Fare Barsak ayrı dendritik hücreler ve makrofajlar İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyon için fare bağırsak dendritik hücrelerini veya dc'leri ve makrofajları hızlı bir şekilde izole etmektir. Bu, önce bağırsak dokusunun toplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, bağırsak epitelini Lamin propria'dan ayırmaktır.

Daha sonra, bağırsak Lamin Propria, prosedürün son adımlarında sindirilir. Lamin propria hücreleri floresan, konjuge antikorlar ile boyanır ve belirli hücre popülasyonları için kapılanır. Sonuç olarak, bağırsak DC ve makrofaj popülasyonları, sitokin üretimini, antijen sunumunu ve bağışıklık hücrelerinin düzenlenmesini değerlendirmek için fonksiyonel çalışmalar için daha doğru bir şekilde karakterize edilebilir ve saflaştırılabilir.

Bu nedenle, bu tekniğin mevcut yöntemlere göre ana avantajı, doku sindiriminin hızının optimal hücre yüzeyi antijen ekspresyonu, hücre canlılığı ve/veya hücresel sağlamasıdır. Fareye ötenazi yaptıktan ve ayak parmağını kıstırma refleksi ile ölümü doğruladıktan sonra, hayvanın karnına ve göğsüne %70 etanol püskürtün. Ardından, karnın ortasında küçük bir yatay kesi yapmak için bir makas kullanın ve karın zarını ortaya çıkarmak için cildi geri soyun.

Mideyi üst ince bağırsaktan ayırmak için pilo sfinkteri kestikten sonra peritonu makas kullanarak ve mezenteri uzaklaştırmak için forseps kullanarak açın. Tüm ince bağırsağı kalın bağırsaktan kurtarmak için ileoçekal kapaktan tekrar kesin. Mezenteri kalın bağırsaktan ayırmaya devam edin ve anal kenarda bir kesim yapın.

Kolonu uzunlamasına kesmek için makas kullanın ve dışkı içeriğini ve mukusu bağırsak lümeninden yıkamak için oda sıcaklığında C-M-F-P-B-S'yi kullanın. Ardından makası ve forsepsleri makroskopik olarak kullanın. İnce bağırsağın anti mezenterik yüzeyi boyunca odun yığınlarını inceleyin ve ince bağırsağı uzunlamasına kesin.

Daha sonra, dışkı içeriğinin ve mukusun ince bağırsak lümenini daha fazla oda sıcaklığında C-M-F-P-B-S ile temizleyin. Ayrı olarak, ince ve kalın bağırsakları yaklaşık 1,5 santimetrelik parçalar halinde kesin ve parçaları, FBS ve iki milimolar EDTA ile 30 mililitre savaş öncesi C-M-F-H-B-S-S içeren 50 mililitrelik konik tüplere yerleştirin. Her 50 mililitrelik konik tüpü yatay olarak bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve tüpleri 250 RPM'de 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede sallayın.

Ardından, bir atık kovasının üzerine tek gözenekli bir tel süzgeç yerleştirin. Bağırsak parçalarını geri kazanmak için her 50 mililitrelik konik tüpün içeriğini ağın içinden dökün ve daha sonra bunları iki milimolar EDTA'lı FBS'li 30 mililitre Ön Isıtma C-M-F-H-B-S-S içeren yeni ayrı 50 mililitrelik konik tüplere yerleştirin. Son olarak, tüpleri 20 dakika daha orbital çalkalayıcıya geri yerleştirin.

İkinci çalkalama turundan sonra, her tüpün içindekileri süzgeçten geçirin. Yine, fazla ortamı bir kağıt havlu kullanarak temizleyin ve ardından bağırsak parçalarını küçük bir plastik peynir altı suyu teknesine aktarın. Bu tekniğin en zor yönü, başarıyı sağlamak için doku sindirimidir, sindirim süresinin tüm farklı parametreleri, kollajenazın özellikleri, doku bütünlüğü ve sindirilecek dokunun büyüklüğü hızlı bir şekilde makas kullanılarak dikkate alınmalıdır.

