Buruşuk Koloni Gelişimi kullanarak Biyofilm Oluşumu değerlendirin Bir Yarı-kantitatif Yaklaşım

Bu prosedürün genel amacı, zaman içindeki buruşuk koloni oluşumunun gelişimini değerlendirerek biyofilm oluşumundaki değişiklikleri tanımlamak ve ölçmektir. Bu işlem, öncelikle ilgili bakteri suşlarının sıvı kültürde büyütülmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, kültürlerin besiyeri agar üzerine damlatılmasıdır.

Ardından, lekeler, kırışık koloni oluşumunun başlangıcına işaret eden üç boyutlu yapıların gelişmeye başladığı zamanı belirlemek için zaman içinde izlenir. Koloni morfolojisinin gelişimi, artık herhangi bir değişiklik gözlemlenmeyene kadar takip edilir. Sonuç olarak, lekelerin mikroskobu altında incelenmesi, belirli suşlar tarafından veya belirli koşullar altında biyofilm gelişimindeki zamansal farklılıkların yarı nicel bir şekilde gösterilmesini sağlar.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, buruşuk koloni morfolojisinin gelişimi kullanılarak bakteriyel biyofilm oluşumunun yarı kantitatif bir analizine olanak tanımasıdır. Bu yöntem, Vireo fishery'deki biyofilm oluşumu hakkında içgörü sağlayabildiği gibi; basc, slus, pseudomonas osa ve vial cholera gibi diğer bakteriyel sistemlerdeki biyofilm fenotiplerinin karakterizasyonunda da uygulanabilir. Bu yöntemle ilgili fikri ilk olarak, buruşuk koloni oluşumunun gelişiminde gecikme gösteren bakteriyel mutantları tanımladığımızda edindik.

Biofilm oluşumu genellikle hücre yoğunluğu ve büyüme hızından etkilenir. Bu nedenle, kırışık koloni morfolojisini değerlendirmeden önce, büyüme hızını belirlemek amacıyla ilgili suşların büyüme hızı ve verimi tespit edilmelidir. Her suşun optik yoğunluğundaki (OD) artışı zaman içinde ölçün ve verimi veya nihai hücre sayısını belirlemek için bir büyüme eğrisi çizin.

Hücre ekim testi kullanılabilir. İlgili bakteri suşları sıvı kültürde büyütülür ve ardından kültürlerin dilüsyonları agar plaklarına ekilir. İnkübasyondan sonra, canlı hücre sayısı hesaplanır ve burada gösterildiği gibi grafiksel olarak sunulur.

Kontrol ve ilgili mutant arasındaki en belirgin farkları ortaya çıkaran en iyi damlatma koşullarının belirlenmesi de önemlidir. Bunu gerçekleştirmek için, sıvı kültürdeki büyüme suşlarını farklı besiyerleri veya sıcaklıklar gibi çeşitli koşullar altında ve eksponansiyel veya stasyoner faz gibi farklı büyüme aşamalarında damlatmadan önce, çeşitli hücre yoğunluklarına sahip 10 µL kültürden uygun besiyerlerine damlatın ve koloni morfolojileri belirginleşene kadar istenen sıcaklıkta inkübe edin. Bu sayede, belirli bir suş seti veya koşullar için bu prosedüre başlamak üzere optimal bir başlangıç OD değeri belirlenebilir.

Agar plaklarındaki v Fisher göz hücrelerini, gerekli antibiyotikleri içeren beş mililitre LB tuzlu veya LBS besiyerine inoküle edin ve 28 °C'de çalkalamalı olarak gece boyunca inkübe edin; ertesi sabah hücreleri, beş mililitre taze LBS besiyerine 1/100 dilüsyonla alt kültüre aktarın ve hücreler 600 nanometrede istenen OD değerine ulaşana kadar aynı koşullar altında inkübe edin. Vibrio fii için en iyi sonuçlar, yaklaşık 0,2 OD değerindeki kültürlerden noktalar oluşturulduğunda elde edilir. Ardından, her bir kültürden bir mililitreyle mikro santrifüj tüpüne pipetleyin ve maksimum hızda santrifüjleyin.

Bir dakika boyunca süpernatantı aspirasyonla uzaklaştırın ve pelletlemi 1 mL steril, %70 yapay deniz suyu veya SW santrifüjünde yeniden süspanse edin. Hücreler için bu yıkama adımı, kalıntı besiyerini ve hücre dışı bileşenleri uzaklaştıracaktır. Santrifüjden sonra süpernatantı uzaklaştırın ve her örneğin 600 nanometredeki OD ile tahmin edilen hücre sayısını içerdiğinden emin olmak için yıkanmış pelleti 1 mL %70 A SW içinde yeniden süspanse edin.

Daha konsantre örnekleri ek %70A SW spot ile seyrelterek gerekli ayarlamaları yapın, her kültürden 10 µL'yi gerekli antibiyotikleri içeren LBS plaklarına damlatın. Pipeti agar yüzeyinin hemen üzerinde parmağınızla kontrol ettiğinizden emin olun ve damlatma işlemini eğik değil, dikey olarak gerçekleştirin. Spotun homojen dağılımı için sıvıyı yavaşça boşaltın; aynı plak üzerine uygun pozitif ve negatif kontrolleri ekleyin.

Küçük plaklarda buruşuk koloni oluşumu değerlendirilirken, AFL varyasyonu biyofilm gelişimini etkileyebilir. Bu prosedürün en zor yönü, buruşuk koloni oluşumunun başlangıcını tespit etmektir. Bazen bu durum, gelişim gerçekleştikten sonra belirgin hale gelir.

Kırışık koloni gelişiminin başlangıcını yakalamak için, belirli bir zaman dilimi içerisinde saatlik zaman noktaları alırız. Bu durum, gelişim başladıktan sonra geri dönüp karşılaştırmalar yapmamıza da olanak tanır. Damlatılan kültürün eşit şekilde dağılmış olduğundan emin olmak için, plakayı inkübatöre taşımadan önce damlanın kurumasını bekleyin, plakaları ters çevirin ve 28 °C'de inkübe edin.

Damlatılan kültürlerin morfolojisini değerlendirmenin bir yolu, damlatma işleminden sonra önceden belirlenmiş bir zaman noktasında buruşuk koloni oluşumunun değerlendirilmesini içeren bir uç nokta analizidir. Bu, buruşuk koloni oluşumunun değerlendirildiği bir uç nokta analizinden alınan temsili bir sonuçtur. Damlatmadan 40 saat sonra, solda biofilm oluşturmayan bir Vibrio FII suşu ve sağda biofilm oluşturan bir suş gösterilmektedir.

Bitiş noktası analizi, biyofilm oluşumunda ciddi kusurlar sergileyen veya sergileyeceği öngörülen suşlar için kullanışlıdır. Koloni morfolojisini değerlendirmek için kullanılan bir diğer analiz ise, damlatma sonrası zamanı kolayca takip edebilmek için buruşuk koloni oluşumunun damlatma sonrası belirli bir süre boyunca değerlendirildiği zaman serisi analizidir. Yukarıya doğru sayan bir zamanlayıcı ayarlayın.

Bu demonstrasyonda, damlatma işleminden 12 ila 15 saat sonra başlanarak, büyüyen lekenin morfolojisi kamerayla donatılmış bir diseksiyon stereo mikroskobuyla saatlik olarak izlenecek; görüntüleme ve görüntü analizi yapılacaktır. Koloni morfolojisini gözlemlemek ve belgelemekle birlikte, buruşuk koloni oluşumunun başlangıcını ve ilerleyişini değerlendirmek için yazılım programları kullanılır. Damlatılmış kültürler görüntülenmeden önce, en net görüntüyü elde etmek için Petri kutusunun kapağı genellikle çıkarılır.

Burada, görüntüler yukarıdan yakalanırken lekeler, şeffaf bir cam tabla aracılığıyla soğuk bir ışık kaynağı ile alttan aydınlatılır. Vibrio fischeri kolonileri yarı saydam olduğundan, bu düzenek buruşuk koloni gelişiminin görüntülenmesi için idealdir. Buruşuk koloni gelişimini en iyi şekilde görselleştirmek için, gelişmekte olan biyofilmlerin üç boyutlu morfolojisinin ayırt edilebileceği şekilde, bakteri kolonilerinin altındaki hem ışık yoğunluğunu hem de yansıma açısını ayarlayın.

Benekli koloni ile çevredeki agar arka planı arasında en güçlü kontrastı sağlayan optimal aydınlatma koşullarını belirleyin. Deney boyunca görüntü toplarken aynı büyütmeyi kullanmak önemlidir; kameranın arkasında bulunan kolu kullanarak görüntüyü mikroskobun okülerinden bilgisayar ekranına aktarın, görünümü ayarlayın, uygun şekilde odaklayın ve ardından görüntüyü yakalayın; buruşuk koloni oluşumunun başlangıcını ve gelişimini belgelemek için uygun görüntüler yakalayın. Deney, biyofilmin daha fazla gelişmediği noktada sona erer.

Elde edilen deneylerin sonunda, her bir suş veya koşul için zaman içindeki desen gelişimini görselleştirmek amacıyla görüntüler şekiller haline getirilir. İnokülasyon anından kırışık koloni oluşumunun başladığı ana kadar ne kadar süre geçtiğine dikkat edin; kırışık koloni oluşumunun başlangıcı, desenleşmenin ve 3D yapıların oluşumunun ilk kez belirginleştiği zaman noktası olarak tanımlanır. Bu örnekte, üst panelde gösterilen biyofilm yeteneğine sahip bir Vibrio FII kontrol suşu için biyofilm oluşumunun başlangıcı 12. saatte belirgindir.

Alt panelde, kırışık koloni oluşumunun başlangıcında dört saatlik bir gecikme sergileyen ve biyofilm oluşumu inokülasyondan 16 saat sonra başlayan bir Vibrio FII mutant suşunun temsili görüntüleri yer almaktadır. 40 saatlik erken zaman noktalarında bu suşlar arasında küçük farklılıklar gözlemlense de, kırışık koloni oluşumu başladıktan sonraki her zaman noktasında suşların biyofilm oluşumunun yoğunluğu ve örüntüsü açısından benzer göründüğüne dikkat ediniz. Kırışık koloni gelişim örüntüsü not edilmelidir.

Mimari, panel A'da gösterildiği gibi dıştan içe doğru veya panel B'de gösterildiği gibi içten dışa doğru gelişebilir. Bu değerlendirme, farklı suşlar tarafından veya farklı koşullar altında oluşturulan biyofilmleri ayırt etmek için bir mekanizma sağlar. Biyofilm oluşumuna ilişkin ikinci bir yarı nicel ölçüm, gelişmekte olan koloninin zamanla değişen koloni çaparından yararlanır. Üst panelde gösterildiği gibi, temsili bir biyofilm yetkinliği suşu, karmaşıklığı ve çapı artan koloniler oluşturur.

Buna karşılık, alt panelde gösterilen başka bir suş biyofilm oluşturmamaktadır. Son olarak, bu şekil koloni çapındaki artışın zaman içindeki grafiksel temsilini göstermektedir. Aynı iki suş arasında, biyofilm oluşturma yeteneğine sahip suş beyaz dairelerle temsil edilmiştir.

Biyofilm oluşturmayan suş ise siyah karelerle temsil edilmektedir. Bu analiz, biyofilm oluşturma yeteneğine sahip kolonilerin boyutunun, biyofilm negatif kolonilere göre daha yüksek bir oranda arttığını ve son zaman noktasında iki grup arasında yaklaşık iki kat fark olduğunu ortaya koymuştur. Bu prosedür gerçekleştirilirken, her bir suşun dikkatlice damlatıldığından emin olmak ve her suş için başlangıçtaki buruşuk koloni oluşumunu belgelemeyi unutmamak önemlidir.

Bu protokolün ardından, süreçler ve biyofilm oluşumu ile ilgili ek soruları yanıtlamak amacıyla iCal analizi veya kristal geniş kapsamlı boyama gibi diğer yöntemler uygulanabilir.