Buruşuk Koloni Gelişimi kullanarak Biyofilm Oluşumu değerlendirin Bir Yarı-kantitatif Yaklaşım

Bu prosedürün genel amacı, zaman içinde buruşuk koloni oluşumunun gelişimini değerlendirerek biyofilm oluşumundaki değişiklikleri belirlemek ve ölçmektir. Bu, sıvı kültürde ilgilenilen ilk büyüyen bakteri suşları ile gerçekleştirilir. İkinci adım, kültürleri besin agar üzerine yerleştirmektir.

Daha sonra, lekeler, buruşuk koloni oluşumunun başladığını gösteren üç boyutlu yapılar geliştirmeye başladıkları zamanı belirlemek için zaman içinde izlenir. Koloni morfolojisinin gelişimi, başka bir değişiklik görülmeyene kadar izlenir. Sonuç olarak, lekelerin mikroskobu, belirli suşlar tarafından veya belirli koşullar altında yarı kantitatif bir şekilde zaman içinde biyofilm gelişimindeki farklılıkları göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, buruşuk koloni morfolojisinin geliştirilmesini kullanarak bakteriyel biyofilm oluşumunun yarı kantitatif bir analizine izin vermesidir. Bu yöntem Vireo balıkçılığında biyofilm oluşumu hakkında bilgi sağlayabilse de, basc, slus, pseudomonas osa ve flakon kolera gibi diğer bakteri sistemlerindeki biyofilm fenotiplerinin karakterizasyonuna da uygulanabilir. Bu yöntem için ilk olarak, buruşuk koloni oluşumunun gelişiminde gecikme gösteren bakteri mutantlarını tanımladığımızda aklımıza geldi.

Biyofilm oluşumu genellikle hücre yoğunluğu ve büyüme hızından etkilenir. Bu nedenle, buruşuk koloni morfolojisini değerlendirmeden önce, büyüme hızını belirlemek için ilgilenilen suşların büyüme hızı ve verimi belirlenmelidir. Zaman içinde her bir suşun optik yoğunluğundaki veya OD'sindeki artışı ölçün ve verimi veya nihai hücre sayısını belirlemek için bir büyüme eğrisi çizin.

Bir hücre kaplama tahlili kullanılabilir. İlgilenilen bakteri suşları sıvı kültürde büyütülür ve daha sonra kültürlerin seyreltmeleri agar plakaları üzerine kaplanır. İnkübasyondan sonra, canlı hücrelerin sayısı hesaplanır ve burada gösterildiği gibi grafiksel olarak temsil edilir.

Kontrol ve ilgilenilen mutant arasındaki en belirgin farkları ortaya çıkaran koşulları tespit etmek için en iyi koşulları belirlemek de önemlidir. Bunu, farklı ortamlar veya sıcaklıklar gibi çeşitli koşullar altında sıvı kültürdeki büyüme suşlarını tespit etmeden önce ve üstel veya durağan faz gibi farklı büyüme aşamalarına, çeşitli hücre yoğunluklarında 10 mikrolitre kültürü uygun ortama yerleştirin ve koloni morfolojileri belirginleşene kadar istenen sıcaklıkta inkübe edin. Bu şekilde, bu prosedüre başlamak için belirli bir suş veya koşul seti için optimal bir başlangıç OD'si belirlenebilir.

Agar plakalarından v Fisher gözü hücrelerini, gerekli antibiyotikleri içeren beş mililitre LB tuzu veya LBS ortamına aşılayın, ertesi sabah alt kültürde gece boyunca 28 santigrat derecede çalkalanarak hücrelere inkübe edin, bir ila 100 seyreltme ile beş mililitre taze LBS ortamına inkübe edin, hücreler 600 nanometrede istenen OD'ye ulaşana kadar aynı koşullar altında inkübe edin. Vibrio fii için en iyi sonuçlar, OD'si yaklaşık 0.2 olan kültürlerden lekeler oluşturulduğunda elde edilir. Daha sonra pipetleyin, her kültürden bir mililitre bir mikro füj tüpüne koyun ve maksimum hızda santrifüjleyin.

