Name: İnsan Pankreas için Toplama Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Öğrenin insan pankreasının anatomik yönelimini koruyarak diseksiyon yöntemini. Bağırsak ve dalak çıkarılması, mürekkep işaretleme ve bölgesel örnek toplama teknikleriyle diyabet araştırmaları için islet kompozisyonu analizi sağlanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, donörlerin aileleri ve uzman yardımı için bu araştırma ve Maria Martino ve Irina Kusmartseva yer Organ İhale Organizasyonlar teşekkür ederim. Bu çalışma Diyabet ile Pankreas Organ Bağış için Ağ destek Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı (MC-T., MA) tarafından finanse edildi.

1. Set-up <ol><li> Bir kalemle veya otomatik bir kaset yazıcı ile el parafin blokları için etiket kasetleri. Donör tanımlayıcı (CaseID), numune tipi, tablet sayısı ve herhangi bir ek benzersiz bir kimlik (Olgu çalışma, Include <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">Ek 1</a> ). </li><li> Kalıcı bir kalem ile kaset olarak Etiket Ekim kalıplar. Alüminyum folyo 5-10 cm dikdörtgenler kesin. </li><li> Kalıcı bir kalem bütün şişeler ve tüpler ile etiket yazdırmak veya manuel. Taze gönderiler için RPMI medya ile kıyılmış ek donmuş numuneler ve tüpler için yeterli şişeleri ekleyin. RNAlater ile ek dondurulmuş şişeleri için, her cryovial 1 ml RNAlater ekleyin. </li><li> Sterilize diseksiyon aletleri (forseps, neşter, bıçaklar, gazlı bez (4x4)) yanı sıra kaset ve OCT kalıpları ile biyogüvenlik kaput ve tezgahlar Set-up diseksiyon panoları kullanım sırasına göre düzenlenmiş. </li><li> Koyarak dondurucu bir banyo hazırlayınKuru en az 3 cm derinliğe kadar orta büyüklükte bir strafor kutu (10x10 cm) buz ve kuru buz tamamen kaplıdır kadar izopentan ekleyin. </li><li> İsteğe Bağlı: sıvı nitrojen ile küçük bir Dewar doldurun. </li><li> Pankreas elektron mikroskobu (EM) için gerekli ise, 1.25 mL% 16 paraformaldehit, 1.25 mL% 8 glutaraldehit ve 7.5 mL 0.1M PBS ekleyerek TAAB fiksatif hazırlamak. 7.5 mL 0.1M PBS 2.5 mL% 16 paraformaldehit ekleyerek Lowicryl fiksatif hazırlayın. </li><li> Hücreler izole etmek için kullanılan çözümler hazırlayın. Aşağıdaki eklerken DMEF 500 ml şişe (glutamin ile), aseptik teknikler aşağıda: <ol><li> Fetal sığır serumu (FBS): add 50mL, son 10%. </li><li> Penisilin / Streptomisin (Kalem / Strep, 10.000 U / mL / 10,000 ug / mL stok) - 100 U / mL / 100ug/mL son konsantrasyon için RPMI 5 ml Kalem / Strep stok ekleyin. Ayrıca, lenf düğümleri ve dalak örnekleri tutmak için kullanılan DPBS bir 500 ml&#39;lik şişe için 5 ml ilave edilir. </li></ol></li></ol> 2. Personel <ol&gt; <li> Prosedür optimum üç personeli ise işlem bir iyi eğitilmiş birey ile yapılabilir gerçekleştirilir. İki bireyler genellikle 90 dakika içinde işleminizi yapabilirsiniz. Gerçek süresi alınan dokuların numaraları bağlıdır ve pankreatik lenf düğümleri bulma kolaylığı. Hücre izolasyonları için Örnekler 4 yapılmaktadır ° C ye kadar doku diseksiyonu tamamlanması serum örneklerinde paralel olarak işlenirken. </li><li> Patolog, patoloji asistanı veya eşdeğeri-deneyimli personel doku işleme açar ve pankreas başı bölünmesi (ler) de dahil olmak üzere ve pankreatik lenf düğümleri hasat büyük disseksiyonlar gerçekleştirir. İlk çabaları lenf düğümleri için peri-pankreatik yağ muayenesini takiben pankreas yöneliktir. </li><li> Laboratuvar teknisyeni veya eşdeğeri-personel, temel sorumlulukları sabit ve donmuş blokları ve ek dondurulmuş v için pankreas ve bölgeler ve trim dokular tartmak olan kırpma doku eğitimIALS. Patoloji asistanı ile duodenum ve dalak alır ve patoloji asistanı pankreas işlerken bu organların işler. </li><li> Blok