Name: Fare Barsak ayrı dendritik hücreler ve makrofajlar İzolasyonu ve Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Öğrenin fare barsak dendritik hücreleri ve makrofajları izolasyonunu immunolojik çalışmalar için. Bu yöntem hücre yüzey antijen ekspresyonu ve canlılığı koruyarak hızlı, verimli izolasyon sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Hücre ayırma işlemi için Aaron Rae'ye (Emory Üniversitesi Pediatri Bölümü ve Atlanta Çocuk Sağlığı Merkezi Akış Çekirdeği) teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH hibe AA01787001, Crohn ve Kolit Vakfı Amerika'dan (Crohn's and Colitis Foundation of America) alınan bir Kariyer Geliştirme Ödülü ve T.L.D.'ye verilen bir Emory-Egleston Çocuk Araştırma Merkezi başlangıç hibesi ile desteklenmiştir.

1. Bağırsak Epitel Hücrelerinin Diseksiyonu ve Dissosiyasyonu
Reaktiflerin ve ekipmanların hazırlanması:
<ul>
	<li>Ca2+/Mg2+-içermeyen PBS'yi (CMF PBS) oda sıcaklığına getirin.</li>
	<li>%5 FBS içeren Ca2+/Mg2+-içermeyen HBSS'yi (CMF HBSS/FBS) ve 2mM EDTA'yı oda sıcaklığına getirin.</li>
	<li>Orbital çalkalayıcıyı 37 °C'ye ısıtın.</li>
</ul>
Not: Hücre ölümünü minimize etmek ve maksimum hücre verimi elde etmek için Adım 1.1 ile 1.7 arasındaki işlemler mümkün olduğunca hızlı gerçekleştirilmelidir.
<ol>
	<li>Fareleri CO2 haznesinde ötanize edin ve abdomen ile toraks üzerine %70 etanol püskürtün.</li>
	<li>Makasla abdomenin ortasında küçük bir yatay insizyon yapın ve peritonu açığa çıkarmak için deriyi geriye doğru soyun.</li>
	<li>Pilorik sfinkterden keserek mideyi ince bağırsağın üst kısmından ayırın. Mezenteriyi pensle ayırın ve tüm ince bağırsağı kalın bağırsaktan kurtarmak için ileo-çekal valften tekrar kesin. Anal verge bölgesinden bir kesi yapın ve kalın bağırsak serbest kalana kadar mezenteriyi tekrar ayırın.</li>
	<li>Kolonu makas kullanarak boyuna kesin ve bağırsak lümenindeki fekal içerikleri ve mukusu oda sıcaklığında CMF PBS ile yıkayın.</li>
	<li>İnce bağırsağın anti-mezenterik yüzeyi boyunca bulunan Peyer plaklarını makroskobik olarak çıkarmak için makas ve pens kullanın ve ince bağırsağı boyuna kesin.</li>
	<li>İnce bağırsak lümenini oda sıcaklığında CMF PBS ile fekal içeriklerden ve mukusla yıkayın.</li>
	<li>İnce ve kalın bağırsakları ayrı ayrı yaklaşık 1,5 cm'lik parçalara bölün ve önceden ısıtılmış 30 ml CMF HBSS/FBS ve 2mM EDTA içeren ayrı 50 ml'lik konik tüplere yerleştirin. Her bir 50 ml'lik konik tüpe birden fazla bağırsak parçası eklemeyin.</li>
	<li>Her bir 50 ml'lik konik tüpü yatay olarak bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve 37 °C'de 20 dk boyunca 250 rpm'de çalkalayın.</li>
	<li>Atık kovasının üzerine tek katlı tel bir süzgeç yerleştirin ve 1,5 cm'lik bağırsak parçalarını geri kazanmak için her bir 50 ml'lik konik tüpün içeriğini süzgeçten geçirin; ardından parçaları 30 ml önceden ısıtılmış 2 mM EDTA'lı CHBSS/FBS içeren ayrı 50 ml'lik konik tüplere yerleştirin.</li>
	<li>Adım 1.8'i tekrarlayın.</li>
</ol>
2. Doku Sindirimi ve Bağırsak Hücrelerinin İzolasyonu
Reaktiflerin ve ekipmanların hazırlanması:
<ul>
	<li>Kollagenaz çözeltisi: 40 μg/ml DNase I içeren, önceden ısıtılmış CMF HBSS/FBS içerisinde çözünmüş 1.5 mg/ml Tip VIII Kollagenaz.</li>
	<li>Önceden ısıtılmış CMF HBSS/FBS ve 2mM EDTA.</li>
	<li>37 °C'de önceden ısıtılmış orbital çalkalayıcı.</li>
	<li>Buz gibi soğuk CMF HBSS/FBS.</li>
</ul>
<ol>
	<li>İkinci çalkalama aşamasından sonra, her bir 50 ml konik tüpün içeriğini süzgeçten geçirin ve fazla medyayı kağıt havluyla kuruladıktan sonra 1.5 cm'lik bağırsak parçalarını küçük plastik bir tartım kabına aktarın.</li>
	<li>1.5 cm'lik bağırsak parçalarını doğrudan tartım kabı içerisinde makas kullanarak hızla ince parçalara ayırın ve parçalanmış bağırsakları 20 ml kollajenaz çözeltisine ekleyin. Her bir 50 ml konik tüpü yatay olarak orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve 37 °C'de 200 rpm hızla 10-20 dk boyunca sindirin. Lütfen optimizasyonla ilgili aşağıdaki tartışma kısmına bakınız.</li>
	<li>Kalan bağırsak dokusunun tamamen ayrışmasını sağlamak için kısa süre vorteksleyin ve 100 μm'lik bir hücre süzgecinden doğrudan 50 ml'lik bir konik tüpe filtreleyin.</li>
