Name: Buruşuk Koloni Gelişimi kullanarak Biyofilm Oluşumu değerlendirin Bir Yarı-kantitatif Yaklaşım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Keşfedin biyofilm oluşumunu yarı-kantitatif olarak değerlendiren buruşuk koloni gelişimi yöntemini. Bu teknik, bakteri suşları arasındaki fenotipik farklılıkları mikroskopi ile gözlemleyerek mikrobiyoloji araştırmalarında güvenilir sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NHI R01 hibe KLV verilen GM59690 tarafından desteklenmiştir.

1. İlk Karakterizasyonu ve Düşünceler <ol><li> Biyofilm oluşumu genellikle hücre yoğunluğu ve büyüme hızı etkilenir. Bu nedenle, büyüme oranı (zamanla optik yoğunluk (OD) artış) ve basit bir büyüme eğrisi ve hücre kaplama deneyler gerçekleştirilerek ilgi suşu (ler) in verimi (nihai hücre sayısı) belirlenmesi gereklidir. Deneyler lekelenme sonuçları yorumlanırken büyüme, veya OD ve hücre sayısı arasında korelasyon eksikliği hataları dikkate alınmalıdır. </li><li> Küçük plaka-to-plaka değişimi biyofilm gelişimi etkileyebilecek gibi, buruşuk koloni oluşumu değerlendirirken aynı plaka üzerinde uygun pozitif ve negatif kontrolleri ekleyin. </li><li> Tespit için en iyi koşulları, yani kontrol ve ilgi mutant (lar) arasındaki en belirgin farklılıklar ortaya olanları belirleyin. Gibi farklı medya ya da sıcaklık gibi çeşitli koşullar altında sıvı kültür suşları büyümek ve farklı sahneönce lekelenme büyüme (üstel veya sabit faz) s. Nokta 10 uygun ortam üzerine çeşitli hücre yoğunluklarında kültür ul ve koloni morfolojileri belirgin hale gelene kadar istenilen sıcaklıkta inkübe edin. </li><li> Son nokta testi (yani 48 saat) tespit sonra önceden belirlenmiş bir zaman noktasında kırışmış koloni gelişimi değerlendirmeyi içerir. Bu değerlendirme suşlar için yararlıdır biyofilm sergileniyor (ya da sergilemek için önerilmektedir) ciddi kusurlar. </li><li> Zaman elbette testi bir süre (yani, her saat) sonrası lekelenme üzerinde kırışmış koloni oluşumu değerlendirir. Bu testte bir süre boyunca buruşuk koloni oluşumu ve kalıp gelişme başlangıç ​​belirlenmesi izin vererek biyofilm bir yarı-niceliksel izin verir. Belirli bir zaman ders için toplama noktaları deney ve sayısı süresi ön deneylerde tespit edilmelidir. </li><li> Kolayca ayarlanır, sonrası lekelenme zaman izlemek içinkadar saymak için imer. </li></ol> 2. V. yılında Buruşuk Koloni Morfolojisi Mikroskopik Değerlendirme fischeri <ol><li> Inoküle V. LB-Tuz (LBS) orta 13 (1% [w / v] tripton,% 0.5 [w / v] maya ekstresi,% 2 [w / v] sodyum klorid, 50 mM Tris-HCl [5 ml içine fischeri hücreleri pH 7.5]) 28 gece, titreme ile gerekli antibiyotik ve inkübe içeren ° C Hücreleri istenilen OD 600 ulaşana kadar Sabah, aynı koşullar altında taze LBS orta ve inkübe 5 ml içine bir 1:100 ile hücreleri altkültürü (örneğin, OD 600 = 0.2 veya 0.5). </li><li> Bir mikrofüj tüpü ve bir dakika maksimum hızda bir mikrofüj setindeki santrifüj içinde kültür pipetle 1 ml. Aspirasyon ile süpernatantı. Steril% 70 yapay deniz suyu 1 ml (ASW) (35 mM MgSO 4-7H 2 O, 7 mM CaCl yılında pelet resuspending tarafından artık medya ve ekstrasellüler bileşenleri kaldırmak için hücreleri yıkayın2-2H 2 O, 210 mM NaCl, 7 mM KCl) ve santrifüjleme tekrarlayarak. % 70 ASW 1 ml yıkanmış pelletini. </li><li> Her örnek olarak 600 nm&#39;de OD tarafından tahmin hücrelerin, aynı sayıda içerdiğinden emin olun. Ek% 70 ASW ile daha konsantre örnekleri seyreltilmesiyle Gerekli ayarlamaları yapın. Ön deneylerde, çeşitli başlangıç ​​OD değerlerini azından nokta kültürler suşları veya koşullarının, belirli bir küme için en uygun başlangıç ​​OD belirlenmesi. En iyi sonuçlar elde edilmiştir V. noktalar yaklaşık 0.2 bir OD ile kültürler üretilir fischeri. </li><li> Gerekli antibiyotik içeren LBS plakaları üzerine yıkanmış hücrelerin 10 ul nokta. Bir tabağa bir kültür lekelenme olduğunda, sadece agar yüzeyinden sabit pipet (parmağınızla) emin olun. Olmayan bir açı, dikey nokta ve spot tekdüze dağılım için yavaş yavaş sıvı çıkarır. Genellikle her bir suş (plaka başına kadar 6 lekeler) plaka başına bir kez fark edilir, espriDeneme başına h birden plakaları (2-3). </li><li> Benekli kültür eşit dağıtılmış kalmasını sağlamak için, nokta inkübatöre plaka geçmeden önce kurumasını bekleyin. Plakalar ters çevirin ve 28 de bunları tasarlamak ° C </li><li> Aşılanmasını takiben 12-15 saat büyüyen nokta saatlik başından morfolojisi izleyin. Biz bir kamera eki (Progres C10 PLUS) ve Progres CapturePro ve gözlemlemek ve belgelemek koloni morfolojisi ve kırışmış koloni oluşumunun başlangıcında ve ilerleyişini değerlendirmek üzere ImageJ yazılım programları ile bir diseksiyon kapsamı (Zeiss STEMI 2000-C) kullanın. </li><li> Görüntü yukarıdan yakalanır ise adım 2.5 listelenen özel kurulum için, lekeler, bir CL 1500 EC soğuk ışık kaynağı ile şeffaf bir cam aşamasında altından aydınlatılmıştır. Bu kurulum görüntüleme kırışmış koloni gelişimi için, çünkü V. uygunudur fischeri koloniler (noktalar) saydam vardır. </li><li> St listelenen spesifik ekipman yokluğundaep 2.5, tam koloni izlenmesine olanak verir ve ayarlanabilir ışık kaynağı ve ideal olarak, ekli bir kamera olan herhangi bir mikroskop kullanarak monitör buruşuk koloni morfolojisi. Eğer gerekirse, bir dijital kamera da ekli bir kameranın yokluğunda kullanılmıştır, ancak bu optimal değildir edilebilir. </li><li> En buruşuk koloni gelişimi görselleştirme, bunun geliştirilmesi biyofilmlerin üç boyutlu şekil ayırt edilebilir olduğu gibi bakteriyel koloniler altında ışık yansıma yoğunluğu açısı ve hem de ayarlamak için gereklidir. Benekli koloni ve koloni mimarisi (kırışıklık) açıkça ayırt olduğu gibi çevreleyen agar arkaplan arasında güçlü kontrast sağlamak optimum aydınlatma koşulları belirler. </li><li> Koloni renk değişiklikleri biyofilm oluşumu sırasında oluşabilir gibi bazı durumlarda, benekli koloni rengi de dikkate alınmalıdır. Ortaya çıkarmak için ışık kaynağının şiddeti ve açısını ayarlayınrenklenmesi bu ince değişiklikler. Uygun ayarları elde edilir sonra, deneme süresi boyunca onları korumak. </li><li> Ne kadar süre geçtiğini inokülasyon zaman buruşmuş koloni gelişimi her tür ya da durum için başlatır hangi zaman unutmayın. Modelleme ve 3B yapıların formasyonu (yani, çizgiler oluşturan dış kenarında veya &#39;dalgaların&#39; merkezi meydana gelen) ilk açıktır hangi bir zaman