Revealing Kompleksi Beyin Topografya Wholemount İmmünohistokimya

Bu prosedürün genel amacı, bütün halindeki bir beyin yapısında karmaşık gen ekspresyon modellerini ortaya çıkarmaktır. Bu, öncelikle hayvanın perfüze edilmesi ve beynin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından serebellum diseke edilir ve bütün mount boyama protokolü kullanılarak işlenir.

Son adım, histokimyasal bir renk reaksiyonu kullanarak gen ekspresyonunu görselleştirmektir. Nihayetinde, yüzey gen ekspresyon paternlerini görüntülemek için parlak alan mikroskobu kullanılır. Bu tekniğin, doku kesiti immünohistokimyası gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, yeniden yapılandırmaya gerek kalmadan karmaşık paternleri üç boyutlu olarak görselleyebilme yeteneğidir.

Prosedürü laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Joshua White uygulamaktadır. Hayvanu sakrifiye ettikten ve beyni kafatasından çıkardıktan sonra, önce bir pensetle superior ve inferior kallumların ortasına girerek serebellumu beynin geri kalanından ayırın. Ardından ikinci bir penset kullanarak, kallumları ve korteksi yavaşça serebellumdan ayırın.

Serebellumu, ön tarafı aşağıya bakacak ve beyin sapı yukarıyı gösterecek şekilde konumlandırın. Şimdi pensi, beyin sapı ile serebellumun labial 9 ve 10 bölgeleri arasındaki dördüncü ventriküle yerleştirin. Pedinkülleri her iki taraftan pensle sıkarak kesin ve ardından serebellumu beyin sapından nazikçe kaldırarak ayırın.

Serebellumu, 4% paraldehit içerisinde, dört santigrat derecede minimum 24 ila 48 saat boyunca daldırma yöntemiyle post-fiksasyona tabi tutun. Serebellum, çeker ocak altında çalışmak kaydıyla, 4% paraldehit içerisinde uzun süre saklanabilir. Paraldehit çözeltisini nazikçe dökün ve yerine yoğun fiksasyon çözeltisi ekleyin.

Serebellumu ve fiksatif çözeltiyi içeren tüpü bir çalkalayıcıya yerleştirin ve altı ila sekiz saat boyunca nazikçe sallayın. İnkübasyon süresi dolduktan sonra, yoğun fiksatörü dökün ve yerine yoğun çamaşır suyu ekleyin. Serebellumu bu çözelti içinde, gece boyunca 4 °C'de inkübe edin ve ertesi gün sallamaya devam edin.

Tüpteki çözeltiyi %100 methanol ile değiştirin. Tüpü mutatora yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca nazikçe sallayın. İnkübasyon süresi dolduktan sonra, çözeltiyi taze %100 methanol ile değiştirin ve serebellumun dehidrasyonunu sağlamak için inkübasyonu tekrarlayın.

Şimdi, tüpü kuru buz içeren bir kaba yerleştirip 30 dakika boyunca dondurarak dokuyu %100 methanol içinde dondur-çöz işlemine tabi tutun. Bu sürenin sonunda, bir pens yardımıyla tüpü kuru buzdan çıkarın ve çözülmesi için 15 dakika boyunca tezgah üzerine bırakın. Boyama solüsyonlarının penetrasyonunu artırmak için dondur-çöz prosedürünü en az dört kez tekrarlayın.

Son çözünme işleminden sonra, tüpü bir gece boyunca -80 °C'lik dondurucuya yerleştirin. Dokular, dondurma-çözme basamaklarından hemen önce veya sonra -80 °C'de uzun süreler boyunca saklanabilir. Aksi takdirde, protokole devam edilmelidir.

Ertesi gün. Serebellumu oda sıcaklığında, her biri 60 ila 90 dakika boyunca %50 metanol %50 PBS, %15 metanol %85 PBS ve ardından %100 PBS içinde sallayarak daldırma yöntemiyle yeniden hidrate edin. Ardından, yetişkin fare serebellumu için dokuyu, oda sıcaklığında sallayarak PBS içindeki 10 micrograms per milliliter proteinaz K ile iki ila üç dakika boyunca enzimatik sindirime tabi tutun.

Bu sindirim adımı, beş yaş veya daha genç farelerin serebellumu için gerekli değildir. Aşırı sindirimi önlemek için sindirimden sonra proteinaz K'yi hemen dökün ve serebellumu 10'ar dakikalık aralıklarla 3 kez PBS ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, çözeltiyi P-B-S-M-T ile değiştirin ve dokuyu bloke etmek için dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin.