ve şişe etiketleme, cryovials için kıyma örneği ve serum işleme dahil olmak üzere diğer yardımcı laboratuvar asistanı-personel. </li></ol> 3. Pankreas Diseksiyon <ol><li> Duodenum ve dalak çıkarın ve künt ve keskin diseksiyon kullanılarak gereksiz yağ, damar ve sinirlerin pankreas temizlemek </li><li> Kağıt havlu ile örtülü bir diseksiyon gemide temizlenmiş pankreas yerleştirin. Pankreasın ön yüzünde mavi mürekkep ve yayılmasında bir pamuk uçlu aplikatör batırın. Fazla gelen lekeyi silin. </li><li> İsteğe Bağlı: Pankreasın arka yüzeyinde siyah mürekkep ve yayılmasında yeni bir aplikatör batırın. Ön yüzey prosector bakan normal yönlendirmeye pankreas dönün. </li><li> Baş, gövde ve kuyruk (Şekil 1): 3 bölgeye pankreas kesin. Hea arasındaki bağlantı kesind ve sonra vücut, vücut ve kuyruk için ~ eşit kısma kalan kısmını bölün. </li><li> Pankreas ve kayıt ağırlıkları (Olgu workup sayfası (her bölge tartılır <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">Ek-1</a> )). </li><li> Bölüm (~ 0.5 cm) enine bir &quot;Ekmek&quot; bir şekilde (Şekil 1) pankreas her bölge. </li><li> Kıyma örnekleri için bölgeler arasında kavşak gelen bölümleri kullanın. Pankreas boyutuna bağlı olarak, vücudun-kuyruk bileşke bölgesinden bir numune parafin blok sayısı elde edilebilir pankreas kafası-vücut bölgesinden kıyılmış numune ya da yalnızca örnek elde etmek için düşük olabilir ve bu durumda elde etmek zor olabilir. Baş veya kavşakta proksimal bölge belirtmek için vücut olarak göre Etiket cryovials. <ol><li> Adet kıyma ve cryovials (flakon başına ≥ 1 gram) arasında eşit olarak bölün. Hızla sıvı azot veya kuru buz RNALater olmadan şişeleri dondurmak - izopentan bulamaç ardından t aktarmakoa -80 ° C derin dondurucuda. </li><li> Dengelenmesi için izin vermek için 30 dakika için oda sıcaklığında RNALater ile şişe tutmak, hızla remix ve daha sonra bir derin dondurucu -80 ° C transfer sıvı azot içinde ya da kuru buz-izopentan bulamaç içinde donma. </li></ol></li><li> Parafin ve parafin (Şekil 1) ile başlayan Ekim blokları için alternatif bölümleri kaldırın. </li><li> Sağa doğru enine bölüm eğimlidir. </li><li> Yeri ~ 1.5 x 1.5 kasetlere x 0.5 cm bölümleri. Enine kesitler çok büyükse, yarım (Şekil 2b) kesti. &quot;B&quot; &quot;A&quot; ve posterior yarısı gibi mavi anterior yarısı için etiket kasetleri. </li><li> Parçaları hala çok büyükse, önceki kesme (Şekil 2c) için her bölüm dik olarak kesilmiş. Saat yönünde bir şekilde etiket kasetleri AD. Daha kaseti sığdırmak için gerekli parçaları kesin. </li><li> En medyal bölümü ile başlayarak bölge içinde sırayla numarası bloklar,. </li><li> Parafin bloklar, pozisyon cböylece etiketli assettes yönünü koruyarak, kaset içine sol ve yerinde doku etmektir. Kapat kaset kapağı ve ~ 500 ml% 10&#39;luk nötral bir konteyner aktarma (NBF) tamponlu formalin. Son kaset sabitleştirici yerleştirilir zamanlama fiksasyon başlayın. </li><li> Ekim blokları için prelabeled kalıp içine Ekim medyanın ince bir tabaka dökün yönlendirme sonra korumak ve OCT ile doku karşılandığından emin olmak kalıp doku yatıyordu. ~ 1 dakika izopentan bulamaç - Hızla bir kuru buz kalıpları Ekim batırmayın. Geçici depolama için kuru buz veya -80 olarak çamur ve yerden kaldırma, uzun süreli depolama için ° C derin dondurucuda. </li><li> Elektron mikroskobu (EM) için baş-beden ayrımından ~ 0.5 x 0.5 cm dilimleri alın. TAAB sabitleştirici ve Lowicryl sabitleştirici diğer dilim koyun bir dilim. En az 48 saat ve / veya belirsiz bir süre için EM işlenmek. Için 4 ° C&#39;de numunelerin ile sabitleştirici Her iki tip depolamak </li></ol> 4. Dalak, lenf nodu diseksiyonuASIZ ve Duodenum Mukoza Diseksiyonlarında <ol><li> Yağdan pankreatik lenf düğümleri (PLN) yalıtmak ve düğüm kapsül tüm bağ dokusu kırpın. DMEF içeren steril hücre kültür kaplarına koyun. Izole edilen toplam sayı bağlı olarak, taze gönderiler, soğukta saklanan hücre izolasyonları, parafin ve / veya Ekim blokları ve flakon için kısma PLN bölün. 