noktası olarak buruşuk koloni oluşumunun başlangıç ​​tanımlayabilir. Mutant hücreler koloni buruşuk oluşumunun başlangıç ​​(örn., Şek. 2) için zaman azaldığı ya da artan rastlamak mümkündür. </li><li> Uygun dijital fotoğraf çekimi ile buruşmuş koloni oluşumunun başlangıcında ve geliştirme belgeleyin. Bu deney boyunca görüntü alırken aynı büyütme kullanmak önemlidir. Mikroskobun Mercekten kameranın arkasında bulunan kolu kullanarak bilgisayar ekranına görünümüne geçin. Mercek arasında geçiş yaparkenve bilgisayar ekranında görüntüleme, görünümünü ayarlamak ve buna odaklanmak. </li><li> Görüntüleme benekli kültürler önce, Petri plakasının kapak tipik olarak net görüntü sunmak için çıkarılır. Benekli kültür adımları 2.5 ve 2.6 özetlenen kurulum kullanarak kapaktan imaged olabilir Ancak, bu isteğe bağlı bir adımdır. </li><li> Buruşuk koloni oluşumunun başlangıcında izleyerek her zaman noktasında, buruşuk koloni gelişme desen unutmayın. Mimarisi içten dışa gelişebilir veya Bu değerlendirme inç dışında farklı suşları veya farklı koşullar altında oluşmuş biyofilm ayırt etmek için bir mekanizma sağlar. </li><li> Her bir zaman noktasında gelişmekte koloninin çapı ölçün. Bu elle yapılması veya dijital olarak ilgili yazılım programı kullanılarak yapılabilir. Dijital yapılırsa, Progres CapturePro programı kullanmak ve ilk deneyde kullanılan özel büyütme için ölçekleme çubuğu kalibre. Çekilen her görüntü ölçek bar bulunmaktadır. </li><li> ImageJ yazılım programı kullanarak koloni çapı hesaplamak için, her resim dosyasını açın. Aşağıdaki gibi ölçek çubuğu standartlaştırın: araç çubuğundan &quot;Düz çizgi seçeneğini&quot; seçin. Aynı uzunluk ve genişlik düz bir çizgi ile gömülü ölçek çubuğu Yerleşimi. Etiketli sekmesinden &quot;Set Ölçeği&quot; Seç &quot;analiz edin.&quot; Ve &quot;Tamam&quot; seçeneğini seçin; &quot;bilinen mesafe&quot; kutusunda, (yani, 2 mm olarak orijinal ölçekte çubuğundan belirlenir) karşılık gelen uzunluğu yerleştirin. </li><li> Nokta arasında yatay bir çizgi eklemek için &quot;Düz çizgi&quot; seçeneğini kullanın. Çözümle sekmesi altında, &quot;Tedbir&quot; seçeneğini seçin. Yeni Sonuçlar penceresinde, hesaplanan uzunluğu sağlanacaktır. Nokta arasında bir dik çizgi ekleyerek ikinci bir ölçüm alın. Çapı yeniden hesaplamak. Iki ölçümün ortalama kaydedin. Grafik Excel gibi bir yazılım programı kullanarak her noktada, her nokta için ortalama çapı. </li><li> Deneyin sonunda ya da belirli bir zaman noktasında ya da herhangi bir başka olduğunu ortaya çıkarbiyofilm gelişmesi. Sonuna ulaşıldığında, bu Powerpoint gibi bir yazılım programı kullanarak zamanla deseni geliştirme görselleştirmek için bir rakam (lar) içine görüntüleri birleştirmek. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar Bu deneylerde kullandığımız V. sağlam bir agar yüzeyinde kırışık kolonilerin gelişimi değerlendirerek biyofilm oluşumu incelemek için bir model organizma olarak fischeri. V. Biyofilm üreten suşlar 40 saat içinde kapsamlı 3D mimarisi ile fischeri formu koloniler (Şekil 1) 8,9,14. Bir süre boyunca bakıldığında, kontrol suşu tarafından kırışmış koloni oluşumu yaklaşık 12 kadar erken başlatır belirginleşir saat sonrası aşılama (özel koşullarına bağlı olarak) (Şekil 2) 9. Buna karşılık, bir temsilci mutant tarafından biyofilm oluşumu yaklaşık 16 saat sonrasında aşılama 9 kadar başlatarak değil, yaklaşık 4 saat geciktirilir. Aktarım istasyonlarıBu deneylerin ts 9 Bu değerlendirme yarı kantitatif hale zamanlaması nispeten tutarlı olduğunu ileri sürdü. Biyofilm ikinci bir yarı-nicel ölçü zaman içinde gelişen koloninin çapı değişim kullanımını sağlar. Şek. 3A, temsili bir biyofilm-yetkili suşu koloniler oluşturduğunu karmaşıklığı ve biyofilm oluşturan olmayan bir temsilcisi zorlanma göre çapı artar. Bu iki suş oluşturduğu kolonilerin çapları zaman içinde dikkatli ölçümler, biyofilm-yetkili kolonilerin boyutu biyofilm-negatif koloniler daha büyük oranda arttığını ortaya çıkardı ve bitiş saatini noktada iki neredeyse 2 kat farklılık - kat (Şekil 3B). Bir temsili geç zaman ya da &quot;son nokta&quot; koloni morfolojisinin görüntü sık literatürde gösterilmiştir rağmen Böylece, ek, yarı-nicel veri biyofilm kusurun daha iyi anlaşılması izin verecek bir toplanabilir.<img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig1.jpg" /> Şekil 1. Son-nokta tayini. Bu rakam V. temsilcisi (sağ) non-biyofilm oluşturan (solda) ve biyofilm oluşturan suşlar kullanarak bir son nokta tayinin bir örnektir fischeri. Bu görüntüleri 40 saat post-lekelenme toplanmıştır. Bu görüntüler, vahşi tip V ile üretildi fischeri vektör kontrol (non-biyofilm oluşum) veya set Morris ve ark., 2011 için toplanan verilerin bir RSCS aşırı plazmid (biyofilm oluşturan) ve idi kısmını içeren. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig2.jpg" /> Şekil 2. Zaman kurs testi. Üst panelde bir biyofilm-yetkili kontrolü suşu tarafından biyofilm temsilcisi görüntüleri içerir V. Seçilen bir zaman boyunca fischeri. Biyofilm oluşumunun başlatılması 12 saat belirgindir. Alt panel temsilcisi i içerirV. bir mutant mageler biyofilm 16 saat sonrası aşılama de başlatılması ile zamanla kırışmış koloni oluşumunun başlangıcında bir gecikme (4 saat), sergiler fischeri. Bu ırklar arasındaki ince farkları sadece erken zaman noktalarında tespit edilirken 40 saat suşları, biyofilm oluşumunun yoğunluğu ve desenleme benzer unutmayın. Bu görüntüler RSCS aşırı wild-tip ve sypE mutant ile oluşturulan V. fischeri hücreleri ve veri vardı parçası Morris ve ark için toplanan seti., 2011. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig3.jpg" /> Biyofilm oluşumunun bir yarı-nicel analizi Şekil 3. Koloni çapı. V. temsilcisi biyofilm oluşturan (üst panel) ve non-biyofilm oluşturan (alt panel) suşları tarafından biyofilm oluşumu (A) Zaman kurs fischeri. Biyofilm oluşturan gerginlik büyük bir artış sergileyen unutmayınolmayan biyofilm oluşturan suşu göre zamanla çapı. Bu görüntüler, vahşi tip V ile üretildi bir veri RSCS aşırı plazmid (biyofilm oluşturucu) ya da bir vektör kontrol (non-biyofilm oluşturucu) ve edildi parçası içeren fischeri Morris ve ark., 2011 için toplanmıştır ayarlanır. (B) protokolü belirtildiği gibi bu veriler ImageJ ve Excel yazılımı kullanılarak elde edilmiştir paneli A&#39;da iki suşu tarafından zamanla koloni çapı artış bir grafik gösterimidir.

