Kantitatif Spor Analizi İş Akışı

Bu prosedürün amacı, kantitatif mikrobiyal kültür uygunluklarını genom çapında bir ölçekte paralel olarak hassas ve yüksek verimli bir şekilde yakalamaktır. Bu, 96 kuyucuklu plakada mikrobiyal kolonilerin ilk Turing ve dizi kütüphanesi ve kültürün doygunluğa kadar büyütülmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, doymuş kültürler su içinde seyreltilir ve daha sonra katı agar plakaları üzerinde lekelenir.

Daha sonra katı a garf plakaları periyodik olarak ve mikrobiyal koloninin büyümesi doygun hale gelene kadar fotoğraflanır. Son olarak, her bir kültürün büyümesinin zaman rotası fotoğrafları, hücre yoğunluğunun kantitatif ölçümlerine dönüştürülür ve büyüme modelleri ve mikrobiyal uygunluğun kantitatif ölçümleri ile gözlemlenen büyüme eğrileri özetlenir. Sonuç olarak, mikrobiyal suşların farklı mutasyonlarla birleştirildiğinde veya farklı koşullar altında yetiştirildiğinde farklı uygunluklara sahip olduğunu göstererek genetik etkileşimler için kanıt gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, SGA veya barkod yarışması deneyleri gibi yüksek yoğunluklu sabitleme yöntemleri gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, uygunluk ölçümlerinin daha doğru olmasıdır. Bu yöntem, DNA hasarına yanıt ve hücre döngüsü kontrolünde hangi genlerin ve süreçlerin önemli olduğu, bu tür araştırmaların ve temel mikroorganizmaların insan kanser hücrelerinde potansiyel ilaç hedefleri şeklinde anlaşılması ve tercüme edilmesi gibi kanser ilacı geliştirme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem telomer işlevi ve visi hakkında fikir verebilir.

Ayrıca, maya biyolojisinin diğer alanlarına veya uygunluk fenotiplerinin mikrobiyal biyoloji hakkında fikir verebileceği herhangi bir alana da uygulanabilir. QFA'nın, dizi kütüphanelerinin bulunduğu diğer birçok mikrobiyal organizmaya uygulanabileceğini umuyoruz. Örneğin, povi e coli, orilla fazlalığı Doymuş gece kültürlerinden başlayarak, 200 mikrolitre hacimli zengin sıvı ortamda 96'ya kadar bağımsız maya suşuna kadar oynadı.

96 iyi kültürlü bir tabakta, 96 pimli, bir inç çapındaki manuel replika plater'ın sekizde biri olan bir manuel replika plater'ı önce %100 etanole daldırarak, ardından alevlendirerek ve soğumaya bırakarak sterilize edin, 200 mikrolitre steril su 96 Kuyulu plaka girdabının kuyularında maya kültürlerini doyurmuş ve sterilize edilmiş pim aletini suşlara üç kez daldırarak seyreltin. Daha sonra suyu içeren plakaya bir kez girin, pim aletini sterilize edin ve seyreltilmiş kültürlere üç kez daldırmadan önce soğumasını bekleyin. Ardından iğneyi sağlam bir agar plakasına aktarın.

Agar plakalarını inkübe ettikten sonra, otomatik kültürleme için bunları manuel olarak görüntülemek için bir s ve p robotik SP görüntüleyici kullanın. Katı agar üzerinde yetiştirilen dikdörtgen bir dizi bağımsız maya türü ile başlayın. Bu örnekte, başlangıç suşları, maya delesyon koleksiyonu ile sıcaklığa duyarlı bir sorgu mutasyonunun çaprazlanmasının sonucudur.