	<li>Her bir 50 ml konik tüpü CMF HBSS/FBS ile tamamlayın ve 4 °C'de 1500 rpm hızla 5 dk boyunca santrifüjleyin. Santrifüjden sonra kolon örnekleri için katı bir pelet gözlemlenmezse, örnekler 3.5 dk daha santrifüjlenmelidir. Bu yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Süpernatantı dökün ve hücre peletini buz gibi soğuk CMF HBSS/FBS içinde yeniden süspande ederek örnekleri buza yerleştirin.</li>
	<li>FACS kazanımı/analizi için Bölüm 3'e veya yüksek hızlı hücre ayıklama için manyetik boncuk zenginleştirmesi için Bölüm 4'e geçin.</li>
</ol>
3. DC'lerin ve Makrofajların Çok Renkli Akış Sitometrik Analizi için Antikor Boyama
Reaktiflerin ve ekipmanların hazırlanması:
<ul>
	<li>Buz gibi CMF PBS.</li>
	<li>Buz gibi boyama tamponu (CMF PBS + %5 FBS).</li>
	<li>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit kullanarak, buz gibi CMF PBS içerisinde 1:1000 dilüsyonunda ölü hücre boyası hazırlayın.</li>
	<li>Aşağıdaki floresan işaretli monoklonal antikorları (mAbs) buz gibi boyama tamponuna ekleyerek antikor boyama kokteylini hazırlayın: CD45-PerCP, CD103-PE, CD11c-APC, MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700, CD11b-eFluor 450, F4/80-PE-Cy7.</li>
</ul>
<ol>
	<li>Hücreleri 5 ml polistiren yuvarlak tabanlı (FACS) tüpe aktarın.</li>
	<li>Hücreleri buz gibi soğuk CMF PBS ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Numuneleri ölü hücre boyası ile karanlıkta, buz üzerinde 15 dk inkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri buz gibi soğuk CMF PBS ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri, buz gibi soğuk boyama tamponu içerisinde 2.4G2 anti-FcγRIII/II ile buz üzerinde 10 dk boyunca bloke edin.</li>
	<li>Hücreleri buz gibi soğuk boyama tamponu ile yıkayın.</li>
	<li>Numuneleri antikor boyama kokteyli ile karanlıkta, buz üzerinde 20 dk inkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri buz gibi soğuk boyama tamponu ile iki kez yıkayın, numuneleri 400 μl buz gibi soğuk boyama tamponu içinde yeniden süspande edin ve FACS tüplerindeki 40 μm filtre kapaktan geçirin.</li>
	<li>Numuneleri, Bölüm 5 ve Şekil 1'deki kapılama (gating) stratejisinde tanımlandığı şekilde LSR II sitometrede (BD) analiz edin.</li>
</ol>
4. Bağırsaktan DC'lerin ve Makrofajların Zenginleştirilmesi
Reaktiflerin ve ekipmanların hazırlanması:
<ul>
	<li>Buz gibi soğuk boyama tamponu (CMF PBS + %5 FBS).</li>
</ul>
<ol>
	<li>Adım 2.5'ten elde edilen tek hücre süspansiyonunu, üreticinin talimatlarına göre CD11b ve CD11c MACS boncukları ile inkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri buz soğukluğundaki boyama tamponu ile yıkayın ve ardından santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatantı atın ve hücre peletini 1 mL buz soğukluğunda boyama tamponu içinde yeniden süspanse edin; ardından sırasıyla 100 μm'lik bir hücre süzgecinden ve 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.</li>
	<li>MACS LS manyetik kolon kullanarak pozitif seleksiyon ile manyetik boncukla bağlanmış hücreleri zenginleştirin.</li>
	<li>Adım 4.2'yi tekrarlayın ve süpernatantı atın.</li>
	<li>Hücreleri, adım 3.7'de açıklanan şekilde yüzey belirteci mAbs ile inkübe edin.</li>
	<li>Manyetik boncukla zenginleştirilmiş hücreleri buz soğukluğundaki boyama tamponu ile iki kez yıkayın. Hücre peletlerini sodyum azid içermeyen 500 μL buz soğukluğunda boyama tamponu içinde yeniden süspanse edin ve 40 μm'lik hücre süzgecinden geçirerek bir FACS tüpüne aktarın.</li>
	<li>İlgilenilen intestinal DC ve/veya makrofaj alt kümelerini ayırmak için BD ARIA II Hücre Ayırıcı ile FACS-sıralama işlemine geçin.</li>
</ol>
5. LP APC'ler için Kapılama Stratejisi
Not: Pozitif ve negatif popülasyonları ayırmak için kapıların (gate) doğru yerleştirilmesine yardımcı olmak amacıyla, boyanmamış intestinal hücrelerin negatif kontrol olarak kullanılabileceğini lütfen unutmayın.
<ol>
	<li>Şekil 1'de gösterildiği gibi, bir nokta grafiği (dot plot) oluşturun ve önce ölü hücre boyası için pozitif olan hücreleri hariç tutun (Şekil 1A), ardından dublet olayları hariç tutun (Şekil 1B ve C). Sonrasında, döküntüleri (debris) hariç tuttuğunuzdan emin olarak ileri ve yan saçılmaya (forward and side scatter) göre ilgilenilen hücreleri kapılayın (gate) (Şekil 1D).</li>
	<li>Başka bir nokta grafiği oluşturun ve APC'leri fenotipik olarak karakterize eden CD45+ ve I-Ab+ hücrelerini daha detaylı kapılayın (Şekil 1E).</li>