<ol><li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+survival+mechanisms+of+clinically+relevant+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 167-167 (2002).</li>
<li>Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms+as+complex+differentiated+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms as complex differentiated communities.</a> Annu. Rev. Microbiol. 56, 187(2002).</li>
<li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+matrix+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20(2005).</li>
<li>Branda, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11621 (2001).</li>
<li>Beyhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+rugosity+and+biofilm+formation+in+Vibrio+cholerae%3A+comparison+of+VpsT+and+VpsR+regulons+and+epistasis+analysis+of+vpsT%2C+vpsR%2C+and+hapR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Regulation of rugosity and biofilm formation in Vibrio cholerae: comparison of VpsT and VpsR regulons and epistasis analysis of vpsT, vpsR, and hapR.</a> J. Bacteriol. 189, 388(2007).</li>
<li>Enos-Berlage, J. L., Guvener, Z. T., Keenan, C. E., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+determinants+of+biofilm+development+of+opaque+and+translucent+Vibrio+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic determinants of biofilm development of opaque and translucent Vibrio parahaemolyticus.</a> Mol. Microbiol. 55, 1160(2005).</li>
<li>Merritt, J. H., Brothers, K. M., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SadC+reciprocally+influences+biofilm+formation+and+swarming+motility+via+modulation+of+exopolysaccharide+production+and+flagellar+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">SadC reciprocally influences biofilm formation and swarming motility via modulation of exopolysaccharide production and flagellar function.</a> J. Bacteriol. 189, 8154-8154 (2007).</li>
<li>Yip, E. S., Geszvain, K., DeLoney-Marino, C. R., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+symbiosis+regulator+rscS+controls+the+syp+gene+locus%2C+biofilm+formation+and+symbiotic+aggregation+by+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The symbiosis regulator rscS controls the syp gene locus, biofilm formation and symbiotic aggregation by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 62, 1586-1586 (2006).</li>
<li>Morris, A. R., Darnell, C. L., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+a+novel+response+regulator+is+necessary+for+biofilm+formation+and+host+colonization+by+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Inactivation of a novel response regulator is necessary for biofilm formation and host colonization by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 82, 114(2011).</li>
<li>Nyholm, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Vibrio+fischeri+and+nonsymbiotic+bacteria+in+the+dynamics+of+mucus+secretion+during+symbiont+colonization+of+the+Euprymna+scolopes+light+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Roles of Vibrio fischeri and nonsymbiotic bacteria in the dynamics of mucus secretion during symbiont colonization of the Euprymna scolopes light organ.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5113(2002).</li>
<li>Yip, E. S., Grublesky, B. T., Hussa, E. A., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+conserved+cluster+of+genes+promotes+symbiotic+colonization+and+%C3%8F%C6%9254-dependent+biofilm+formation+by+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A novel, conserved cluster of genes promotes symbiotic colonization and Ïƒ54-dependent biofilm formation by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 57, 1485(2005).</li>
<li>Mandel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+regulatory+gene+is+sufficient+to+alter+bacterial+host+range%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range.</a> Nature. 458, 215(2009).</li>
<li>Graf, J., Dunlap, P. V., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+transposon-induced+motility+mutations+on+colonization+of+the+host+light+organ+by+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Effect of transposon-induced motility mutations on colonization of the host light organ by Vibrio fischeri.</a> J. Bacteriol. 176, 6986(1994).</li>
<li>Geszvain, K., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hybrid+sensor+kinase+RscS+integrates+positive+and+negative+signals+to+modulate+biofilm+formation+in+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The hybrid sensor kinase RscS integrates positive and negative signals to modulate biofilm formation in Vibrio fischeri.</a> J. Bacteriol. 190, 4437(2008).</li>
<li>Krasteva, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+cholerae+VpsT+regulates+matrix+production+and+motility+by+directly+sensing+cyclic+di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vibrio cholerae VpsT regulates matrix production and motility by directly sensing cyclic di-GMP.</a> Science. 327, 866(2010).</li>
<li>Romling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+rdar+morphotype%2C+a+multicellular+behaviour+in+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the rdar morphotype, a multicellular behaviour in Enterobacteriaceae.</a> Cell Mol. Life. Sci. 62, 1234(2005).</li>
<li>Berleman, J. E., Chumley, T., Cheung, P., Kirby, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rippling+is+a+predatory+behavior+in+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rippling is a predatory behavior in Myxococcus xanthus.</a> J. Bacteriol. 188, 5888(2006).</li>
<li>Lee, K., Veeranagouda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicrocells+form+by+reductive+division+in+macroscopic+Pseudomonas+aerial+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ultramicrocells form by reductive division in macroscopic Pseudomonas aerial structures.</a> Environ. Microbiol. 