Bir dakika boyunca, supinatı aspirasyonla çıkarın ve peleti bir mililitre steril,% 70 yapay deniz suyu veya bir SW santrifüjünde yeniden süspanse edin. Hücreler, yine, bu yıkama adımı, artık ortamı ve hücre dışı bileşenleri uzaklaştıracaktır. Santrifüjlemeden sonra, her numunenin OD.At 600 nanometre tarafından tahmin edilen hücre sayısını içerdiğinden emin olmak için supinatı çıkarın ve yıkanmış peleti bir mililitre% 70A SW'de yeniden süspanse edin.

Gerekli antibiyotikleri içeren LBS plakalarına daha konsantre numuneleri, her kültürden 10 mikrolitre ek% 70 A SW noktası ile seyrelterek gerekli ayarlamaları yapın. Pipeti parmağınızla agar yüzeyinin hemen üzerinde incelediğinizden ve açılı olarak değil, dikey olarak tespit ettiğinizden emin olun. Spotun eşit dağılımı için sıvıyı yavaşça boşaltın, aynı plakaya uygun pozitif ve negatif kontrolleri ekleyin.

Buruşuk koloni oluşumunu küçük plakalar olarak değerlendirirken, AFL varyasyonu biyofilm gelişimini etkileyebilir. Bu prosedürün en zor yönü, buruşuk koloni oluşumunun başlangıcını belirlemektir. Bazen sadece gelişme meydana geldikten sonra belirgindir.

Kırışıklık kolonisi gelişiminin başlangıcını yakalamak için, belirli bir zaman dilimi içinde saatlik zaman noktaları alıyoruz. Bu aynı zamanda geliştirme başladıktan sonra geri dönüp karşılaştırma yapmamıza da izin verir. Benekli kültürün eşit şekilde dağıldığından emin olmak için, plakayı inkübatöre taşımadan önce lekenin kurumasını bekleyin, plakaları ters çevirin ve 28 santigrat derecede inkübe edin.

Benekli kültürlerin morfolojisini değerlendirmenin bir yolu, buruşuk koloni oluşumunun değerlendirilmesini ve lekelenmeden sonra önceden belirlenmiş bir zaman noktasını içeren bir son nokta testidir. Bu, buruşuk koloni oluşumunun değerlendirildiği bir son nokta testinden elde edilen temsili bir sonuçtur. Lekelenmeden 40 saat sonra, solda biyofilm oluşturmayan bir Vibrio FII suşu ve sağda biyofilm oluşturan bir suş gösterilir.

Son nokta testi, biyofilm oluşumunda ciddi kusurlar sergileyen veya sergilemesi önerilen suşlar için yararlıdır. Koloni morfolojisini değerlendirmek için başka bir tahlil, lekelenme sonrası zamanı kolayca takip etmek için buruşuk koloni oluşumunun lekelenmeden sonraki bir süre boyunca değerlendirildiği bir zaman kursu testidir. Saymak için bir zamanlayıcı ayarlayın.

Bu gösteride, büyüyen noktanın morfolojisi, takip eden 12 ila 15 saat arasında başlayarak, bir kamera eklentisi ve görüntü elde etme ve görüntü analizi ile bir diseksiyon dürbünü tespit ederek saatlik olarak izlenecektir. Koloni morfolojisini gözlemlemek ve belgelemek ve buruşuk koloni oluşumunun başlangıcını ve ilerlemesini değerlendirmek için yazılım programları kullanılır. Benekli kültürleri görüntülemeden önce, en net görüntüyü sağlamak için Petri plakasının kapağı tipik olarak çıkarılır.