0.5 cm&#39;den daha büyük parçalar halinde büyük düğümleri kıyma. </li><li> Küçük (~ 0.5 cm) küpler halinde olmayan pankreatik lenf bezleri ve dalak kıyma. Başlangıç ​​maddelerinin miktarlarına göre taze örnek gönderiler veya dondurulmuş hücre izolasyonları için fiksatörü, Ekim medya ve ya DMEM yerleştirin. </li><li> Duodenum açın ve hafifçe ıslatılmış gazlı bezle mukus duodenal mukoza silin. Ve RNAlater olmadan, parafin ve / veya flakon için dondurulmuş Ekim blokları ve kıyma örnekleri için mukozasının bölümleri kesin. Diğer örnekleri gibi dondurun. </li></ol> 5.. Önceden etiketli alüminyum folyo ve yeri Ekim blokları ve içine al Ekim bloklar<html> -80 uzun süreli saklama için kutuları şişeleri ° C 6. Parafin İşleme Sabit Örnekleri gönderin <ol><li> Otomatik bir parafin işlemci kullanarak ya da manuel zamanlama kullanarak 16 saat boyunca dokular (aralığı 20 ± 4 saat) sabitleyin. Otomatik bir işlemci (parafin bloklara işlemek <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix2.doc" target="_blank">Ek 2</a> ). </li><li> Sol kaset etiketi ile prosector tarafından yerleştirilmiş olarak kesin yönde bölümleri Embed. Submukozaya mukoza dik muayene izin kesim yüzeyi ile duodenal mukoza aşağı Embed. </li></ol> 7. Diseksiyon alanları temizleyin ve dezenfekte edin. Diseksiyon aletleri yıkayın ve tekrar sterilize. Biyomedikal atık depolama için formalin fiksatif içinde kalan insan dokularında yerleştirin. Bir ay içinde yerel yönetmeliklere göre biyomedikal atık atın. 8. Örnek Envanter Sistemi Güncelleme ve_title &quot;&gt; 9. Temsilcisi Sonuçlar Bu işlem üç büyük yani bölgeler, baş, gövde ve 2 saat içinde kuyruk çizimi de dahil olmak organın her temsili örnekleme bozulmamış bir insan pankreas işleyecek. Posterior kafa bölgesinde bulunan unsinat bölgesi, kafa Diseksiyon dahildir. Diyabeti olmayan organ bağışında bulunan ortalama pankreas ağırlığı 82.4 gram (- 139.0 gram 52.7) idi. Pankreas bölgesel incelme (Şekil 3) yaklaşık eşit düzeydeydi. Bu işlem aynı zamanda sıralı parafin ve OCT bloklardan lekeli slaytlar kullanarak tüm pankreas rekonstrüksiyonu için izin verebilirsiniz. Çoklu biçimleri mevcut ve gelecek teknolojiler için maksimum kullanımı için izin mümkün bulunmaktadır. Mevcut nPOD durumda çalışma (sağlanmaktadır <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">Ek 1</a> kurtarıldı örnekleri ve sonraki proc belgelemek için kullanılan)tablet türleri ve miktarları ile Essing. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig1.jpg" /> Şekil 1.. Anatomik yönelimleri korurken prosedür genel şeması. Tamamı pankreas işlenir. Kafa bölgesinde unsinat bölgesi içerir arka bölgede ventral pankreas lobun varlığı nedeniyle, üstün-inferior eksen daha uzundur. Kavşaklarda çizili alana cryovials içinde kıyılmış numuneler için kullanılan bölgeleri ifade eder. P, Parafin, O, Ekim <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig2.jpg" /> Şekil 2. Pankreas bölümler için Yazı düzeni. Enine pankreas dilim fazla iki ya da dört ayrılır ve saat yönünde bir şekilde harfli edilebilir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig3.jpg" /> Şekil 3. Diyabeti olmayan organ bağışında gelen Pankreas ağırlıkları.yetişkin bağışçılar (&gt; 17 yaş) intakt pankreas edilen bölgeler ve bölgesel incelme ayrılmıştır sonra tartıldı. Veriler ortalama ± SEM (N = 15).