	<li>Ayrı bir nokta grafiğinde, spesifik DC ve makrofaj alt kümelerini (R1, R2 ve R3; Şekil 1F) ayırt etmek için CD11b ve CD11c ekspresyonunu analiz edin. R1 hücreleri CD11c+ CD11bdull/- hücrelerdir. R2 bölgesi, bu hücrelerin R1 hücreleriyle benzer düzeylerde CD11c yüzey ekspresyonuna sahip olduğu ancak aynı zamanda CD11b eksprese ettiği şekilde belirlenmiştir. Bundan sonra, R3 bölgesi CD11b+ ve CD11cdull/- olan hücreler için atanmıştır.</li>
	<li>Makrofaj ve DC popülasyonlarını sırasıyla farklılaştırmak için R1, R2 ve R3 bölgelerini F4/80 ve CD103 ekspresyonu açısından daha detaylı analiz edin. R1'deki CD11c+ CD11bdull/- hücreleri, yüksek düzeylerde αE integrini olan CD103 ve düşük düzeylerde F4/80 eksprese eder (Şekil 1G). R2'deki CD11b+CD11c+ hücreleri, CD103 ve F4/80'in dikotomik ekspresyonuna dayanarak hem DC'lerden hem de makrofajlardan oluşur (Şekil 1H). Son olarak, R3'teki CD11b+CD11cdull/- hücreleri, F4/80+ ve CD103- fenotipik profiline dayanarak makrofajları oluşturur (Şekil 1I)16.</li>
</ol>
6. Temsili Sonuçlar
<img alt="CD belirteçleri ve ölü hücre boyamasını içeren hücre popülasyonlarını analiz eden akış sitometrisi saçılım grafiği diyagramları." src="/files/ftp_upload/4040/4040fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 1"> 
Şekil 1. İntestinal DC'ler ve makrofajlar için kapılama stratejisi. Analizden önce ölü hücreler (A) ve dubletler (B ve C) dışlandı, ardından ince bağırsak hücreleri ileri ve yan saçılıma göre kapılandı (D) ve APC'ler CD45+I-Ab+ (E) olarak tanımlandı. Makrofajlar ve DC'ler, CD11b ve CD11c ekspresyonu ile belirlendi (F). R1 (G), R2 (H) ve R3 (I) popülasyonları üzerinde ön kapılama yapılan hücreler için CD103 ve F4/80 ekspresyonu analiz edildi.
<img alt="CD11c ve CD11b için akış sitometrisi diyagramları (A-C); toplam hücre sayısı üzerinde hücre sindiriminin etkisini gösteren grafik (D-F)." src="/files/ftp_upload/4040/4040fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 2"> 
Şekil 2. Hücre verimi ve antikor boyama kalitesi sindirim süresine bağlıdır. Yetersiz (A, D), optimal (B, E) veya aşırı (C, F) sindirilmiş intestinal dokunun CD11b ve CD11c boyama örüntüsü ve toplam hücre verimi.
Bağırsak hücreleri bir C57BL/6 fare ince bağırsağından izole edildi ve DC'ler ile makrofajlar BD LSR II üzerinde FACS ile analiz edildi. Voltaj ve kompanzasyon, boyanmamış ve tek florokromla boyanmış splenositler kullanılarak ayarlandı. Ölü hücreler (Şekil 1A) ve dubletler (Şekil 1B ve C) öncelikle analiz dışı bırakıldı. İlgi duyulan hücreler daha sonra forward ve side scatter'a (Şekil 1D), ardından CD45+ ve I-Ab+ hücrelerin kapılanmasına (Şekil 1E) göre analiz edildi. Sonrasında, üç bölgeyi tanımlamak için (R1, R2 ve R3; Şekil 1F) CD45+I-Ab+ hücreler arasında CD11b ve CD11c ekspresyonu değerlendirildi. DC'leri ve makrofajları birbirinden ayırt etmek için bu üç bölgedeki CD103 ve F4/80 ekspresyonu sırasıyla değerlendirildi. R1'deki CD11c+ CD11bdull/- hücreler, yüksek düzeyde αE integrin ve CD103 ile düşük düzeyde F4/80 ekspresyonu gösterdi (Şekil 1G). R2'nin CD11b+CD11c+ hücreleri, CD103 ve F4/80'in dikotomik ekspresyonlarına dayanarak hem DC'lerden hem de makrofajlardan oluşuyordu (Şekil 1H); öte yandan R3'ün CD11b+CD11cdull/- hücreleri, F4/80+ ve CD103- fenotipik profiline dayanarak makrofajları oluşturmaktaydı (Şekil 1I)16. R2 kapısındaki makrofajlar ile R3 kapısındaki makrofajlar benzer forward ve side scatter özelliklerine sahiptir ve CD11c ekspresyonu ile ayırt edilebilirler. Bu alt kümelerin fonksiyonel dikotomisi henüz tam olarak anlaşılamamıştır.
Doku sindirim süresinin toplam hücre verimi ile CD11b ve CD11c ekspresyonu arasındaki ilişki Şekil 2'de gösterilmiştir. 3 dk boyunca sindirilen bağırsak dokusu (yetersiz sindirim), düşük toplam hücre sayısı (Şekil 2D) ve dolayısıyla karakterizasyon için uygun az sayıda DC ve makrofaj (Şekil 2A) sağlamıştır. 11 dk boyunca gerçekleştirilen doku sindirimi, yüksek düzeylerde CD11b ve CD11c eksprese eden ve fenotipik olarak belirgin DC ve makrofaj popülasyonları içeren (Şekil 2C) güçlü bir canlı hücre verimi üretmiştir (Şekil 2E). Buna karşılık, 50 dk boyunca sindirim (aşırı sindirim), optimize edilmiş sindirimle karşılaştırıldığında benzer bir hücre verimiyle sonuçlanmış (Şekil 2E ve F), ancak CD11c ekspresyonunun azalmasıyla (Şekil 2C) ve ölü hücre sayısının artmasıyla (veriler gösterilmemiştir), CD11b ve CD11c kullanılarak farklı hücre popülasyonlarının ayırt edilmesi daha belirsiz hale gelmiştir.