11, 1117(2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu çalışmada, biyofilm kullanarak değerlendirmek için bir yarı-nicel yöntemi tarif V. bir model organizma olarak fischeri. Özellikle, katı agar yüzeyinde zamanla kırışmış koloni oluşumu gibi biyofilm oluşumunu ve gelişimini izlemek üzere kamera eki olan bir mikroskop kullanmaktadır. Bu protokol, biz yaygın kırışık koloni gelişimi değerlendirmek için kullanabilecekleri yöntemleri iki belirli türleri özetlemektedir. Bizi ilk önce seçilen bir &quot;nihai&quot; bir zaman noktasında son, genel 3D mimari, desenleme ve benekli bir kültür çapı gözlemlemek sağlar son nokta testi vardır. Bu yaklaşım, biyofilm oluşumu dramatik kusurlarına yol mutant suşlar veya koşulları değerlendirmek için çok kullanışlı olur. Ancak, bu yaklaşım seçilen son nokta önce zaman noktalarında meydana gelen daha ince farkları ayırt etmez. Daha yakından kırışmış koloni oluşumu izlemek için, bize w başlangıcını tanımlayabilirsiniz bir zaman tabii tayini, kullanmakzamanla koloni oluşumu ve gelişimi izlemek rinkled. Bu yaklaşımın bir sonucu olarak, buruşuk koloni oluşumu, 3 boyutlu mimari modelleme ve zamanlaması daha ince farklar tespit edilebilir. Biz biyofilm oluşumu iki yarı-kantitatif testler oluşturmak için bu kez ders testi kullanılır. Öncelikle, bir gerginlik 3D mimarisi geliştirmek için başladığı zaman kontrol suşları ile karşılaştırıldığında edilebilir. Aynı koşullar altında, belirli bir mutantı biyofilm gecikme 9 oldukça tutarlı olduğunu bulduk. Örneğin, Şekil l&#39;de gösterilen veriler. 2, mutant sürekli biyofilm oluşumunu başlatmada bir 4 saat gecikme hakkında sergiledi. Biyofilm ikinci bir yarı-nicel ölçü buruşmuş koloni (spot) çapının büyüklüğü değişimdir. Biz (Şekil 3 buruşuk kolonilerin çapı giderek bitiş zamanını noktada, bir 2-kat farkı yaklaşık ulaşan, non-biyofilm koloniler farklıdır olduğunu bulduk </strong&gt;) (Morris ve Visick, yayınlanmamış veri). Bazı mutantlar farklı davranır mümkün kalmasına rağmen bugüne kadar, biz, (yayınlanmamış veri) (yani, koloni çapı bir artış olmadan biyofilm) diğeri olmadan fenotipi tespit değil. Gerçekten de, V. için rapor edilmiştir koloni çapı önemli bir artış bazı kırışmış koloniler sonucu diğerleri 15 yok ederken bu cholerae. Yine de, zaman içinde çapı değişim değerlendirmek potansiyeli biyofilm mutantlarının ve / veya yardımcı karakterizasyonu gelişimi gecikme ile mutantların ek bir miktar ölçü sağlayabilir. Biyofilm iki önlemler (süresi ve çap) arasında, buruşuk koloni oluşumunun başlangıç ​​belirlenmesi spot çapı belirleyici değil, aynı zamanda daha sübjektif daha duyarlıdır fakat. Böyle bile olsa, iki tedbirler biyofilm araştırmacılar için son derece yararlı ama quantificatio için kolayca uygun olmayan bir fenotip bir yarı-nicel değerlendirmesini sağlamakn. Benekli kültür testleri yaparken, benekli suşları kültüre hangi çevre koşullarının dikkate alınması önemlidir. Buruşuk koloni oluşumu genellikle bitki besin, sıcaklık ve nem dahil olmak üzere çeşitli çevresel koşullar tarafından etkilenir. Deneyler arasındaki değişkenliği azaltmak için, mümkün olduğu kadar (yani bir ayarlanan ses agar standartlaştırılması ve kontrollü bir sıcaklıkta kültür lekeli suşlar) bu koşulları standardize etmek yararlı olur. Lekelenme deneyler arasındaki değişkenliği daha fazla kontrol için deneyler her set içinde uygun kontrol suşları dahil etmek önemlidir. Son olarak, bu deneyler gelen verilerin yorumlamak zaman, buruşuk koloni oluşumu belirgin şekilde farklıdır (örn., biyofilm ya desen farklılıklar bir gecikme) değerlendirmek özellikle herhangi bir deneyde birkaç kez (3 +), gerçekleştirmek için gereklidir. Bu protokolün bazı sınırlamalar şunlardır: 1) determinhücrelerinin büyümesini bir kusur olup olmadığını ing zor olabilir: Sıvı kültürdeki hücre büyümesi doğru büyüme katı besiyerinde oranları ve mümkün olmayabilir, birbirine yapışabilir biyofilm oluşturan hücrelerin, büyüme doğru bir tespiti yansıtmıyor olabilir; 2) büyüme defektleri ile suşlar analiz etmek için sorunlu olacaktır; 3) ince bir biyofilm fenotipleri ile suşlar arasındaki çap farkı ayırt etmek mümkün olmayabilir; 4) konsantrik halka uzamıyor suşları için doğru bir şekilde ölçmek mümkün olmayabilir çaplı değişiklikler; Bu deneysel set-up ile biyofilm Z-boyutu ölçmek için hiçbir şekilde orada) ve 6, 5) desenlendirme biyofilm oluşumu sırasında görülebilir iken, orada çıkan biyofilm desen ölçmek için bir yol yoktur . Bu kısıtlamalara rağmen, bu protokol yine buruşuk koloni oluşumu değerlendirilmesinde yardımcı olması için sayısal veri elde etmek için bir araç sağlar. Bu protokol, biz özel bir görüntüleme kullananSistem kırışmış koloni gelişimi gözlemlemek ve değerlendirmek için (yani, bir Zeiss diseksiyon mikroskobu ve Progres CapturePro görüntüleme yazılımı). Kırışmış, koloni oluşumunun başlangıcında tespit ve böylece bir süre ders yaklaşımı ile gelişimini değerlendirmek yeteneği büyük ölçüde bir mikroskop kullanılarak geliştirilmiştir: Burada anlatılan görüntüleme sistemi güçlüdür. Bu teknoloji kullanılamıyor, ancak protokolü bir zoom odaklı basit bir dijital kamera da dahil olmak üzere diğer ekipman ile kullanım için adapte edilebilir. Bu protokol kırışmış koloni gelişiminin değerlendirilmesi odaklanırken, aynı zamanda ince tabakanın oluşumu, hücre sıvısı kültürü statik olduğu zamanlarda gelişir biyofilm bir formu değerlendirmek için modifiye edilebilir. Bu protokol ayrıca biyofilm gelişimi sırasında benekli kolonilere özel boyalar ile birleşmesiyle içeren biyofilm oluşumu diğer göstergeleri, değerlendirilmesinde yararlı olabilir. Bunlar arasında, ancak bu tür Congo Red ve calcoflu olarak boyalar, bunlarla sınırlı değildirya da bu selüloz, 16 bakteriyel biyofilmlerin ortak bir bileşeni ile bağlanabilirler. Ayrıca, bu protokol, kullanım için geliştirilmiş olmasına rağmen V. fischeri, bu organizma ile sınırlı değil ama bu tür Bacillus subtilis 4, Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, 7 ve Pseudomonas aeruginosa, tüm sergi buruşuk koloni oluşumu gibi birçok farklı organizmalar içinde biyofilm okuyan jeneralize olabilir. Son olarak, ayrıca Pseudomonas aeruginosa 18 Myxococcus Xanthus 17 büyüme ve hava yapısı gelişimi sırasında meydana desenleme, potansiyel olarak bir gelişme modeli, sahip diğer koloni morfolojileri çalışmaya adapte edilebilir. Bu protokol, mikrobiyoloji ve biyofilm araştırmacılar için genel kullanım dolayısıyla olduğunu.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Zeiss STEMI 2000-C Mikroskop Dissecting </td><td> Zeiss </td><td> 45505300000000000 </td><td> (Lukas Mikroskop ile elde edilen) </td></tr><tr><td> Progres C10 PLUS </td><td> Jenoptik Optik Systems GmbH </td><td> 017953-602-26 </td><td> Kamera eki (Lukas Mikroskop ile elde edilen) </td></tr><tr><td> CL 1500 EC Soğuk Işık Kaynağı </td><td> Zeiss </td><td> 4355400000000000 </td><td> (Lukas Mikroskop ile elde edilen) </td></tr><tr><td> Progres CapturePro </td><td> Jenoptik Optik Systems GmbH </td><td> Kayıtlı kamera ile ücretsiz yazılım </td><td> Görüntü yakalama için bilgisayar programı </td></tr><tr><td> Görüntü J </td><td> NIH </td><td> Den Ücretsiz yazılım:ij / download &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html </td><td> Çap ölçümleri için bilgisayar programı </td></tr></tbody></table>