384 bağımsız maya suşunun dört kopyasını temsil eden 1.536 kültür, 1.536 suşun 384'ünü 4.96'ya aktaran 96 pimli, bir milimetre pim çaplı steril pimli alet transferine sahip bir robot kullanılarak SGA plakaları üzerinde büyütülür. 200 mikrolitre seçici ortam içeren iyi kültür plakaları, kültürleri 20 santigrat derecede doygunluğa kadar büyütür. Doymuş maya kültürlerini tespit etmek için, bunları bir sıvı işleme robotuna aktararak başlayın ve Resus bunları manyetik bir çalkalayıcı üzerinde askıya alın, 200 mikrolitre steril suya sabitlemek için steril bir 96 pinli robotik pim aleti kullanarak kültürleri yaklaşık bir ila 70 ° C'ye kadar seyreltin.

Pim aletini temizledikten ve sterilize ettikten sonra, seyreltilmiş kültürleri agar plakalarına yerleştirin. 384'te, iyi format, plakaları otomatik bir atlıkarınca ve erişim kapağı ile sıcaklık kontrollü nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın. Kültürleri görüntülemek için plakaları inkübatörden tekrar tekrar çıkaran, kapakları çıkaran, bunları 35 milimetrelik bir kameranın altında eşit şekilde aydınlatılmış bir alana aktaran robotik bir otomatik görüntüleyici, 5.184 x 3.456'da bir görüntü yakalar.

Piksel çözünürlüğü kapağın yerini alır, ardından plakalar üzerindeki kültür konumlarını ve bunlara uygulanan işlemleri izlemek için bunları inkübatör karuseline geri döndürür. Plakalar, inkübatör adına, sıcaklığına, benzersiz sıralı parti numarasına ve inkübatördeki konumuna göre otomatik olarak barkodlanır. Görüntü adları, plaka adı ve zaman damgasının bir birleşimidir ve görüntü yakalandıktan sonra otomatik olarak oluşturulur.

Plakalar, robot karuselleri arasında aktarım yaparken aynı sırada kalmalarını sağlamak için genellikle manuel olarak da etiketlenir. Meta veri dosyaları, manuel olarak oluşturulan sekmeyle ayrılmış metin dosyalarıdır. Deneysel açıklama dosyası FT iki.

Tablo bir, her deney için benzersizdir, ancak kitaplık açıklaması FT üç, tablo bir kapsamlı bir şekilde yeniden kullanılabilir. Bir kez oluşturulduktan sonra, deney deneysel açıklama dosyasında FT iki tablo bir barkod veya otomatik olarak oluşturulan plaka adı deneyi için sütunlar içeren tablo katı agar ortamının zaman damgası plaka muamelesi içeriği, ekran adı, çoklu plakalı kütüphaneler için kütüphane plaka numarası ve 1, 536'dan 384'e ölçeklendirmek için bir tekrar kadran numarası. E suş kütüphanesinin iyi biçimlendirilmesi, her bir kültür konumunda yetiştirilen genotipi belirten bir tablo olan FT üç kitaplık açıklama dosyası ile tanımlanır.

Bir kitaplığın her plakasında, dördüncü sütunlar, kitaplık adı, ORF, plaka numarası plakası, satır plakası sütunu ve isteğe bağlı bir not sütunu bulunur. İsteğe bağlı bir standart gen adı dosyası sağlanabilir: FT dört, taranan suşları tanımlayan, her bir sistematik ORFY numarasıyla ilişkili standart gen adını tanımlayan tablo bir. Bu dosya, verileri analiz etmek için ORF ve gen adı olmak üzere iki sütun içerir.

QFA hesaplama iş akışı, üzerine kurulu olan oldukça güçlü bir çok çekirdekli bilgisayar iş istasyonuna erişim gerektirir. Her ikisi de çevrimiçi olarak belgelenen colonizer görüntü analizi yazılım aracı ve QFAR paketi ücretsiz olarak kullanılabilir ve çeşitli işletim sistemlerinde çalıştırılır. Yakalanan plaka görüntülerinin her biri giriş olarak bir kolonizatör çıktı dosyası FT beş, yakalanan her görüntü için bir tablo oluşturan kolonizörü çalıştırın çıktı dosyaları, kültür yoğunluğu tahminlerini, kültürü, alanı, şekli ve rengi belirtin.