<ol><li>Maloy, K. J., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+homeostasis+and+its+breakdown+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease.</a> Nature. 474, 298-306 (2011).</li>
<li>Nagler-Anderson, C., Terhoust, C., Bhan, A. K., Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+antigen+presentation+and+the+control+of+tolerance+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mucosal antigen presentation and the control of tolerance and immunity.</a> Trends Immunol. 22, 120-122 (2001).</li>
<li>Abraham, C., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+host+innate+immune+system+and+microbes+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Interactions between the host innate immune system and microbes in inflammatory bowel disease.</a> Gastroenterology. 140, 1729-1737 (2011).</li>
<li>Macdonald, T. T., Monteleone, I., Fantini, M. C., Monteleone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regula+tine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Regula tine.</a> Gastroenterology. 140, 1768-1775 (2011).</li>
<li>Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal dendritic cells.</a> Adv. Immunol. 107, 109-138 (2010).</li>
<li>Platt, A. M., Bain, C. C., Bordon, Y., Sester, D. P., Mowat, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+independent+subset+of+TLR+expressing+CCR2-dependent+macrophages+promotes+colonic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">An independent subset of TLR expressing CCR2-dependent macrophages promotes colonic inflammation.</a> J. Immunol. 184, 6843-6854 (2010).</li>
<li>Coombes, J. L., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+in+intestinal+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells in intestinal immune regulation.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 435-446 (2008).</li>
<li>Kelsall, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+understanding+the+phenotype+and+function+of+intestinal+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Recent progress in understanding the phenotype and function of intestinal dendritic cells and macrophages.</a> Mucosal Immunol. 1, 460-469 (2008).</li>
<li>Pulendran, B., Tang, H., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor%2C+plasticity%2C+and+crosstalk+between+dendritic+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Division of labor, plasticity, and crosstalk between dendritic cell subsets.</a> Curr. Opin. Immunol. 20, 61-67 (2008).</li>
<li>Denning, T. L., Wang, Y. C., Patel, S. R., Williams, I. R., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamina+propria+macrophages+and+dendritic+cells+differentially+induce+regulatory+and+interleukin+17-producing+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lamina propria macrophages and dendritic cells differentially induce regulatory and interleukin 17-producing T cell responses.</a> Nat. Immunol. 8, 1086-1094 (2007).</li>
<li>Niess, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1-mediated+dendritic+cell+access+to+the+intestinal+lumen+and+bacterial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance.</a> Science. 307, 254-258 (2005).</li>
<li>Milling, S. W., Cousins, L., MacPherson, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+DCs+interact+with+intestinal+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">How do DCs interact with intestinal antigens.</a> Trends Immunol. 26, 349-352 (2005).</li>
<li>Bilsborough, J., Viney, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+dendritic+cells+play+a+role+in+immunity%2C+tolerance%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal dendritic cells play a role in immunity, tolerance, and disease.</a> Gastroenterology. 127, 300-309 (2004).</li>
<li>Stagg, A. J., Hart, A. L., Knight, S. C., Kamm, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dendritic+cell%3A+its+role+in+intestinal+inflammation+and+relationship+with+gut+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">The dendritic cell: its role in intestinal inflammation and relationship with gut bacteria.</a> Gut. 52, 1522-1529 (2003).</li>
<li>Medina-Contreras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1+regulates+intestinal+macrophage+homeostasis%2C+bacterial+translocation%2C+and+colitogenic+Th17+responses+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">CX3CR1 regulates intestinal macrophage homeostasis, bacterial translocation, and colitogenic Th17 responses in mice.</a> J. Clin. Invest. 121, 4787-4795 (2011).</li>
<li>Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Specializations+of+Intestinal+Dendritic+Cell+and+Macrophage+Subsets+That+Control+Th17+and+Regulatory+T+Cell+Responses+Are+Dependent+on+the+T+Cell%2FAPC+Ratio%2C+Source+of+Mouse+Strain%2C+and+Regional+Localization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functional Specializations of Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets That Control Th17 and Regulatory T Cell Responses Are Dependent on the T Cell/APC Ratio, Source of Mouse Strain, and Regional Localization.</a> J. Immunol. , 187-733 (2011).</li>
<li>Kim, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nod2+sensor+promotes+intestinal+pathogen+eradication+via+the+chemokine+CCL2-dependent+recruitment+of+inflammatory+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The Nod2 sensor promotes intestinal pathogen eradication via the chemokine CCL2-dependent recruitment of inflammatory monocytes.</a> Immunity. 34, 769-780 (2011).</li>
<li>Schulz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+CD103%2B%2C+but+not+CX3CR1%2B%2C+antigen+sampling+cells+migrate+in+lymph+and+serve+classical+dendritic+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Intestinal CD103+, but not CX3CR1+, antigen sampling cells migrate in lymph and serve classical dendritic cell functions.</a> J. Exp. Med. 206, 3101-3114 (2009).</li>
<li>Jaensson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+intestinal+CD103%2B+dendritic+cells+display+unique+functional+properties+that+are+conserved+between+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Small intestinal CD103+ dendritic cells display unique functional properties that are conserved between mice and humans.</a> J. Exp. Med. 205, 2139-2149 (2008).</li>
<li>Uematsu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+humoral+and+cellular+gut+immunity+by+lamina+propria+dendritic+cells+expressing+Toll-like+receptor+5%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of humoral and cellular gut immunity by lamina propria dendritic cells expressing Toll-like receptor 5.</a> Nat. Immunol. 9, 769-776 (2008).</li>
<li>Schenk, M., Bouchon, A., Seibold, F., Mueller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-1--expressing+intestinal+macrophages+crucially+amplify+chronic+inflammation+in+experimental+colitis+and+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">TREM-1--expressing intestinal macrophages crucially amplify chronic inflammation in experimental colitis and inflammatory bowel diseases.</a> J. Clin. Invest. 117, 3097-3106 (2007).</li>
<li>Sun, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+intestine+lamina+propria+dendritic+cells+promote+de+novo+generation+of+Foxp3+T+reg+cells+via+retinoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid.</a> J. Exp. Med. 204, 1775-1785 (2007).</li>
<li>Kamada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormally+differentiated+subsets+of+intestinal+macrophage+play+a+key+role+in+Th1-dominant+chronic+colitis+through+excess+production+of+IL-12+and+IL-23+in+response+to+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Abnormally differentiated subsets of intestinal macrophage play a key role in Th1-dominant chronic colitis through excess production of IL-12 and IL-23 in response to bacteria.</a> J. Immunol. 175, 6900-6908 (2005).</li>
<li>Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+Th+cells+resembling+regulatory+T+cells+that+inhibit+chronic+colitis+differentiate+in+the+absence+of+interactions+between+CD4+and+class+II+MHC%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD4+ Th cells resembling regulatory T cells that inhibit chronic colitis differentiate in the absence of interactions between CD4 and class II MHC.</a> J. Immunol. 171, 2279-2286 (2003).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

