İnsan Pankreas için Toplama Protokolü

Bu prosedürün genel amacı, insan pankreasını anatomik yönelimi koruyacak şekilde incelemektir. Bu, duodenum ve dalağın pankreastan çıkarılması ve ardından pankreastan fazla yağ ve damarların temizlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, ön yüzeyi mavi mürekkeple ve arka yüzeyi siyah mürekkeple boyamaktır.

Daha sonra, pankreas üç bölgeye ayrılır. Her bölge daha sonra çapraz olarak eşit plakalar halinde dilimlenir ve parafin kasetlerine, OCT kalıplarına yerleştirilir veya daha fazla kıyılır ve şişelere yerleştirilir. Sonuç olarak, pankreasın her üç bölgesinden de örnekler toplanırken, gelecekteki analizler için doğru anatomik oryantasyon korunur.

Bu yöntem, tip bir diyabet araştırmasında, beta hücre kütlesi veya fonksiyon kaybının altında yatan mekanizmalar ve bağışıklık hücresi saldırısının doğası gibi temel soruların ele alınmasına yardımcı olabilir. Pankreasın in vivo oryantasyonunu korumak ayrıntılara dikkat gerektirdiğinden, pankreas işleme yönteminin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Prosedürü gösteren, tarihi teknoloji uzmanı Linda Snyder ve laboratuvarımdaki biyolojik bilimci Emily Montgomery olacak.

Prosedür için gerekli tüm malzemeleri hazırlayarak başlayın. İlk olarak, parafin bloklarını tutacak kasetleri bir donör tanımlayıcısı, numune tipi, alikot numarası ve herhangi bir ek bilgi ile etiketleyin. Ardından, OCT kalıplarını aynı şekilde etiketleyin.

Her bir OCT bloğunu sarmak için yeterli miktarda alüminyum folyo kesin ve daha sonra kullanmak üzere bir kenara koyun. Taze ve dondurulmuş numuneleri saklamak için gereken tüm şişeleri hazırlayın. Daha sonra RNA ve uygun olduğunda RPMI ortamını ekleyin.

Ardından, çalışma alanlarını hazırlayın, diseksiyon tahtalarını, sterilize edilmiş aletleri ve prosedür için gerekli diğer tüm malzemeleri hem biyogüvenlik başlığına hem de tezgah üzerine yerleştirin. Tüm kasetleri ve OCT kalıplarını kullanım sırasına göre düzenletin. Yakın. Bir strafor kutusunun dibindeki kuru buzu kaplayacak kadar isop pentan ekleyerek bir dondurma banyosu oluşturun.

Diseksiyona başlamak için duodenum ve dalağı çıkarın. Duodenum ve pankreası bir uçta ayırmaya başlayın ve tamamen ayrılana kadar devam edin. Dalak gevşek bir şekilde tutturulur ve yağ ve pankreastan kolayca çıkarılır.

Daha sonra, künt ve keskin diseksiyonun bir kombinasyonunu kullanarak yabancı yağ damarlarının ve sinirlerin pankreasını temizleyin. Daha sonra işlenmek üzere yağ ve lenf düğümlerini bir kenara koyun. Temizlendikten sonra pankreası kağıt havluyla kaplı bir diseksiyon tahtasına yerleştirin.

Pankreasın doğru oryantasyonunu korumak, bu prosedürün en zor yönüdür. Başarıyı sağlamak için ön ve arka yüzeyler farklı renkli mürekkeplerle boyanır. Pamuk uçlu bir aplikatörü mavi mürekkebe batırın, mürekkebi pankreasın ön yüzeyine yayın ve fazlalığı kurulayın.

Ardından, yeni bir aplikatörü siyah mürekkebe batırın ve pankreasın arka yüzeyine yayın. Pankreası normal yönüne döndürün. Ön yüzey yukarı bakacak şekilde pankreas artık üç bölüme ayrılmaya hazırdır.

İlk olarak, baş ve vücut arasındaki bağlantıyı kesin. Daha sonra, gövdeyi ve kuyruğu ayırmak için kalan kısmı yaklaşık olarak eşit parçalara bölün, pankreasın her bir bölgesinin ağırlığını kaydedin. Baş kısmından başlayarak.

Bir somun ekmek kesmeye benzer şekilde enine keserek her bölgeyi yaklaşık 0,5 santimetrelik bölümlere ayırın. Pankreasın her bir bölgesi dilimlendikten sonra, baş gövdesi birleşme bölümü olan baş bölgesinin son bölümünü çıkarın ve ayrı bir diseksiyon tahtasına yerleştirin. Bu bölümü küçük parçalara ayırın ve parçaları RNA'lı ve RNA'sız etiketli kriyo şişeleri arasında eşit olarak bölün.

Daha sonra şişeler dondurulur. Standart prosedürleri takip etmek. Gövde kuyruğu bağlantı bölümü için bu prosedürü tekrarlayın.

Kıyılmış numuneler toplandıktan sonra, tüm enine bölümleri sağa doğru eğin. Her bölgenin alternatif bölümleri kaldırılacaktır. Parafin ve OCT blokları için, parafin blokajı için ilk bölümü çıkarın.

Bir bölüm çok büyükse, ikiye bölün. Parça hala çok büyükse, her bölümü bir önceki kesime dik olarak kesin ve ardından A'dan D'ye kadar olan kasetleri saat yönünde etiketleyin. Burada görüldüğü gibi, kaseti etiket sola gelecek şekilde konumlandırın.

Ardından, dokuyu kasete yerleştirin ve kapağı kapatın. Kaseti nötr tamponlu formin içeren bir kaba aktarın. OCT blokları için en medial bölümden başlayarak bloğu her bölge içinde sırayla numaralandırın.

Önceden etiketlenmiş bir kalıba ince bir OCT ortamı tabakası dökün: Dokuyu eklemeden önce, dokuyu OCT ortamı ile örtün ve numuneyi daha sonra kullanmak üzere hızla dondurun ve daha önce bir kenara bırakılan dokuya geri dönün. Düğüm kapsülünü çevreleyen yağ ve bağ dokusunu keserek pankreas lenf düğümlerini izole edin. Düğümleri DMEF içeren steril bir tabağa yerleştirin, büyük düğümleri 0,5 santimetreden büyük olmayan parçalar halinde kıyın.

Pankreas lenf düğümleri izole edildikten sonra, daha sonraki işlemler için dokuyu hazırlanan şişeler ve kasetler arasında bölün. Lenf bezleri bittikten sonra dalak kıyılır ve benzer şekilde saklanır. Duodenumu işlemek için, mukozayı mukustan temizlemek için nemli bir gazlı bez kullanın, mukozayı kesin ve ardından bölümlere ayırın.

Mukoza örneklerini daha önce gösterildiği gibi bölün. Bu prosedür kullanılarak, pankreasın her bölgesinin temsili örnekleri burada görüldüğü gibi toplanır. Baş, gövde ve kuyruk bölgesinin ağırlıkları yaklaşık olarak eşitti.

Bu videoyu izledikten sonra, bir insan pankreasının farklı numune türlerine nasıl işleneceğini, özellikle oryantasyonu koruma becerisini ve lenf düğümlerini peripankreatik yağdan nasıl izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.