Görüntü plakasındaki 384 konumun her biri için, kaynak görüntü dosyası adından otomatik olarak bir çıktı dosyası adı kopyalanır. QFAR paketi, genelleştirilmiş lojistik popülasyon modellerini gözlemlere ve çizime sığdırmak için her kültür için zaman kurslarına göre fonksiyonlar içerir. Her ikisi de örnekler için ikinci ve üçüncü şekillere bakınız.

Takılan parametre değerleri, QFA lojistik parametre dosyalarına yazılır. QFAR paketi ayrıca kalite kontrol için fonksiyonlar içerir. Kenar kolonileri, plaka kenarlarında daha fazla besin maddesi bulunması ve görüntü analizinin zorluğu nedeniyle atılır.

SGA'da başarısız olan yakın plaka duvarları ve kültürleri ve ekrana özgü işaretleyici genlerle bağlantı gösteren genotipler analizden çıkarılır. Her kültür için lojistik popülasyon modeli parametrelerinden çeşitli nicel uygunluk ölçütleri türetilmiştir. Bunlar, her bir replike kültür seti ve her bir fitness tanımı için maksimum popülasyon ikiye katlama oranlarını ve aşılamadan doygunluğa kadar bölünme sayısını içerir.

Kondisyon tahminlerinin birkaç özet istatistiği hesaplanır: ortalama ve orta kondisyon, kondisyon standart sapması ve gözlemlenen tekrarlama sayısı. Özet istatistikler, daha fazla analiz için QFA fitness özet dosyaları FT sekiz, tablo bir'e verilir. Örneğin, genetik etkileşim puanlarının hesaplanması FT dokuz tablo bir.

Bu şekil, günlük ölçeğinde tipik bir büyüme eğrisini göstermektedir: OUTTA 384 QFA. Kolonizatör tarafından ölçüldüğü gibi katı agar üzerinde 20 santigrat derecede büyüyen kültürler, hücre yoğunluğunda bir artış ilk olarak yaklaşık iki gün sonra tespit edilebilir. Bu gecikme muhtemelen katı ortama inokülasyondan sonra bir kültür gecikme fazının birleşik bir etkisi ve hücre yoğunluğu için daha düşük bir tespit sınırıdır.

Burada, tek bir plakadan 308 benzer büyüme eğrisi yakalandı. Düz bir çizgi oluşturan suşların çok hasta veya ölü olduğunu unutmayın. Bu şekil, genetik etkileşim güçlerini anlamak için iki genom genişliğinde QFA ekranının karşılaştırmasını göstermektedir.

QFAR paketi ayrıca, önceki büyüme eğrisi rakamını üretme ve incelenen genotiplerin sıralı listelerini ve genetik etkileşim gücü tahminlerini çıkarma işlevlerini de içerir. Gözlemlenen CBS'nin önemi için bir Q değeri ile birlikte, bir kez tam bir genom çapında dört replike QF'ye hakim oldu. Bir deney üç hafta içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, tüm plakaların ve görüntülerin izlenmesi ve adlandırılmasında organize olmayı unutmamak önemlidir.

Tüm plakalar aşılanmalı ve doğru yönde tespit edilmeli ve daha fazla sipariş edilmelidir. Veri analizi, deneysel bilim adamı tarafından oluşturulan yardımcı metin dosyalarının doğruluğuna dayanır. Bu videoyu izledikten sonra, binlerce bağımsız mikrobiyal kültürün uygunluğunu nasıl tahmin edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Uygunluklar, benekli kültürlerin tekrar tekrar fotoğraflanması, katı agar plakaları üzerinde büyümesi, yakalanan görüntülerin hücre yoğunluğu tahminlerine dönüştürülmesi ve büyüme eğrileri oluşturulmasıyla tahmin edilir. Büyüme eğrilerinin matematiksel modellenmesi, daha sonra gen ürünleri arasındaki fonksiyonel ilişkileri genom çapında bir ölçekte çıkarmak için kullanılabilecek nicel uygunluk tahminleri sağlar.