buruşuk koloni gelişimi kullanarak biyofilm oluşumu değerlendirin bir yarı-kantitatif yaklaşım

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biyofilmler, ya bir hücre dışı matris içinde kapsüllendiği hücre yüzeyi bağlı topluluklar, birçok bakteri için ortak bir yaşam biçimi temsil eder. Bir biyofilm içinde, bakteri hücrelerinin genellikle antibiyotik ve diğer çevresel streslere 1 ile geliştirilmiş direnç dahil olmak üzere, fizyolojisi değişmiş sergilemektedir. Ayrıca, biyofilm konak-mikrop ilişkisi önemli rol oynayabilir. Biyofilmler bireysel zaman bakteri geçişi geliştirmek, planktonik hücreler kompleks, çok hücreli topluluklar 2 oluşturur. Laboratuvarda, biyofilm özel biyofilm fenotipleri gelişimini değerlendirerek incelenmektedir. Yaygın bir fenotip biyofilm katı agar ortamı üzerine 3 kırışık ya da buruşuk bakteri kolonileri oluşturulmasını içerir. Buruşuk koloni oluşumu tanımlayıp karakterize değişmiş biyofilm fenotipi gösteren bakteri türleri ve etkileri biyofilm oluşumu, çevresel koşulların araştırılması için özellikle basit ve kullanışlı bir araç sağlar. Wrinkled koloni oluşumu gibi bu tür Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7 gibi Bacillus subtilis 4, ve Gram-negatif bakteriler gibi Gram pozitif bakteriler, her iki dahil olmak üzere bakteriler, çeşitli in biyofilm bir göstergesi olarak hizmet eder, ve Vibrio fischeri 8. Deniz bakterisi V. fischeri ana kolonizasyon sırasında biyofilmlerin kritik rolü nedeniyle biyofilm oluşumu için bir model haline gelmiştir: tarafından üretilen Biyofilmler V. fischeri Hawaiian Bobteyli kalamar Euprymna scolopes 8-10 onun kolonizasyon teşvik. Önemli olarak, in vitro olarak gözlenen fenotipin biyofilm V. yeteneği ile ilişkili fischeri hücreleri etkin konak hayvanların kolonize: suşları artış sergileyerek ise in vitro biyofilm engelliler için suşları, bir kolonizasyon kusur 9,11 sahipbiyofilm fenotipleri kolonizasyon 8,12 için geliştiriliyor. V. fischeri nedenle bakteri biyofilm oluşumu ve biyofilm nasıl etki sahibi kolonizasyon düzenleyen hangi mekanizma ile değerlendirmek için basit bir model sistemi sağlar. Bu yazıda, biyofilm kullanarak değerlendirmek için bir yarı-nicel yöntemi tarif V. bir model sistem olarak fischeri. Bu yöntem katı agar besiyerlerine tanımlanan konsantrasyonları ve hacimleri az bakteri kültürlerinin lekelenme dikkatli içerir; benekli bir kültürün, tek bir bakteri kolonisi eş anlamlıdır. Bu &#39;lekeli kültürü&#39; tekniği tek, belirli zaman noktalarında (uç nokta analizleri) gayri safi biyofilm fenotipleri karşılaştırmak veya koloni çapı biyofilm gelişmesi ve ölçümlerin zaman tabii testler aracılığıyla ince biyofilm fenotipleri belirlemek ve karakterize etmek için kullanılabilir , hangi biyofilm oluşumu etkilenir. Böylece, bu teknik başına, biyofilm bir yarı-nicelik açısındanburuşuk koloni gelişimi ve gelişen yapısı, basit genel morfolojisi ötesine özelliklerinin göreli büyüklüğü zamanlaması ve desenlendirme değerlendirilmesi mitting.