<img src="/files/ftp_upload/4040/4040fig3.jpg" alt="Hücre veriminin optimizasyonu diyagramı: kollajenaz, doku sindirimi, bütünlük, boyut gibi faktörler." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 3"> 
Şekil 3. Hücre veriminin ve yüzey antijen ekspresyonunun optimizasyonu için önemli faktörler. Hücre verimi ve yüzey antijen ekspresyonu; doku sindirim süresinden, kollajenazın spesifik özelliklerinden, doku parçalama derecesinden ve doku bütünlüğü ile hücreselliğini etkileyebilen inflamasyonun va...

<table><tbody><tr><td>1X PBS, Ca2+&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;- ve Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-siz/suz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenol kırmızılı Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3001603</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>%0,85'lik NaCl içinde 1M HEPES</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS) (Fetal sığır serumu)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td>Isıyla inaktive edilmiş</td></tr><tr><td>0,5M EDTA (pH 8,0)</td><td>Cellgro</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenaz tip VIII </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2139</td><td></td></tr><tr><td>DNaz I</td><td>Roche Grubu</td><td>14785000</td><td>Stok çözelti: 100mg/ml</td></tr><tr><td>405 nm eksitasyon için LIVE/DEAD Fixable Aqua Ölü Hücre Boyama Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>L34957</td><td>1:1000 oranında kullanın</td></tr><tr><td>CD45-PerCP mAb (30F11)</td><td>BD Biosciences</td><td>557235</td><td>1:100 oranında kullanın</td></tr><tr><td>CD103-PE mAb (M290)</td><td>BD Biosciences</td><td>557495</td><td>1:100 oranında kullanın</td></tr><tr><td>Fc&amp;#947;RIII/II mAb (2.4G2)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>1:200 oranında kullanın</td></tr><tr><td>CD11c-APC mAb (N418)</td><td>eBioscience</td><td>17-0114-82</td><td>1:100 oranında kullanın</td></tr><tr><td>MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb </td><td>eBioscience</td><td>56-5321-82</td><td>1:100 oranında kullanın</td></tr><tr><td>CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>48-0112-82</td><td>1:200 oranında kullanın </td></tr><tr><td>F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8)</td><td>eBioscience</td><td>25-4801-82</td><td></td></tr><tr><td>CD11b mikroboncukları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-601</td><td></td></tr><tr><td>CD11c mikroboncukları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik tüpler</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Tek ağlı tel süzgeç</td><td>Chefmate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Küçük tartım kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-116</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;hücre süzgeci</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;hücre süzgeci</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüpler</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>1:100 oranında kullanın</td></tr><tr><td>MaxQ 4450 tezgah üstü orbital çalkalayıcı</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS MACS kolonu</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fare barsak ayrı dendritik hücreler ve makrofajlar İzolasyonu ve karakterizasyonu