<ol><li>Brissova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> J. Histochem. Cytochem. 53, 1087-1097 (2005).</li>
<li>Rahier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pancreatic+polypeptide+cells+in+the+human+pancreas%3A+the+effects+of+age+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">The pancreatic polypeptide cells in the human pancreas: the effects of age and diabetes.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 441-444 (1983).</li>
<li>Uchida, T., Takada, T., Ammori, B. J., Suda, K., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+the+ventral+and+dorsal+pancreas%3A+a+new+insight+into+anatomy+and+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatobiliary+Pancreat.+Surg%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of the ventral and dorsal pancreas: a new insight into anatomy and embryonic development.</a> J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 176-180 (1999).</li>
<li>Wittingen, J., Frey, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+concentration+in+the+head%2C+body%2C+tail+and+uncinate+process+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Islet concentration in the head, body, tail and uncinate process of the pancreas.</a> Ann. Surg. 179, 412-414 (1974).</li>
<li>Rahier, J., Goebbels, R., Henquin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+of+the+human+diabetic+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Cellular composition of the human diabetic pancreas.</a> Diabetologia. 24, 366-371 (1983).</li>
<li>Vaught, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+NCI+perspective+on+creating+sustainable+biospecimen+resources%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst.+Monogr%22%5BJournal%5D)">An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources.</a> J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 42, 1-7 (2011).</li>
<li>Gianani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+results+of+screening+of+nondiabetic+organ+donors+for+expression+of+islet+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Initial results of screening of nondiabetic organ donors for expression of islet autoantibodies.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 91, 1855-1861 (2006).</li>
<li>Tauriainen, S., Salmela, K., Rantala, I., Knip, M., Hyöty, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collecting+high-quality+pancreatic+tissue+for+experimental+study+from+organ+donors+with+signs+of+%CE%B2-cell+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab.+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Collecting high-quality pancreatic tissue for experimental study from organ donors with signs of β-cell autoimmunity.</a> Diabetes Metab. Res. Rev. 26, 585-592 (2010).</li>
<li>In't Veld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+insulitis+in+adult+autoantibody-positive+organ+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Screening for insulitis in adult autoantibody-positive organ donors.</a> Diabetes. 56, 2400-2404 (2007).</li>
<li>Töns, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+pancreata+in+perspective+of+the+isolation+of+the+islets+of+langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human pancreata in perspective of the isolation of the islets of langerhans.</a> Transplant Proc. 40, 367-369 (2008).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu prosedürün amacı birden toplama siteler arasında uyumlu olabilir standart bir pankreas işleme tanımlamak ve böylece farklı gruplar tarafından elde edilen sonuçları karşılaştırabilme sağlamaktır. Diseksiyon yöntemi bölge-içi alt bölümleri tarafından takip başlıca pankreas bölgelerin açıklama için ek adımlar ile standart cerrahi patoloji uygulamalarına dayanmaktadır. Biospecimen işleme yöntemlerinin standartlaştırılması, Ulusal Kanser Enstitüsü 6 ulusal biobanking kuruluşlardan biospecimen koleksiyon için en...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 22 bıçak neşter dahil Diseksiyon araçları </td><td> Çeşitli </td><td> Çeşitli </td><td></td></tr><tr><td> Santrifüj tüpler (15 ve 50 ml) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-539-5, 430.828 </td><td> Steril </td></tr><tr><td> Cryotubes (1.8 ml) </td><td> VWR North America </td><td> 89004-300 </td><td> Steril, bar kodları isteğe </td></tr><tr><td> RNAlater </td><td> Ambion </td><td> AM7021 </td><td></td></tr><tr><td> Cerrahi Patoloji Mürekkep </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kasetler </td><td> Mercedes Tıp </td><td> CAS ECO109 </td><td></td></tr><tr><td> 1Nötr 0% Formalin Tamponlu </td><td> Fisher Scientific </td><td> 23-245-685 </td><td></td></tr><tr><td> Ekim Donma Medya </td><td> TissueTek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Kalıplar </td><td> ThermoScientific </td><td> 58952 </td><td> Çeşitli boyutlarda </td></tr><tr><td> Izopentan </td><td> Fisher Scientific </td><td> O3551-4 </td><td> Ekim ürpertici banyo </td></tr><tr><td> Donmuş karbondioksit </td><td></td><td></td><td> Ekim ürpertici banyo </td></tr><tr><td> Dewar şişede sıvı azot </td><td></td><td></td><td> Dondurma cryovials çekin </td></tr><tr><td> Hücre kültürü çanak (100mm) </td><td> Corning </td><td> 430167 </td><td> Steril </td></tr><tr><td> Hyclone DMEF </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30023.01 </td><td> Steril, mağaza buzdolabında, glutamin dahil </td></tr><tr> &lt;td&gt; Fetal Bovine Serum </td><td> Cellgro </td><td> 35-010-CV </td><td> Steril, mağaza dondurulmuş alikotları </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin / Antifungal </td><td> GIBCO </td><td> 15240-062 </td><td> Steril, mağaza dondurulmuş alikotları </td></tr><tr><td> 9 Parafin yazın </td><td> Richard-Allan Bilimsel </td><td> 8337 </td><td></td></tr><tr><td> 1X D-PBS </td><td> GIBCO </td><td> 14190-144 </td><td> Steril </td></tr><tr><td> % 16 Paraformaldehyde </td><td> EM Bilimleri </td><td> 15710 </td><td> Taze, mağaza buzdolabında olun </td></tr><tr><td> % 8 Glutaraldehyde </td><td> EM Bilimleri </td><td> 16019 </td><td> Taze, mağaza buzdolabında olun </td></tr><tr><td> Biyolojik Güvenlik Seviye 2 başlık </td><td> Çeşitli </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ultra-düşük dondurucu </td><td> Çeşitli </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sakura Kaset Yazıcı </td><td> Sakura </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sakura VIP300 </td><td> Sakura </td><td></td><td> Otomatik parafin işlemci </td></tr><tr><td> Parafin gömülmesi İstasyonu </td><td> ThermoFisher </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Özel reaktifleri ve ekipmanları.