Biz biyofilm oluşumunu araştırmak için basit, yarı-nicel yöntem sağlamak<em&gt; In vitro</em&gt;. Bu yöntem-C 2000 zamanlama ve biyofilm oluşumu desen hem de izlemek için (kamera eklentisi ile) Mikroskop diseksiyon gibi buruşmuş kolonilerin gelişimi değerlendirildi Zeiss STEMI yararlanır.

Buruşuk Koloni Gelişimi kullanarak Biyofilm Oluşumu değerlendirin Bir Yarı-kantitatif Yaklaşım

Ekstrasellüler bir matris içine hapsedilmiş, yüzeye tutunmuş hücre toplulukları olan biyofilmler, birçok bakteri için yaygın bir yaşam biçimini temsil eder. Bir ... içerisinde yer alan...

Bu prosedürün genel amacı, zaman içindeki buruşuk koloni oluşumunun gelişimini değerlendirerek biyofilm oluşumundaki değişiklikleri tanımlamak ve ölçmektir. Bu işlem, öncelikle ilgili bakteri suşlarının sıvı kültürde büyütülmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, kültürlerin besiyeri agar üzerine damlatılmasıdır.Ardından, lekeler, kırışık koloni oluşumunun başlangıcına işaret eden üç boyutlu yapıların gelişmeye başladığı zamanı belirlemek için zaman içinde izlenir. Koloni morfolojisinin gelişimi, artık herhangi bir değişiklik gözlemlenmeyene kadar takip edilir. Sonuç olarak, lekelerin mikroskobu altında incelenmesi, belirli suşlar tarafından veya belirli koşullar altında biyofilm gelişimindeki zamansal farklılıkların yarı nicel bir şekilde gösterilmesini sağlar.Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, buruşuk koloni morfolojisinin gelişimi kullanılarak bakteriyel biyofilm oluşumunun yarı kantitatif bir analizine olanak tanımasıdır. Bu yöntem, Vireo fishery'deki biyofilm oluşumu hakkında içgörü sağlayabildiği gibi; basc, slus, pseudomonas osa ve vial cholera gibi diğer bakteriyel sistemlerdeki biyofilm fenotiplerinin karakterizasyonunda da uygulanabilir. Bu yöntemle ilgili fikri ilk olarak, buruşuk koloni oluşumunun gelişiminde gecikme gösteren bakteriyel mutantları tanımladığımızda edindik.Biofilm oluşumu genellikle hücre yoğunluğu ve büyüme hızından etkilenir. Bu nedenle, kırışık koloni morfolojisini değerlendirmeden önce, büyüme hızını belirlemek amacıyla ilgili suşların büyüme hızı ve verimi tespit edilmelidir. Her suşun optik yoğunluğundaki (OD) artışı zaman içinde ölçün ve verimi veya nihai hücre sayısını belirlemek için bir büyüme eğrisi çizin.Hücre ekim testi kullanılabilir. İlgili bakteri suşları sıvı kültürde büyütülür ve ardından kültürlerin dilüsyonları agar plaklarına ekilir. İnkübasyondan sonra, canlı hücre sayısı hesaplanır ve burada gösterildiği gibi grafiksel olarak sunulur.Kontrol ve ilgili mutant arasındaki en belirgin farkları ortaya çıkaran en iyi damlatma koşullarının belirlenmesi de önemlidir. Bunu gerçekleştirmek için, sıvı kültürdeki büyüme suşlarını farklı besiyerleri veya sıcaklıklar gibi çeşitli koşullar altında ve eksponansiyel veya stasyoner faz gibi farklı büyüme aşamalarında damlatmadan önce, çeşitli hücre yoğunluklarına sahip 10 µL kültürden uygun besiyerlerine damlatın ve koloni morfolojileri belirginleşene kadar istenen sıcaklıkta inkübe edin. Bu sayede, belirli bir suş seti veya koşullar için bu prosedüre başlamak üzere optimal bir başlangıç OD değeri belirlenebilir.Agar plaklarındaki v Fisher göz hücrelerini, gerekli antibiyotikleri içeren beş mililitre LB tuzlu veya LBS besiyerine inoküle edin ve 28 °C'de çalkalamalı olarak gece boyunca inkübe edin; ertesi sabah hücreleri, beş mililitre taze LBS besiyerine 1/100 dilüsyonla alt kültüre aktarın ve hücreler 600 nanometrede istenen OD değerine ulaşana kadar aynı koşullar altında inkübe edin. Vibrio fii için en iyi sonuçlar, yaklaşık 0,2 OD değerindeki kültürlerden noktalar oluşturulduğunda elde edilir. Ardından, her bir kültürden bir mililitreyle mikro santrifüj tüpüne pipetleyin ve maksimum hızda santrifüjleyin.Bir dakika boyunca süpernatantı aspirasyonla uzaklaştırın ve pelletlemi 1 mL steril, %70 yapay deniz suyu veya SW santrifüjünde yeniden süspanse edin. Hücreler için bu yıkama adımı, kalıntı besiyerini ve hücre dışı bileşenleri uzaklaştıracaktır. Santrifüjden sonra süpernatantı uzaklaştırın ve her örneğin 600 nanometredeki OD ile tahmin edilen hücre sayısını içerdiğinden emin olmak için yıkanmış pelleti 1 mL %70 A SW içinde yeniden süspanse edin.Daha konsantre örnekleri ek %70A SW spot ile seyrelterek gerekli ayarlamaları yapın, her kültürden 10 µL'yi gerekli antibiyotikleri içeren LBS plaklarına damlatın. Pipeti agar yüzeyinin hemen üzerinde parmağınızla kontrol ettiğinizden emin olun ve damlatma işlemini eğik değil, dikey olarak gerçekleştirin. Spotun homojen dağılımı için sıvıyı yavaşça boşaltın; aynı plak üzerine uygun pozitif ve negatif kontrolleri ekleyin.Küçük plaklarda buruşuk koloni oluşumu değerlendirilirken, AFL varyasyonu biyofilm gelişimini etkileyebilir. Bu prosedürün en zor yönü, buruşuk koloni oluşumunun başlangıcını tespit etmektir. Bazen bu durum, gelişim gerçekleştikten sonra belirgin hale gelir.Kırışık koloni gelişiminin başlangıcını yakalamak için, belirli bir zaman dilimi içerisinde saatlik zaman noktaları alırız. Bu durum, gelişim başladıktan sonra geri dönüp karşılaştırmalar