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Bağırsakta, komensal flora ve gıda antijenlerine karşı toleransı teşvik ederken, aynı zamanda istilacı patojenlere karşı inflamatuar yanıtlar oluşturmaya hazır durumda olan doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücrelerinden oluşan benzersiz popülasyonlar bulunur1,2. Antijen sunan hücreler, özellikle DC'ler ve makrofajlar, mikrobiyotayı algılama ve buna uygun yanıt verme yetenekleri aracılığıyla intestinal immün homeostazın sürdürülmesinde kritik roller oynarlar3-14. İntestinal DC'lerin ve makrofajların etkili bir şekilde izole edilmesi, bu hücrelerin fenotipinin ve fonksiyonunun karakterize edilmesinde kritik bir adımdır. DC'ler ve makrofajlar dahil olmak üzere intestinal immün hücrelerin izolesi için birçok etkili yöntem tanımlanmış olsa da6,10,15-24, bunların çoğu, hücre yüzeyi antijen ekspresyonunu, hücre canlılığını ve/veya hücre verimini olumsuz etkileyebilen uzun sindirim sürelerine dayanmaktadır. Burada, çok sayıda canlı intestinal DC ve makrofajın hızlı izolasyonu için bir metodolojiyi ayrıntılandırıyoruz. İntestinal DC ve makrofajların fenotipik karakterizasyonu, izole edilen intestinal hücrelerin çok renkli akış sitometrik analiz için floresan işaretli spesifik monoklonal antikorlarla doğrudan boyanmasıyla gerçekleştirilir. Ayrıca, fonksiyonel çalışmalar için, CD11c ve CD11b manyetik aktive hücre ayıklama boncukları ve ardından hücre ayıklama kullanılarak yüksek saflıkta DC ve makrofaj popülasyonları izole edilir.