İnsan pankreas için toplama protokolü

Collection Protocol for Human Pancreas

Bu diseksiyon ve örnekleme prosedürü kadavradan organ bağışında kurtarıldı pankreas hazırlanması standardize etmek Diyabet (nPOD) programı ile Pankreas Organ Bağış için Ağ için geliştirilmiştir. Pankreas yanal eksene medial boyunca seri enine kesitler ardından 3 ana bölgede (baş, gövde, kuyruk) ayrılmıştır. Alternatif bölümleri sabit parafin ve taze dondurulmuş blokları ve kalıntı numuneler için kullanılan DNA, RNA ve protein izolasyon için olan ya da olmayan RNAse inhibitörleri ya ek dondurulmuş Örnek preparatlar için kıyılmış edilir. Pankreas Diseksiyon işlemin genel amacı anatomik yönelimi korurken tamamını pankreas örneklemek etmektir. Adacık bileşimi, büyüklüğü ve sayısı açısından Endokrin hücre heterojenitesini kemirgen adacıklar 1&#39;e göre, insan adacıkları bildirilmektedir. Pankreas başı insan adacık çoğunluğu, vücut ve kuyruk bölgelerinde insülin containin oluşurg β-hücrelerinin düşük oranlarda takiben glukagon içeren α-hücreleri ve δ-hücreleri somatostatin-içeren. Pankreatik polipeptid içeren PP hücreleri ve ghrelin içeren epsilon hücreleri de mevcut fakat az sayıda bulunmaktadır. Bunun aksine, unsinat bölgesi esas pankreatik polipeptid içeren bir PP hücreleri 2 oluşan adacıklar içerir. Bu bölgesel farklılıklar adacık gelişimsel farklılıkları ortaya çıkar. Pankreas foregut ve mide ve onikiparmak bağırsağı, dorsal 3 ile ventral lobun hamle sigortalar ve dönüşten sonra ventral ve dorsal pankreas tomurcukları gelişir. Ventral lob dorsal lob organ kalanı yol açmaktadır ederken unsinat işlemi de dahil olmak üzere başının arka kısmını teşkil eder. Bölgesel farklar da pankreas kuyruk bölgesi, tip 1 diyabette selektif atrofi geçiren diğer bölge ve dorsal lob kaynaklı bileşenlerine kıyasla daha yüksek adacık yoğunluğuna sahip olan bildirilmektedir <skadar&gt; 4,5. Ek organ ve dokular genellikle organ bağışında kurtarıldı ve pankreatik lenf bezleri, dalak ve non-pankreatik lenf düğümleri içerir. Bu numuneler Kriyoprezerve hücrelerinin izolasyon ilavesi ile pankreas için de benzer biçimleri ile geri kazanılmaktadır. Proksimal duodenum, pankreas dahil edildiğinde, duodenal mukoza parafin ve dondurulmuş bloklar ve kıyılmış ek donmuş hazırlıkları için toplanmış olabilir.