yapmamıza da olanak tanır. Damlatılan kültürün eşit şekilde dağılmış olduğundan emin olmak için, plakayı inkübatöre taşımadan önce damlanın kurumasını bekleyin, plakaları ters çevirin ve 28 °C'de inkübe edin.Damlatılan kültürlerin morfolojisini değerlendirmenin bir yolu, damlatma işleminden sonra önceden belirlenmiş bir zaman noktasında buruşuk koloni oluşumunun değerlendirilmesini içeren bir uç nokta analizidir. Bu, buruşuk koloni oluşumunun değerlendirildiği bir uç nokta analizinden alınan temsili bir sonuçtur. Damlatmadan 40 saat sonra, solda biofilm oluşturmayan bir Vibrio FII suşu ve sağda biofilm oluşturan bir suş gösterilmektedir.Bitiş noktası analizi, biyofilm oluşumunda ciddi kusurlar sergileyen veya sergileyeceği öngörülen suşlar için kullanışlıdır. Koloni morfolojisini değerlendirmek için kullanılan bir diğer analiz ise, damlatma sonrası zamanı kolayca takip edebilmek için buruşuk koloni oluşumunun damlatma sonrası belirli bir süre boyunca değerlendirildiği zaman serisi analizidir. Yukarıya doğru sayan bir zamanlayıcı ayarlayın.Bu demonstrasyonda, damlatma işleminden 12 ila 15 saat sonra başlanarak, büyüyen lekenin morfolojisi kamerayla donatılmış bir diseksiyon stereo mikroskobuyla saatlik olarak izlenecek; görüntüleme ve görüntü analizi yapılacaktır. Koloni morfolojisini gözlemlemek ve belgelemekle birlikte, buruşuk koloni oluşumunun başlangıcını ve ilerleyişini değerlendirmek için yazılım programları kullanılır. Damlatılmış kültürler görüntülenmeden önce, en net görüntüyü elde etmek için Petri kutusunun kapağı genellikle çıkarılır.Burada, görüntüler yukarıdan yakalanırken lekeler, şeffaf bir cam tabla aracılığıyla soğuk bir ışık kaynağı ile alttan aydınlatılır. Vibrio fischeri kolonileri yarı saydam olduğundan, bu düzenek buruşuk koloni gelişiminin görüntülenmesi için idealdir. Buruşuk koloni gelişimini en iyi şekilde görselleştirmek için, gelişmekte olan biyofilmlerin üç boyutlu morfolojisinin ayırt edilebileceği şekilde, bakteri kolonilerinin altındaki hem ışık yoğunluğunu hem de yansıma açısını ayarlayın.Benekli koloni ile çevredeki agar arka planı arasında en güçlü kontrastı sağlayan optimal aydınlatma koşullarını belirleyin. Deney boyunca görüntü toplarken aynı büyütmeyi kullanmak önemlidir; kameranın arkasında bulunan kolu kullanarak görüntüyü mikroskobun okülerinden bilgisayar ekranına aktarın, görünümü ayarlayın, uygun şekilde odaklayın ve ardından görüntüyü yakalayın; buruşuk koloni oluşumunun başlangıcını ve gelişimini belgelemek için uygun görüntüler yakalayın. Deney, biyofilmin daha fazla gelişmediği noktada sona erer.Elde edilen deneylerin sonunda, her bir suş veya koşul için zaman içindeki desen gelişimini görselleştirmek amacıyla görüntüler şekiller haline getirilir. İnokülasyon anından kırışık koloni oluşumunun başladığı ana kadar ne kadar süre geçtiğine dikkat edin; kırışık koloni oluşumunun başlangıcı, desenleşmenin ve 3D yapıların oluşumunun ilk kez belirginleştiği zaman noktası olarak tanımlanır. Bu örnekte, üst panelde gösterilen biyofilm yeteneğine sahip bir Vibrio FII kontrol suşu için biyofilm oluşumunun başlangıcı 12. saatte belirgindir.Alt panelde, kırışık koloni oluşumunun başlangıcında dört saatlik bir gecikme sergileyen ve biyofilm oluşumu inokülasyondan 16 saat sonra başlayan bir Vibrio FII mutant suşunun temsili görüntüleri yer almaktadır. 40 saatlik erken zaman noktalarında bu suşlar arasında küçük farklılıklar gözlemlense de, kırışık koloni oluşumu başladıktan sonraki her zaman noktasında suşların biyofilm oluşumunun yoğunluğu ve örüntüsü açısından benzer göründüğüne dikkat ediniz. Kırışık koloni gelişim örüntüsü not edilmelidir.Mimari, panel A'da gösterildiği gibi dıştan içe doğru veya panel B'de gösterildiği gibi içten dışa doğru gelişebilir. Bu değerlendirme, farklı suşlar tarafından veya farklı koşullar altında oluşturulan biyofilmleri ayırt etmek için bir mekanizma sağlar. Biyofilm oluşumuna ilişkin ikinci bir yarı nicel ölçüm, gelişmekte olan koloninin zamanla değişen koloni çaparından yararlanır. Üst panelde gösterildiği gibi, temsili bir biyofilm yetkinliği suşu, karmaşıklığı ve çapı artan koloniler oluşturur.Buna karşılık, alt panelde gösterilen başka bir suş biyofilm oluşturmamaktadır. Son olarak, bu şekil koloni çapındaki artışın zaman içindeki grafiksel temsilini göstermektedir. Aynı iki suş arasında, biyofilm oluşturma yeteneğine sahip suş beyaz dairelerle temsil edilmiştir.Biyofilm oluşturmayan suş ise siyah karelerle temsil edilmektedir. Bu analiz, biyofilm oluşturma yeteneğine sahip kolonilerin boyutunun, biyofilm negatif kolonilere göre daha yüksek bir oranda arttığını ve son zaman noktasında iki grup arasında yaklaşık iki kat fark olduğunu ortaya koymuştur. Bu prosedür gerçekleştirilirken, her bir suşun dikkatlice damlatıldığından emin olmak ve her suş için başlangıçtaki buruşuk koloni oluşumunu belgelemeyi unutmamak önemlidir.Bu protokolün ardından, süreçler ve biyofilm oluşumu ile ilgili ek soruları yanıtlamak amacıyla iCal analizi veya kristal geniş kapsamlı boyama gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