Burada, fare intestinal dendritik hücrelerinin (DC'ler) ve makrofajların hızlı izolasyonu için bir metodolojiyi detaylandırıyoruz. İntestinal DC'lerin ve makrofajların fenotipik karakterizasyonu çok renkli akış sitometrik analiz kullanılarak gerçekleştirilirken, fonksiyonel çalışmalar için yüksek saflıkta popülasyonlar elde etmek amacıyla manyetik boncuk zenginleştirmesi ve ardından hücre ayıklama yöntemi kullanılır.

Fare Barsak ayrı dendritik hücreler ve makrofajlar İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Bağırsakta, kommensal floraya karşı toleransı teşvik eden ve ... içeren, doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık hücrelerinden oluşan benzersiz popülasyonlar bulunur.

Bu prosedürün genel amacı, fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyon için fare bağırsak dendritik hücrelerini (dc'ler) ve makrofajları hızla izole etmektir. Bu işlem, öncelikle bağırsak dokusunun hasat edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise bağırsak epitelyumunun lamina propriadan ayrıştırılmasıdır.Ardından, prosedürün son adımlarında intestinal lamina propria sindirilir. Lamina propria hücreleri floresan konjuge antikorlarla boyanır ve spesifik hücre popülasyonları için kapılanır. Sonuç olarak, intestinal DC ve makrofaj popülasyonları daha doğru bir şekilde karakterize edilebilir ve sitokin üretimi, antijen sunumu ve bağışıklık hücrelerinin regülasyonunu değerlendirmek üzere fonksiyonel çalışmalar için saflaştırılabilir.Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, doku sindiriminin hızlı gerçekleşmesinin optimal hücre yüzeyi antijen ekspresyonunu, hücre canlılığını ve hücre bütünlüğünü sağlamasıdır. Fareyi ötanize edip ölümünü ayak parmağı sıkıştırma refleksi ile onayladıktan sonra, hayvanın abdomen ve toraks bölgesine %70 ethanol püskürtün. Ardından, bir makas kullanarak abdomenin ortasında küçük bir yatay insizyon yapın ve peritonyumu açığa çıkarmak için deriyi geriy

isolation-characterization-dendritic-cells-macrophages-from-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Miltenyi MAC kiti kullanılarak lenfositlerin İzolasyon tüm lenfoid doku homojenatlarında hücreleri arındırmak için güvenilir bir yol. Miltenyi sistemini kullanarak saflaştırılmış Hücreler genellikle ≥% 96 saf. Burada, CD4 + T hücreleri, Miltenyi tarafından sunulan birçok kitleri biri izole etmek için atılan adımları göstermektedir.

CD4 İzolasyon Miltenyi MACS Arıtma Fare lenf düğümleri + T hücreleri

Fare akciğer dendritik hücreler yüksek oranda saflaştırılmış açıklanmıştır. Özgül ağırlık, geleneksel dendritik hücre alt izolasyon verilir.