Bu video çoklu depolama biçimleri içine insan pankreas işlemek için bir diseksiyon yordam gösterir. Anatomik oryantasyon bölgesel adacık bileşimi ve yoğunluğu tanımı izin pankreas bölgeleri boyunca korunur.

İnsan Pankreas için Toplama Protokolü

Bu diseksiyon ve örnekleme prosedürü, hazırlıkları standartlaştırmak amacıyla Diyabetli Pankreas Organ Donörleri Ağı (nPOD) programı için geliştirilmiştir...

Bu prosedürün genel amacı, insan pankreasını anatomik oryantasyonu koruyacak şekilde diseke etmektir. Bu işlem, duodenum ve dalağın pankreastan çıkarılması, ardından pankreastaki fazla yağ ve damarların temizlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise anterior yüzeyin mavi mürekkeple, posterior yüzeyin ise siyah mürekkeple boyanmasıdır.Ardından, pankreas üç bölgeye ayrılır. Her bölge daha sonra enine eşit dilimler halinde kesilerek parafin kasetlerine, OCT kalıplarına yerleştirilir veya daha küçük parçalara ayrılıp viallere konur. Sonuç olarak, gelecekteki analizler için doğru anatomik yönelim korunarak pankreasın her üç bölgesinden örnekler toplanır.Bu yöntem, beta hücre kütlesinin veya fonksiyonunun kaybının altında yatan mekanizmalar ya da immün hücre saldırısının doğası gibi tip 1 diyabet araştırmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Pankreasın in vivo oryantasyonunun korunması ayrıntılara dikkat gerektirdiği için, pankreas işleme yönteminin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır. Prosedürü, laboratuvarımdaki histoteknoloji uzmanı Linda Snyder ve biyolog Emily Montgomery gerçekleştirecektir.İşleme başlamadan önce gerekli tüm malzemeleri hazırlayın. İlk olarak, parafin blokları tutacak kasetleri donör kimliği, örnek tipi, alikvot numarası ve diğer ek bilgilerle etiketleyin. Ardından, OCT kalıplarını da aynı şekilde etiketleyin.Her bir OCT bloğunu sarmaya yetecek kadar alüminyum folyo parçası kesin ve daha sonra kullanmak üzere kenara ayırın. Taze ve dondurulmuş örnekleri saklamak için gereken tüm tüpleri hazırlayın. Uygun olduğunda RNA later ve RPMI besiyeri ekleyin.Ardından çalışma alanlarını hazırlayın; diseksiyon tahtalarını, sterilize edilmiş aletleri ve prosedür için gerekli olan diğer tüm malzemeleri hem bir biyogüvenlik kabinine hem de bir tezgah üzerine yerleştirin. Tüm kasetleri ve OCT kalıplarını kullanım sırasına göre yakın bir yere düzenleyin. Bir strafor kutunun tabanındaki kuru buzu örtecek kadar izopentan ekleyerek bir dondurma banyosu oluşturun.Diseksiyona başlamak için duodenumu ve dalağı çıkarın. Bir uçtan duodenum ve pankreası ayırmaya başlayın ve tamamen ayrılana kadar devam edin. Dalak gevşek bir şekilde bağlıdır ve yağ ile pankreastan kolayca çıkarılabilir.Ardından, pankreasi küt ve keskin diseksiyon kombinasyonunu kullanarak yabancı yağ, damar ve sinirlerden temizleyin. Daha sonra işlenecek olan yağ ve lenf nodlarını kenara ayırın. Temizleme işlemi tamamlandıktan sonra, pankreasi kağıt havluyla kaplanmış bir diseksiyon tahtasına yerleştirin.Pankreasın doğru oryantasyonunun korunması, bu prosedürün en zor yönüdür. Başarıyı sağlamak için, ön ve arka yüzeyler farklı renklerdeki mürekkeplerle boyanır. Pamuk uçlu bir aplikatörü mavi mürekkebe batırın, mürekkebi pankreasın ön yüzeyine yayın ve fazlalığı tamponlayarak temizleyin.Ardından, yeni bir aplikatörü siyah mürekkebe batırın ve pankreasın posterior yüzeyine sürün. Pankreası normal yönelimine geri getirin. Anterior yüzey yukarı bakacak şekilde, pankreas artık üç bölüme kesilmeye hazırdır.