PBSMT bloklama çözeltisini dökün ve dokuyu, PBSMT içinde seyreltilmiş ve %5 DMSO ile desteklenmiş primer antikorda, dört santigrat derecede, sallama yöntemiyle 48 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon süresi tamamlandıktan sonra, bağlanmamış primer antikorları uzaklaştırmak için serebelumu dört santigrat derecede, sallama yöntemiyle PBSMT içinde, her biri iki ila üç saat süren iki ila üç yıkama işlemine tabi tutun.

Ardından dokuyu, %5 DMSO içeren P-B-S-M-T çözeltisi içindeki sekonder antikorda dört santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, sallama işlemi eşliğinde serebellumu daha önce olduğu gibi P-B-S-M-T ile yıkayın. Ardından, dört santigrat derecede sallama işlemiyle bir ila iki saat boyunca PBT ile son bir yıkama gerçekleştirin.

Bu adım, fazla sütün uzaklaştırılmasını sağlar ve boyamanın netliğini artırır. Son olarak, dokuyu DAB çözeltisinde inkübe edin. Optimal boyama yoğunluğuna ulaşana kadar DAB'ı karanlıkta kullanmak en iyisidir.

Işık, kromojenin çökelmesine neden olarak arka plan boyanmasını artırabilmektedir. Optimal boyama yoğunluğuna ulaşıldığında, kahverengi reaksiyon ürünü 10 dakika içinde net bir şekilde görünür olmalıdır. Serebellumu %0,4 sodyum azide içeren PBS içine yerleştirerek reaksiyonu durdurun.

Doku, bu solüsyonda uzun süre saklanabilir. Bütün mount boyalı dokular, PBS veya optimal kırılma indisi sağlayacak başka bir ortamın içine daldırılmış haldeyken görüntülenmelidir. Bütün mount örneği görüntüleme için kolayca konumlandırabilmek adına, plastik bir Petri kabında %1'lik agar jel hazırlayın.

Ardından, jelde küçük delikler açın ve ardından serebellumu görüntüleme için istenen yönde bu deliklere yerleştirip serebellumu PBS ile kaplayın. Boyanmış doku artık ışık mikroskobu kullanılarak görüntülenmeye hazırdır. ZEIN two Adelaide c.

İmmünohistokimya, serebellumun transvers kesitlerinde sagital bantları ortaya çıkarmaktadır. Diyagramda dördüncü, beşinci ve üçüncü labialler etiketlenmiştir. Oryantasyon amacıyla, ölçek çubuğu 500 mikronu temsil etmektedir.

ZEIN iki. Adelaide'in C'si yalnızca kinji hücre gövdelerinin ve dendritlerin alt kümelerinde eksprese edilir. Bu görüntüde, ölçek çubuğu 150 mikronu temsil etmektedir.

Bu görüntü, zein two için boyanmış bütün monte bir serebellumu göstermektedir, Adela C serebellumun anterior, merkezi ve posterior bölgelerinin görüntülerindeki bikini hücre şeritlerini göstermektedir. Roma rakamları serebellar lobları belirtmektedir. LS loist simplex'tir.

PML, paramedian labial (paramedian labial) anlamına gelir. COP, kopülar parametreleri ve etiketleri ifade eder. Crust one ve crust two, iki hemisfer LOE'lerinin isimlerini belirtir; P one ve P three tanımlamaları, belirli BR iki şeritlerini belirtmek için kullanılan standart bir nomenklatüre dayanmaktadır.

Daha fazla ayrıntı için bkz. Sillitoe ve Hawks 2002. Ölçek çubuğu bir milimetreyi temsil etmektedir. Burada cerebellum, kokain ve amfetamin tarafından düzenlenen transkript peptidine karşı bir antikor ile immünboyanmıştır.

Görülebilir ki; bu kart, PCL olarak etiketlenen Purkinje hücre tabakasından geçen ve ml olarak etiketlenen moleküler tabakada sonlanan tırmanıcı lif alt kümelerinde ifade edilmiştir. Burada, ölçek çubuğu 100 mikronu temsil etmektedir.

Bu görüntüde, kart pozitif fiberlerin, PFL ve fl olarak etiketlenen bölgeler de dahil olmak üzere, serebellar korteksin moleküler tabakasında bikini hücresi dendritlerinin şeritlerini yansıttığı görülebilir. Bu prosedür uygulanırken, serebelluma zarar vermemeye dikkat etmek önemlidir. Her türlü dış hasar, karmaşık boyama paternlerinin görünürlüğünü engelleyecektir.

Bu videoyu izledikten sonra, sağlam beyindeki nöronlarda ve onlarla temas eden liflerdeki karmaşık ve ilgi çekici gen ekspresyon modellerinin nasıl ortaya çıkarılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.