a-semi-quantitative-approach-to-assess-biofilm-formation-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tahlil, bakteri ve mantar erken biyofilm oluşumunu ölçmek için hızlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem mikrotiter plate mikrobiyal biyofilm oluşumu için alt tabaka olarak kullanır ve biyofilm kristal viyole suşu kullanılarak görüntülenmiştir. Tahlil ya erken biyofilm oluşumu için bir kalitatif veya kantitatif sağlar.

Microtiter Bulaşık Biyofilm Oluşumu Testi

Bu makalede, 8 kuyu odasına slayt içinde yetişen bir bakteriyel biyofilm oluşumu ve görselleştirme için prosedürü anlatılmaktadır.

8-iyi Odası Slayt in vitro Biyofilm Oluşumu

Kaynak: Bucher, T. ve diğerleri, B. subtilis biyofilmlerini küçük moleküllü biyofilm inhibitörlerinin karakterizasyonu için bir model olarak inceleme yöntemleri. J. Vis. Exp.(2016)Bu video, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için olgun bakteriyel biyofilm kolonilerinin hazırlanmasını gösteriyor. Fiksasyon, kurutma, montaj ve metal kaplama adımlarını kapsayarak biyofilm morfolojisini koruma ve görselleştirmeyi içerir.

Morfolojik Analiz için Bakteriyel Biyofilm Kolonilerinin Hazırlanması

Video, biyofilm oluşumunu değerlendirmek için bir katı faz yapışma testini göstermektedir. Çok kuyucuklu bir plakada, safra tuzu takviyeli ortamdaki bakteriler katı yüzeylere yapışarak biyofilmler oluşturur, bu da kristal viyole boyama ve etanol muamelesi yoluyla kolorimetri ile doğrulanır.

Biyofilm oluşumunu değerlendirmek için bir katı faz uyum testi

Biyofilmler içindeki üç hücresel ve hücre dışı bileşenin eşzamanlı niceliği ve karşılaştırılması için bir protokol sunulmuştur. Metodoloji, konfokal lazer tarama mikroskobu, biyofilm yapısal analiz ve görselleştirme yazılımı ve istatistiksel analiz yazılımının kullanımını içerir.

Hücresel ve Biyofilmler Ekstrasellüler Bileşenleri Eşzamanlı Kantitasyonu

Bu çalışma, biyofilm inhibitörlerini ve bunların Bacillus subtilis çok hücrelilik üzerindeki etkilerini incelemek için tekrarlanabilir metodolojilerin geliştirilmesini sunmaktadır.

Araştırma yöntemleri<em&gt; B. subtilis</emKüçük Molekül Biyofilm İnhibitörleri Karakterizasyonu için Bir Model Olarak&gt; Biyofilmler

Bu protokol büyümek ve niteliksel konfokal ve elektron mikroskobu ile mantar hif bakteri biyofilm analiz etmek için yeni bir yöntem açıklanır.

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Fiksasyon, parafin katıştırma ve mikrobiyal koloni biyofilmler için ince parça teknikler açıklanmaktadır. Hazır örnekleri, mikroskobu tarafından biyofilm altyapı ve muhabir ifade desenleri görüntülenmeyecektir.

Parafin gömme ve ince mikrobiyal koloni biyofilmler mikroskobik analizlerin yapıldığı için kesit

Bu protokol, aşının hazırlanmasını, kristal viyole boya kullanılarak mikrotitre plakalar üzerinde biyofilm miktarının belirlenmesini, biyofilmlerdeki canlı sayımı ve Acinetobacter biyofilmlerinin görselleştirilmesini açıklar.

Acinetobacter Biyofilmleri için Miktar Tayini, Canlılık Değerlendirmesi ve Görselleştirme Stratejileri

Bu protokol, kristal-mor biyokütle testleri, zaman geçişli faz kontrast kinetikleri, konfokal 3-D/matris haritalama, SEM ultrayapı ve in vivo hamster enfeksiyon modülünü birleştirerek Leptospira biyofilminin işlevsel rolünü geliştirmek, niceliklendirmek, karakterize etmek ve araştırmak için modüler, BSL-2 iş akışı sunar; böylece mutantların standart değerlendirilmesini ve laboratuvarlar arasında anti-biyofilm müdahalelerini mümkün kılar.

Leptospira Biyofilmlerinin Nicel, Yapısal ve Fonksiyonel Analizi İçin Modüler İş Akışı

Keşfedin biyofilm oluşumunu yarı-kantitatif olarak değerlendiren buruşuk koloni gelişimi yöntemini. Bu teknik, bakteri suşları arasındaki fenotipik farklılıkları mikroskopi ile gözlemleyerek mikrobiyoloji araştırmalarında güvenilir sonuçlar sunar.

Buruşuk Koloni Gelişimi kullanarak Biyofilm Oluşumu değerlendirin Bir Yarı-kantitatif Yaklaşım

Daha fazla video keşfet