanmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, binlerce bağımsız mikrobiyal kültürün uygunluğunun nasıl tahmin edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Fitness değerleri, katı agar plaklarında büyütülmüş lekeli kültürlerin tekrarlanan fotoğraflarının çekilmesi, yakalanan görüntülerin hücre yoğunluğu tahminlerine dönüştürülmesi ve büyüme eğrilerinin oluşturulmasıyla tahmin edilir. Büyme eğrilerinin matematiksel modellemesi, genom çapında gen ürünleri arasındaki fonksiyonel ilişkileri belirlemek için kullanılabilecek nicel fitness tahminleri sağlar.

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz yüksek verimli sıralama kullanan proteinlerin kapsamlı tek site doyma mutagenezi kütüphanelerinin fonksiyonel değerlendirme için bir protokol mevcut. Daha da önemlisi, bu yaklaşım kütüphane inşaatı ve sıralama multipleks dik primer çiftleri kullanır. ampisilin klinik olarak anlamlı bir doz için seçilen TEM-1 β-laktamaz kullanılarak Örnek sonuçlar verilmiştir.

Yüksek verimlilik sıralaması kullanılması Tüm-Protein Doygunluk Mutagenez Kütüphaneleri Fonksiyonel Değerlendirme Protokolü

sıvı içinde nematod yüzme davranış bilgisayar tabanlı analiz için etkin ve basit bir yöntem tarif edilmektedir. Yöntem C. elegans laboratuarlar için hiçbir yatırım çok az gerektirir. kullanılan donanım standart ve davranışsal analizi (Celest) için bilgisayar yazılımı açık kaynak kodlu bir tanesidir.

ve Otomatik Analizi<em&gt; C. elegans</emCelest Yazılım Kullanma&gt; Deniz Davranışı

Bakteriyel Fitness belirlenmesi için bu moleküler tabanlı yaklaşım dijital PCR üzerinden nicelik benzersiz genomik DNA barkodları kullanarak mikroorganizmaların kesin ve doğru algılanmasını kolaylaştırır. Protokol, Salmonella suşları için rekabetçi dizinin hesaplanmasında açıklanmaktadır; Ancak, teknoloji, herhangi bir genetiği değiştirilmiş organizmanın mutlak ölçümlerini gerektiren protokollere kolayca adapte olmaktadır.

Salmonella Fitness yüksek verimlilik analizi için dijital PCR tabanlı rekabetçi endeksi

EVOLVER çerçevesi yüksek çözünürlüklü ve deneysel parametreler üzerinde dinamik kontrol ile yüksek verimlilik sürekli mikrobiyal kültür sağlar. Bu protokol, kullanıcıların birçok bireysel kültürde otomatik kontrolü programlama, ölçme, toplama ve deneysel verilerle gerçek zamanlı etkileşime girme konusunda rehberlik ederek karmaşık bir fitness deneyi yapmak için sistemin nasıl uygulanacağını gösterir.

EVOLVER kullanarak otomatik, yüksek verimlilik, sürekli hücre büyüme denemeleri tasarlama

Mevcut protokol, insan sperminde apoptozis, mitokondriyal membran potansiyeli ve DNA hasarının tek bir sitometre ile ölçülmesine olanak sağlayan pratik bir çözüm sunmaktadır.

İnsan Sperm Fonksiyonel Kusurlarını Tespit Etmek için Biyobelirteçlerin Akış Sitometrik Analizi

Burada, transkriptomik verileri bir mqTrans görünümüne dönüştürmek için karanlık biyobelirteçlerin tanımlanmasını sağlayan bir protokol sunuyoruz. Konvansiyonel transkriptomik analizlerde diferansiyel olarak ifade edilmese de, bu biyobelirteçler mqTrans görünümünde diferansiyel ekspresyon sergiler. Yaklaşım, daha önce gözden kaçan biyobelirteçleri ortaya çıkaran geleneksel yöntemlere tamamlayıcı bir teknik olarak hizmet eder.

Küçük Veri Kümelerinde Tahmin Görevi ve Karanlık Biyobelirteç Tespiti için Transkriptomik Özelliklerin Transkripsiyonel Düzenleme Görünümünün Oluşturulması

Farklı ön işleme adımlarını, çoklu omik faktör analizi modelinin tahminini ve çeşitli aşağı akış analizlerini birleştiren karmaşık multi-omik veri kümelerinin denetimsiz analizi için esnek, genişletilebilir Jupyter-lab tabanlı bir iş akışı sunuyoruz.

Kardiyovasküler Hastalıklarla Bağlantılı Varyasyon Modellerini ve Moleküler Süreçleri Ortaya Çıkarmak için Denetimsiz Çoklu Oksijen Faktör Analizinin Uygulanması

Giyilebilir teknoloji düşük maliyetlidir ve fizyolojik verilerin uygun şekilde izlenmesini sağlar. Bununla birlikte, bu cihazların doğruluğu ve güvenilirliği, kullanıcılar için etkinliklerini ve güvenliklerini sağlamak için dikkatli bir değerlendirme gerektirir. Bu rapor, ticari bir akıllı saatin fizyolojik verilerin ve fiziksel aktivitenin izlenmesinde doğrulama sürecini açıklamaktadır.

Kardiyovasküler ve Fiziksel Aktivite İzleme için Fitness Akıllı Saat Verilerinin Doğruluğunun Değerlendirilmesi: Dijital Sağlıkta Bir Doğrulama Çalışması

Xenopus embriyonik epitel, epitel morfolojilerinden sırasında kutup geliştirme ve şekil değişikliği gibi hücre davranışlarını incelemek için ideal bir model sistem . Geleneksel sabit örnekleri histoloji giderek canlı hücre konfokal görüntüleme tarafından tamamlanmaktadır. Burada, kurbağa dokularda izole ve canlı hücre konfokal mikroskopi kullanılarak canlı epitel hücreleri ve hücre iskeletinin görselleştirmek için yöntemler göstermektedir.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Öğrenin mikrobiyal uygunluk analizi için QFA yöntemini kullanarak genetik etkileşimleri ve büyüme eğrilerini değerlendirmeyi. Bu hesaplamalı yaklaşım, kanser ilaç geliştirme ve DNA hasarı yanıtı çalışmalarında yüksek verimli tarama sağlar.

Kantitatif Spor Analizi İş Akışı

Daha fazla video keşfet