Bağırsak parçalarını doğrayın ve kıyılmış bağırsağı 20 mililitre kollajenaz çözeltisi içeren 50 milimetrelik konik bir tüpe ekleyin. Konik tüpü yatay olarak orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve bağırsak parçalarını 200 RPM'de 37 santigrat derecede 10 ila 20 dakika boyunca sindirin. Şimdi, kalan bağırsak dokusunun tamamen ayrışmasını sağlamak için tüpü kısaca girdaplayın ve ardından hücre bulamacını 100 mikronluk bir hücre süzgecinden doğrudan 50 mililitrelik bir konik tüpe süzün

Son olarak, konik tüpü FBS'li C-M-F-H-B-S-S ile doldurun ve hücre çözeltisini dört santigrat derecede 425 kez G'de beş dakika boyunca iki kez santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı dökün ve hücre peletini FBS ile buz gibi C-M-F-H-B-S-S'de yeniden süspanse edin ve numuneleri buzun üzerine yerleştirin. İlgilenilen yüzey proteinleri için hücreleri boyadıktan sonra.

Burada gösterildiği gibi ölü hücre lekesi için pozitif olan hücreleri hariç tutan bir nokta grafiği oluşturarak başlayın. Ardından, burada ve burada gösterildiği gibi ikili olayları hariç tutun. Şimdi, ilgilenilen hücreleri açmak için ileri ve yan saçılma kanallarını kullanın ve kalıntıları dışladığınızdan emin olun.

Ardından, CD 45 pozitif ve IAB pozitif antijen üzerinde başka bir nokta grafiği oluşturun. Hücreleri ayrı bir nokta grafiğinde sunmak, belirli DC ve makrofaj alt kümelerini ayırt etmek için bölgeler oluşturur. Burada gösterilen R bir bölgesi, CD 11 C pozitif, CD 11 B donuk negatif hücreleri yakalar.

R iki bölgesi, CD 11 C için R bir bölgesindeki hücrelerle benzer bir yüzey ifadesi seviyesine sahip olan hücreleri tanımlar, ancak aynı zamanda CD 11 B'yi de ifade eder. Bu üç bölge, makrofaj ve DC popülasyonlarını ayırt etmek için sırasıyla F four 80 ve CD 1 0 3 ekspresyonu için daha fazla analiz edilebilir. Bu nokta grafiğinde görüldüğü gibi, R bir bölgesindeki CD 11 C pozitif CD 11 B donuk negatif hücreler, yüksek alfa ein CD 1 0 3 seviyelerini ve F dört 80'in düşük seviyelerini ifade edecektir.

Bu nokta grafiği, R iki bölgesindeki CD 11 B pozitif CD 11 C pozitif hücrelerin, CD 1 0 3 ve F dört 80'in ikili ifadelerine dayanarak hem DCS hem de makrofajlardan oluşacağını göstermektedir. Son olarak, F dört 80 pozitif ve CD 1 0 3 negatif fenotipik profillerine dayanarak, R üç, kapılı CD 11 B pozitif CD 11 C del negatif hücreler makrofajlardan oluşacaktır, doku sindirim süresinin toplam hücre verimi üzerindeki ilişkisi ile CD 11 B ve CD 11 C'nin ekspresyonu arasındaki ilişki aşağıdaki altı şekilde gösterilmiştir. Üç dakika boyunca sindirilen bağırsak dokusu, düşük bir toplam hücre sayısı verir, bu da karakterizasyon için mevcut birkaç dc ve makrofaj ile sonuçlanır, 11 dakika boyunca doku sindirimi, fenotipik olarak farklı olan yüksek CD 11 B ve CD 11 C seviyelerini ifade eden dcs ve makrofaj popülasyonları üreterek sağlam bir canlı hücre verimi üretir.

Buna karşılık, 50 dakikalık sindirim, optimize edilmiş sindirime kıyasla benzer bir hücre verimi ile sonuçlanır. Bununla birlikte, CD 11 B ve CD 11 C kullanılarak farklı hücre popülasyonlarının tanımlanması daha zor hale gelir. CD 11 C'nin ekspresyonu azaldıkça ölür ve ölü hücre sayısı artar.

Bu nedenle, bağırsak dokusu sindirimi için parametrelerin optimize edilmesiyle, sağlam bir hücre verimi hızlı bir şekilde elde edilebilir. Sonuç olarak, fare bağırsak dc'lerinin ve makrofajlarının hızlı izolasyonu, sağlam yüzey antijenleri ile bağışıklık hücrelerinin fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için yararlı olabilir.