Öncelikle, baş ile gövde arasındaki bağlantıyı kesin. Ardından, gövde ve kuyruğu ayırmak için geri kalan kısmı yaklaşık olarak eşit parçalara bölün ve pankreasın her bir bölgesinin ağırlığını kaydedin. Baş bölümüyle başlayın.Her bir bölgeyi, bir ekmek dilimler gibi enine keserek yaklaşık 0,5 santimetrelik bölümlere ayırın. Pankreasın her bölgesi dilimlendikten sonra, baş bölgesinin son kısmı olan baş-gövde bileşke bölümünü çıkarın ve ayrı bir diseksiyon tahtasına yerleştirin. Bu bölümü küçük parçalar halinde doğrayın ve parçaları, RNA içeren ve içermeyen etiketli kriyoviyallere eşit şekilde paylaştırın.Daha sonra vialler dondurulur. Standart prosedürler takip edilir. Bu işlemi gövde-kuyruk eklem bölümü için tekrarlayın.Kıyılmış örnekler toplandıktan sonra, tüm transvers kesitleri sağa doğru eğikleştirin. Her bölgenin birbirini izleyen kesitleri sırayla kaldırılacaktır. Parafin ve OCT blokları için, parafin bloklama işlemi için ilk kesiti kaldırın.Eğer bir bölüm çok büyükse, ikiye bölün. Kasetleri A ve B olarak etiketleyin. Parça hâlâ çok büyükse, her bölümü önceki kesime dik olacak şekilde kesin ve ardından kasetleri saat yönünde A'dan D'ye kadar etiketleyin. Burada görüldüğü gibi, etiketi sola gelecek şekilde kaseti konumlandırın.Ardından, dokuyu kasede yerleştirin ve kapağı kapatın. Kasedi, nötr tamponlu formalin içeren bir kaba aktarın. OCT blokları için en medial kesitten başlayarak, her bölge içindeki blokları sırasıyla numaralandırın.Önceden etiketlenmiş bir kalıba ince bir tabaka OCT medyası dökün. Dokuyu yerleştirmeden önce, dokuyu OCT medyası ile kaplayın ve daha önce kenara ayrılan dokuya geri dönerek örneği sonraki kullanım için hızla dondurun. Düğüm kapsülünü çevreleyen yağ ve bağ dokusunu budayarak pankreatik lenf düğümlerini izole edin. Düğümleri DMEF içeren steril bir kaba yerleştirin ve büyük düğümleri 0.5 santimetreden daha büyük olmayan parçalara ayırın.Pankreas lenf düğümleri izole edildikten sonra, dokuyu ileri işlemler için hazırlanan tüpler ve kasetler arasında paylaştırın. Lenf düğümleri tamamlandıktan sonra, dalak kıyılır ve benzer şekilde saklanır. Duodenumu işlemek için, mukozayı mukusla temizlemek amacıyla nemli bir gazlı bez kullanın, mukozayı kesin ve ardından bölümlere ayırın.Mukoza örneklerini daha önce gösterildiği gibi bölün. Bu prosedür kullanılarak, burada görüldüğü üzere pankreasın her bölgesinden temsili örnekler toplanır. Baş, gövde ve kuyruk bölgelerinin ağırlıkları yaklaşık olarak eşitti.Bu videoyu izledikten sonra, insan pankreasının farklı örnek türlerine nasıl dönüştürüleceği, özellikle yönelimin nasıl korunacağı ve peripankreatik yağdan lenf düğümlerinin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