Fare Akciğer Dendritik Hücrelerinin İzolasyonu

Peyer plaklarında hücrelerin belirli altgrupları (PPs), gut-ilişkili lenfoid dokuların primer endüktif sitelerin immünolojik işlevlerini anlamak giderek artan bir ilgi var. Burada akım sitometri analizi ve immun için PP cryosections için tek hücre hazırlıkları PP hazırlamak için paralel protokolleri anahat.

Lenfositler ve mürin Peyer en Yamalar itibaren Dendritik Hücreler İzolasyon Ve immün

Bu protokol, antijen yoğunluğuna tek bir hücre süspansiyonu santrifüj ve ilgi hücre popülasyonlarının son olarak manyetik ve / veya FACS ayıklama, ardından doku enzimatik sindirimi farklı adımları ile insan timus hücreleri sunan izole etmek için bir yöntem göstermektedir.

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

Farklı dendritik hücre alt kümeleri, lenfoid organlarda nadir popülasyonlar olarak bulunur ve bu nedenle immünolojik deneyler için yeterli sayıda ve saflıkta izole edilmesi zordur. Burada, fare splenik dendritik hücrelerinin şu anda bilinen tüm ana alt kümelerinin izolasyonu için yüksek verimli, yüksek verimli bir yöntem açıklıyoruz.

Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Bağırsak lenfositlerinin kantitatif karakterizasyonuna, bu hücrelerin çeşitli bağırsak ve sistemik hastalıklarda kritik bir rol oynadığının giderek daha fazla tanınması nedeniyle artan bir ilgi vardır. Bu protokolde, sonraki akış sitometrik karakterizasyonu için tek hücreli popülasyonların farklı ince bağırsak bölmelerinden nasıl izole edileceğini açıklıyoruz.

Fare Küçük Bağırsak Lenfositler izolasyonu ve Akım Sitometrisi Karakterizasyonu

Biz burada yalıtmak ve phenotypical ve fonksiyonel özellikleri değerlendirilmesi için insan kadın üreme sistemi içinde farklı anatomik bölmeleri dendritik hücrelerden arındırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem diğer bağışıklık hücreleri veya diğer Mukozal doku dendritik hücrelerden yalıtmak için adapte edilebilir.

İnsan dişi üreme yolu dendritik hücreler yalıtım Phenotypical ve fonksiyonel çalışmaları için

Monosit kaynaklı DC (MoDC) tehlike ilişkili molekülleri küçük miktarlarda hissi olabilir ve bu nedenle kolayca astarlanmalıdır. MoDC yalıtım kan ve tümörleri ve onların harekete geçirmek bağışıklık kompleksleri ile onların erken harekete geçirmek önlemek için düşünülmesi gereken önemli önlemler vurgulayarak süre için detaylı bir protokol sağlar.

Yalıtım Protokolü fare monosit kaynaklı dendritik hücreler ve onların sonraki Vitro harekete geçirmek ile tümör bağışıklık kompleksleri

Burada biz lenfositler gut ilişkili lenfoid doku Peyer's yamalar ve boşaltma Mezenterik lenf düğümleri de dahil olmak üzere İndüktif sitelerinden ve lamina propria dahil efektör mekanları ekran koruyucu yalıtım için detaylı bir protokol tanımlamak ve bağırsak epitel küçük bağırsak bağışıklık sisteminin.

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

Bu protokolün amacı kollajenaz kullanarak dokunun enzimatik sindirimi ile kolon lamina propria bulunan mononükleer hücreleri izole etmektir. Bu protokol, mononükleer hücrelerin verimli bir şekilde izolasyonuna olanak sağlar ve bu da sağlam immünhenototipleme için kullanılabilir tek bir hücre süspansiyonu ile sonuçlanır.

Lamina Propria Mononükleer Hücrelerin Murine Kolondan Kollajenaz E Kullanarak İzolasyon

Bu çalışmada akım sitometrisi ve izole perfüze edilmiş farelerin beyin koroid pleksusları üzerinde iki farklı geçit stratejisi kullanılmaktadır; Bu protokol, bu beyin yapısını dolduran ana bağışıklık hücresi alt kümelerini tanımlar.

Mikro Disseke Fare Koroid Pleksuslarından İmmün Hücrelerin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Öğrenin fare barsak dendritik hücreleri ve makrofajları izolasyonunu immunolojik çalışmalar için. Bu yöntem hücre yüzey antijen ekspresyonu ve canlılığı koruyarak hızlı, verimli izolasyon sağlar.

Fare Barsak ayrı dendritik hücreler ve makrofajlar İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet