Intraluminar MCAO Mouse Model: kresil Violet Boyama tarafından Serebral İnfarktı Değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, farelerde iskemik inme modelini taklit etmektir. İlk olarak, ortak karotis arteri geçici olarak bağlanırken, dış karotis arteri mümkün olduğunca distalden kalıcı olarak bağlanır. Bifurkasyonun üzerinde, ECA üzerine hafif sıkı başka bir geçici sütür yerleştirilir.

İkinci adım, kanamayı önlemek için ters etkili pensler kullanılarak internal karotis arterinin klemplenmesidir. Ardından, kalıcı ve geçici ligatürlerin arasındaki ECA kesilir. Sonrasında, silikon kaplı monofilaman ECA'ya yerleştirilir.

Ardından, monofilaman ICA içerisine, orta serebral arterin tabanını kapsayacak şekilde ilerletilmek üzere ECA ters çevrilir. Bir saat sonra, insanlardaki tromboembolik tıkanıklığın lizis sonrası kan akışının yeniden sağlanmasını taklit etmek amacıyla, monofilaman çıkarılarak kan akışı tekrar başlatılır. Nihayetinde, T-M-C-A-O'nun başarısını ve enfarktın şiddetini yansıtan nörolojik defisit, reperfüzyondan hemen sonra ve reperfüzyon sonrası farklı zaman dilimlerinde değerlendirilebilir.

Krestal Viyole ile boyanmış temsili beyin kesitlerindeki infarkt hacmini hesaplamak için NIH'den Cyan görüntüleme yazılımı kullanılır. İntralüminal filament tekniği kullanılarak gerçekleştirilen geçici orta serebral arter oklüzyonunun temel avantajlarından biri, kan akışının yeniden sağlanmasıyla birlikte hastalardaki iskemik inme modelini taklit etmesidir; bu prosedürün farelerde geliştirilmesi, hedef bir proteinin rolünü belirlemek için genetik etiketleme araçlarının kullanılmasına olanak tanır. İnme modelinde, geçici orta serebral arter oklüzyonu, 22 ile 28 gram arasında ağırlığa sahip, iki ila üç aylık erkek C 57 black six farelere uygulanır.

Bu protokol, enfarkt hacmindeki tekrarlanabilirliği artırmak amacıyla IRCM Biyoetik Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Doco Corporation'dan temin edilen, 12 milimetre uzunluğunda, altı sıfır silikon kaplı yeniden kullanılabilir monofilamanlar kullanmaktayız. Cerrahi işlemden iki saat önce.

Bir fareye intraperitonal yolla kilogram başına 0,03 miligram dozunda buprenorfin enjekte edin. İşleme başlamak için fareleri %5 izofluran ile anesteziye alın ve anesteziyi %2,5 izofluran ile sürdürün; cerrahi işlem sırasında fare vücut sıcaklığını sabit tutmak için bir ısıtıcı ped kullanın, farenin derisini %70 etanol veya Betadine ile dezenfekte edin. Ardından, boyun bölgesinde orta hat boyunca bir insizyon yapın ve bir stereo mikroskop altında yumuşak dokuları birbirinden ayırın.

Trakeyi açığa çıkarmak için fare boynunu küt diseksiyonla kesin. Ardından, karotis arterini bulmak için kasları geri çekin. Sol common carotid arteri çevre dokulardan dikkatlice diseke edin.

Arterin çevresine 20 milimetrelik segmentlere ayrılmış geçici bir 5-0 ipek sütür yerleştirin. Vagal sinire zarar vermemeye dikkat edin. Ardından, sol internal karotis arter (ICA) veya internal common carotid artery ve eksternal karotis arter (ECA) veya external common carotid artery bifurkasyonunu ayırın ve ECA'nın mümkün olduğunca distal kısmına kalıcı bir sütür yerleştirin.

Ardından bifurkasyonun üzerindeki ECA'ya başka bir geçici sütür atın. Daha sonra, kanamayı önlemek için ters etkili pensler kullanarak sol ICA'yı klipsleyin. Tekrar belirtmek gerekirse, vagus sinirine zarar vermemeye çok dikkat edin.

ECA'nın, ECA ve ICA'ya ayrıldığı çatallanma noktasından önce ve daha önce yerleştirilen kalıcı ve geçici dikişlerin arasına küçük bir delik açın. Ardından, ECA'ya 12 mm'lik 6-0 silikon kaplı monofilaman dikiş yerleştirin, ECA'yı tamamen kesin ve monifilamanı ICA'ya doğru ters çevirin. Kanamayı önlemek için dikişi sıkıca bağlayın ve ters işlem cımbızını çıkarın.

Ardından, monofilamenti MCA başlangıcı tıkanana kadar Willis halkasına yerleştirin. Yerleştirme işlemi, ECA ve CCA bifurkasyonunun yaklaşık dokuz ila 10 milimetre ötesine kadar yapılmalıdır. Genellikle monofilament engellenecek ve daha fazla ilerleyemeyecektir.

Tego palatina arterini delmemeye dikkat edin. Filamenti konumunda sabitlemek için ECA üzerindeki sütürü sıkıca bağlayın. Şimdi cildi bir otomatik klips yara kapatma sistemi ile kapatın.

Bir mililitre salin solüsyonunu subkütan olarak enjekte edin ve fareleri, 60 dakika süren oklüzyon sonrası dönem boyunca kızılötesi ısıtıcı lamba altına yerleştirin. Fareleri daha önce yaptığınız gibi anesteziye alın, otoklipleri çıkarın ve monofilamanın geri çekilmesine ve kanın yeniden perfüzyonuna izin vermek için ECA üzerindeki sütürü hafifçe açın. Ardından, kan kaybını önlemek için ECA üzerindeki geçici sütürü kalıcı olarak bağlayın.

İnme sonrası bir saat geçince monofilamenti geri çekin ve yeniden kullanım için saklayın. Ardından, kanın yeniden dolaşıma girmesini sağlamak için CCA üzerindeki geçici dikişi kaldırın. Yarayı ve deri altını kapatın.

Farelere bir mililitre daha salin solüsyonu enjekte edin. Hayvanın hareket kabiliyetini yeniden kazandığından emin olduktan sonra, farelerin kendi ortamlarını seçebilmeleri için onu kafesine geri koyun ve kafesin yarısını ısıtma pedinin üzerine yerleştirin. Cerrahi işlemden 12 saat sonra, tüm sham operasyonlarındaki farelere bir doz daha buprenorfine uygulanır.

Monofilamanın ameliyat sonrası yerleştirilmemesi dışında tüm prosedürler aynıdır. T-M-C-A-O başarısını teyit etmek ve verimlilik skorunu belirlemek için nörolojik defisit değerlendirilir; farelerin nörolojik defisitleri perfüzyon sonrası 1, 24, 48 ve 72. saatlerde aşağıdaki altı puanlık ölçeğe göre belirlenir: sıfır normali, bir ise kuyruktan kaldırıldığında tutarsız kıvrılma ile veya kıvrılma olmadan hafif dönmeyi ifade eder. %50'den fazlası kontralateral tarafa kıvrılmaya çalışır.

İki, girişimlerin %50'den fazlasında karşı tarafa doğru kıvrılma eğilimiyle beraber hafif ve tutarlı kıvrılmayı ifade eder. Üç, tutarlı, güçlü ve ani kıvrılmayı ifade eder. Fare, bir ila iki saniyeden daha uzun süre kıvrılmış pozisyonda kalır.

Burnu neredeyse kuyruğuna değecek kadar kıvrılmış. Dört puan, şiddetli kıvrılmayı ifade eder. Yürüme veya yazma refleksinin kaybıyla birlikte gelişen "barreling" (fıçı şeklinde dönme) durumunda beş puan, komatöz veya tamamen kıvrılmış (mound) durum anlamına gelir.

PBS solüsyonu ile perfüzyondan sonra, beyinleri hızlıca izopentanda dondurun ve eksi 80 derece Celsius'ta saklayın. Planlanan immünohistokimya çalışmalarına bağlı olarak, fare beyinlerinin %4 paraformaldehit ile perfüze edilebileceğini unutmayın. Ardından, bir kriyostat kullanarak 30 lam üzerinde 17 mikron kalınlığında koronal beyin kesitleri alın.

Her 30 kesitten birini aynı slayta yerleştirin. Ardından, birinci ve on beşinci slaytları kristal viyole ile boyayın. Daha doğru bir hasar hacmi tahmini için, sol ve sağ beyin hemisferlerinde beyaz görünen infarkt alanını, yani lezyon derinliğini değerlendirmek amacıyla NIH'den Scion image gibi bir görüntü analiz sistemi kullanın.

Bu D sınırlamasını tüm beyin kesitlerinde tekrarlayın. İnfarkt hacmini keyfi birimler cinsinden hesaplayın ve her kesit için bunları karşı tarafındaki lezyonsuz alanın yüzdesi olarak ifade edin. Diğer lamları immünohistokimya çalışmaları için -80 °C'de saklayın.

Nöro skor değerlendirmesi, intralüminal prosedüre tabi tutulan deneklerimde T-M-C-A-O işleminin başarısını doğrulamaktadır. Burada görüldüğü üzere, tutarlı, güçlü ve orta düzeyde kıvrılma gözlemlenmekte ve fare, burnu neredeyse kuyruğuna değecek şekilde bir ile iki saniyeden fazla süre boyunca kıvrılmış pozisyonunu korumaktadır. Deneyimizde, tüm fareler test süresi boyunca nöro skoru ikiye karşılık gelen, en az hafif düzeyde tutarlı bir kıvrılma sergilemiştir.

Beyin enfarktının boyutunu değerlendirmek amacıyla Kressel violet boyaması yapılmıştır. Burada gösterilen T-M-C-A-O işlemini takiben, reperfüzyondan 72 saat sonra Kressel violet ile boyanmış fare beyninin temsili koronal kesitleri sunulmuştur. Etiketlenen enfarkt alanı (esas olarak striatum, korteks ve bitişik beyin bölgeleri), Kressel ile boyanmadığı için beyaz olarak görünmektedir.

Burada mor renkle gösterilen kısım, sağ hemisferdeki beyaz alanın, sol hemisferdeki karşı tarafın lezyonsuz alanına yüzde olarak oranıyla ifade edilen hasar hacmidir. İskemik inme sonrası C 57 black six erkek farelerdeki enfarkt hacmi, lezyonsuz hemisferin yaklaşık %70'ini temsil eder. Bu prosedür, güçlü bir lezyon tekrarlanabilirliği sağlar.

Bu videoyu izledikten sonra, farelerde geçici iskemik inme nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Ayrıca, beyin infarkt hacminizi ölçmek için kullanılan quiz viol yaklaşımı, ilgili belirteçleri immünokimya ile test etmek için birçok materyale sahip olma avantajını sunar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.