Burada, görüntüler yukarıdan çekilirken, noktalar soğuk bir ışık kaynağına sahip şeffaf bir cam sahne aracılığıyla alttan aydınlatılır. Bu kurulum, buruşuk koloni gelişimini görüntülemek için idealdir çünkü Vibrio balıkçı gözü kolonileri yarı saydamdır. Buruşuk koloni gelişimini en iyi şekilde görselleştirmek için, bakteri kolonilerinin altındaki hem aydınlatma yoğunluğunu hem de yansıma açısını, gelişmekte olan biyofilmlerin üç boyutlu morfolojisi ayırt edilebilecek şekilde ayarlayın.

Benekli koloni ile çevredeki agar arka planı arasında en güçlü kontrastı sağlayan en uygun aydınlatma koşullarını belirleyin. Kameranın arkasında bulunan kolu kullanarak deney boyunca görüntü toplarken aynı büyütmeyi kullanmak, görünümü mikroskobun göz merceğinden bilgisayar ekranına geçirmek, görünümü ayarlamak, buna göre odaklanmak ve ardından görüntüyü yakalamak, buruşuk koloni oluşumunun başlangıcını ve gelişimini belgelemek için uygun görüntüleri yakalamak önemlidir. Deneyin sonu, biyofilmde daha fazla gelişme olmadığında ortaya çıkar.

Elde edilen deneylerin sonunda, her bir suş veya koşul için zaman içindeki model gelişimini görselleştirmek için görüntüler rakamlar halinde birleştirilir. Aşılama zamanından buruşuk koloni oluşumunun başladığı zamana kadar ne kadar zaman geçtiğine, buruşuk koloni oluşumunun başladığı zamana kadar ne kadar zaman geçtiğinin, desen oluşumunun ve 3D yapıların oluşumunun ilk belirgin olduğu zaman noktasında tanımlandığına dikkat edin. Bu örnekte, biyofilm oluşumunun başlaması, üst panelde gösterilen Vibrio FII'nin biyofilm yetkin bir kontrol suşu için 12 saatte belirgindir.

Alt panelde, aşılamadan 16 saat sonra biyofilm oluşumunun başlamasıyla zaman içinde buruşuk koloni oluşumunun başlangıcında dört saatlik bir gecikme sergileyen mutant bir Vibrio FII suşunun temsili bir görüntüsü. Bu suşlar arasındaki ince farklılıklar 40 saatlik erken zaman noktalarında gözlenirken, suşların, buruşuk koloni oluşumunun başlamasını takip eden her zaman noktasında biyofilm oluşumunun yoğunluğu ve paterni açısından benzer göründüğünü unutmayın. Buruşuk koloni gelişim paterni not edilmelidir.

Mimari, Panel A'da gösterildiği gibi dışarıdan içeriye doğru gelişebilir veya Panel B'de gösterildiği gibi içten dışa doğru gelişebilir. Biyofilm oluşumunun ikinci bir yarı kantitatif ölçüsü, gelişmekte olan koloninin zaman içinde değişen koloni çapından yararlanır. Üst panelde gösterildiği gibi, temsili bir biyofilm yeterlilik suşu, karmaşıklığı ve çapı artan koloniler oluşur.

Buna karşılık, alt panelde gösterilen başka bir suş biyofilm oluşturmaz. Son olarak, bu şekil zaman içinde koloni çapındaki artışın grafiksel bir temsilini göstermektedir. Aynı iki suşla, biyofilm yeterlilik suşu beyaz dairelerle temsil edilir.

Biyofilm oluşturmayan suş ise siyah karelerle temsil edilir. Bu analiz, biyofilm yetkin kolonilerin boyutunun, biyofilm negatif kolonilerden daha büyük bir oranda arttığını ve son zaman noktasında, ikisinin neredeyse iki kat farklılaştığını ortaya koydu. Bu prosedürü gerçekleştirirken, her bir suşu dikkatlice tespit etmeyi unutmamak ve her suş için başlangıç buruşuk koloni oluşumunu belgelemeyi unutmamak önemlidir.

Bu protokolü takiben, süreçler ve ilgili biyofilm oluşumu hakkında ek soruları yanıtlamak için iCal testi veya kristal genişliğinde boyama gibi diğer yöntemler uygulanabilir.