, Yüksek kalite ve insan adacıklar uygun miktarda sağlamak başarılı bir adacık nakli için önemli önkoşullar biridir. Bu video, adım adım tarif insan pankreas adacık izolasyonu için prosedürler: değiştirilmiş bir otomatik yöntemi kullanılarak (bölüm I sindirim ve pankreas dokusu toplanması).

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm I: Sindirim ve Pankreas Doku Koleksiyon

, Yüksek kalite ve insan adacıklar uygun miktarda sağlamak başarılı bir adacık nakli için önemli önkoşullar biridir. Bu video, adım adım tarif insan pankreas adacık izolasyonu (Bölüm II: insan adacıklar arıtma ve kültür) için prosedürleri değiştirilmiş bir otomatik yöntemi kullanarak.

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm II: İnsan Islets saflaştırılması ve Kültür

Araştırma için tip 2 diyabetik adacık kaynağı yetersiz. Burada kısmi pankreatektomi geçiren hastalardan izole adacıklar için protokol paylaşın. Bu yaklaşım, tip 2 diyabetik adacıklar elde etmek için eşsiz bir mekan temsil eder ve temel ve klinik çalışmalar için yeterli sayıda non-diyabetik hastalarda klinik olarak uyumlu.

Kısmen Pancreatectomized hastalar İnsan Islets izolasyonu

Bu video hematoksilen ve eosin (H &amp; E) ve immunohistokimyasal (İHK) kullanarak insan pankreas adacık karakterizasyonu için prosedürleri göstermektedir. Baş, gövde ve kuyruk bölgelerinden Pankreas bölümleri adacık endokrin kompozisyon (insülin, glukagon ve pankreatik polipeptit), hücre çoğaltma (Ki67) ve inflamatuar infiltrasyon (H &amp; E, CD3) belirlemek için H &amp; E ve İHK her ikisi tarafından boyanmış. Unsinat bölge pankreatik polipeptid için İHK kullanarak yerelleştirilmiştir.

İnsan Pankreas Adacıklar için boyama Protokoller

Izole etmek için bir protokol, insan fetal pankreas hücrelerden türetilen kültür ve görüntü adacık hücre kümeleri (SKK) tarif edilmektedir. Yöntem, doku kültür mono-tabaka olarak veya agrega olarak süspansiyon halinde ve proliferasyon belirteçler ve pankreatik hücre hayati kararlar için resimdeki ÜAK'lerin oluşturmak için gerekli adımları göstermektedir.

İnsan Fetal Pankreas Hücre Kümeleri İzolasyon, Kültür ve Görüntüleme

diyabet araştırma alanı için kritik zorluklar adacık β-hücre çoğalmasını düzenleyen ve β-hücre yenilenmesini teşvik etmek için yöntemler geliştirmek moleküler mekanizmalarını anlamak için vardır. Burada yüksek içeriği tarama yöntemi belirlemek ve küçük moleküllerin β-hücresi replikasyon teşvik aktivitesi sunulmuştur değerlendirmek.

Bir Yüksek içerik<em&gt; İn Vitro</em&gt; Pankreas Adacık β-hücre çoğaltma Keşif Platformu

Burada, yöntemleri temizleyerek bir en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı üç boyutlu (3D) kullanarak görüntü insan pankreas bölümlerine pasif mevcut. Bu el yazması insan adacıkları innerve otonomik ve duyusal sinir ağları temel unsurları belirlemek için boyama birden çok ayirt tarafından takip pasif optik takas için bu yordamları gösterir.

İnsan pankreas nöro-ada ağının yüksek çözünürlükte 3D görüntüleme

Bu adacık izolasyon protokolü ekroz dokuyu sindirmek için kollajenaz enjeksiyonunun yeni bir rotasını ve adacıkları farelerden arındırmak için basitleştirilmiş bir degrade prosedürünü tanımlamıştır. Enzimatik sindirim, degrade ayırma/arıtma ve adacık el toplama içerir. Başarılı yalıtım fare başına 250-350 yüksek kaliteli ve tam işlevsel adacıklar verebilir.

Farelerden Pankreas Adacık İzolasyon için Basit Bir Yüksek Verimlilik Protokolü

Burada potansiyel diyabetojenik xenobiotic kimyasallar tanımlamak için xenobiotics tarafından ROS indüksiyon süzmek için fare pankreas adacık hücreleri izole etmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Bir fare pankreas adacık hücre tabanlı tarama diyabetojenik çevresel kimyasallar için

Bu protokol, bir siklik adenozin monofosfat (cAMP) biyosensörünün, bir cAMP fark detektörünün in situ (cADDis) ve bir mikroperifüzyon sisteminin adenoviral iletimini kullanarak hücre içi sinyal olaylarının senkron edinimi ve birlikte kaydı ve birincil insan psödoisletleri tarafından insülin ve glukagon salgılanması için bir yöntemi açıklar.

Floresan Biyosensör Dinamiğinin ve Hormon Salgı Profillerinin Senkron Değerlendirmesi için İnsan Psödoislet Sistemi

Bu protokol, Lewis sıçan pankreas adacıqlarının cerrahi hasamı, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanlı arındırması için standartlaştırılmış bir yöntemi tanımlar; böylece doğrudan nakil veya in vitro çalışmalarda kullanılmak üzere yüksek verimli, yüksek saflıkta preparatlar sağlanır.

Lewis Farelerinden Pankreas Adacığı İzolyasyonu ve Arındırma, Enzimatik Sindirim ve Yoğunluk-Gradient Ayrımı Kullanılarak

Öğrenin insan pankreasının anatomik yönelimini koruyarak diseksiyon yöntemini. Bağırsak ve dalak çıkarılması, mürekkep işaretleme ve bölgesel örnek toplama teknikleriyle diyabet araştırmaları için islet kompozisyonu analizi sağlanır.

İnsan Pankreas için Toplama Protokolü

Daha fazla video keşfet