Metabolik Etiketleme ve Flow Sitometri ile Hücre Döngüsü İlerleme Kinetik Ölçüm

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, hücre döngüsünün kinetiğini ve ilerlemesini ölçmektir. İlk hücreler, timidin yerine hücrenin DNA'sına dahil edilen romo, deoksi, üridin veya BRDU ile etiketlenmiş nabız takibidir. Hücreler daha sonra BRDU'ya karşı antikorlarla immün olarak boyanır ve boyamadan hemen sonra akış sitometrisi ile analiz edilir.

Etiketli hücreler hücre döngüsü boyunca G ikiye ilerlerken yalnızca S fazındaki hücreler etiketlenir. Mitoz bölünmeyi takiben dört NDNA içeriğine sahip oldukları tespit edilirler. Bu nedenle, akış sitometrisi ile oluşturulan floresan profillerinin analizi, hücre döngüsü ilerlemesinin kinetiğini belirlemek için kullanılabilir.

Bu tekniğin, hücre senkronizasyonu için kimyasallar kullanan diğer protokollere göre en büyük avantajı, hücre bölünme mekanizmasını yanlışlıkla etkileyebilecek fizyolojik bozulmaların olmamasıdır. Bu yöntemi ilk olarak, kimyasal senkronizasyon kullanarak hücre döngüsü ilerleme hızını inceleme girişimlerimiz, analizimize müdahale eden beklenmedik sonuçlar verdiğinde kullandık. Bu yöntem, hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Örneğin, farklı hücre tipleri arasındaki farklı büyüme oranlarının temeli nedir? Bu protokole, bunu yapmak için hücreleri BRDU ile etiketleyen nabız Chase ile başlayın. Her zaman noktası için 10 santimetrelik bir plaka ve aşağıdaki kontrollerin her biri için bir tane etiketleyerek başlayın.

Sadece BRDU, sadece PI, BRDU negatif PI, negatif tohum, her plakaya beş çarpı 10 ila beşinci. Takviye edilmiş DMEM'deki MCF yedi hücresi, hücrelerin iyileşmesini ve bağlanmasını sağlamak için plakaları 24 ila 48 saat boyunca inkübe eder. Hücreler %60 konfeksiyon akıcılığına ulaştığında, ortamı 10 mikromolar içeren taze DMEM ile değiştirin.

BRDU, BRDU'nun DNA'ya dahil edilmesine izin vermek için hücreleri 37 santigrat derece %5 CO2'de bir saat inkübe eder. Bir saat sonra negatif kontrol veya sıfır zaman noktası olarak hareket etmesi için bir plakayı işlenmeden bıraktığınızdan emin olun. Nabız etiketleme ortamını çıkarın ve hücreleri PBS ile iki ila sekiz saatlik zaman noktalarına kadar kısa bir süre durulayın.

Taze büyüme ortamı ekleyin ve tekrar kuluçka makinesine yerleştirin. Ardından, bir sonraki bölümde açıklandığı gibi sıfır ve bir saatlik zaman noktası plakalarını hemen hasat edin. Hücreleri hasat etmek için ortamı aspire edin ve plakayı durulayın.

PBS ile bir kez, tripsin, hücreleri plakadan ayırmak ve beş dakika boyunca üç 90 kez G'de DMEM santrifüjünde toplamak için gözler. Süpernatanı atın. Daha sonra hücreleri, dönüşü takip eden beş dakika boyunca üç kez 90 kez G'de bir ila beş mililitre buz gibi soğuk PBS santrifüjünde durulayın, süpernatanı atın ve hücreleri yüz mikrolitre buzda yeniden süspanse edin.

% 1 FBS içeren soğuk PBS. FBS, hücre topaklanmasını önlemeye yardımcı olur. Bu prosedürün en önemli yönlerinden biri, hasat edilen hücrelerinizden tek hücreli bir süspansiyona sahip olduğunuzdan emin olmaktır.

Gerçekler için. Bunu başarmak için, hücrelerinizi doğrudan etanole damla damla ekleyebilirsiniz. Bu çok önemlidir Hücreleri sabitlemek için, hücreleri damla damla beş mililitre buz koduna eklemek için pipeti kullanın.

15 mililitrelik konik bir tüpte% 70 etanol. Hücreleri 30 dakika buz üzerinde inkübe edin veya gece boyunca dört santigrat derecede saklayın. Bu, çeşitli zaman noktalarından numunelerin toplanmasını durdurmak için ideal bir adımdır, numuneler birkaç gün etanol içinde bırakılabilir, bu da BRDU ve propidyum iyodür boyamayı gerçekleştirmek için protokolün geri kalanı boyunca aynı anda işlenmelerine izin verir.

Hücreleri dört santigrat dereceden çıkarın ve beş dakika boyunca üç kez 90 kez G'de santrifüjleyin. Sıkma işleminden sonra sabitleyicinin çoğunu aspire edin ve yaklaşık 50 mikrolitre bırakın. Sonra girdap.

Girdap yaparken DNA'yı denatüre etmek için peleti gevşetmek için. Yavaşça iki normal HCL Triton X 100'den bir mililitre damla ekleyin, ardından numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Pelet hücreleri, numuneleri üç kez 90 kez G'de beş dakika santrifüjleyerek bir sonraki süpernatanı aspire edin ve atın.

Daha sonra hücre peletini bir mililitre 0.1 molar sodyum tetra borat içinde yeniden süspanse edin. Santrifüjlemeden sonra, hücreler süpernatanı tekrar aspire eder ve atar. Daha sonra hücre peletini 75 mikrolitre BRDU boyamasında yeniden süspanse edin.

İnkübasyonun ardından ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Hücreleri daha önce olduğu gibi santrifüjleme ile pelet yapın ve hücre peletini perdiyum iyodür başına mililitre başına beş mikrogram içeren bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. PI pozitif numuneyi akış sitometresinden geçirirken, hücrelerin uygun boyut dağılımını sağlamak için bir ileri saçılma ve yan saçılma grafiği oluşturun.

Bu parametrelerin her ikisi de doğrusal bir ölçekte çizilmelidir. PI boyamaya karşı floresan darbe genişliğini görüntülemek için FL üç H'ye karşı FL iki W'lik bir grafiği aynı anda görüntüleyin. Bu çizim, hücre döngüsünün normal dağılım modeli içinde olduğu düşünülen hücrelerin fraksiyonunu izole etmek için bir yürüyüş oluşturmak için kullanılır.

Genel olarak, bu dağılım modeli, hücre döngüsünün sırasıyla G bir ve G iki fazını temsil eden PI boyamanın iki N ve dört NDNA içeriğinden iki hücre kümesi ile karakterize edilir. Bu iki küme arasında yer alan bir hücre dizisi, hücre döngüsünün S fazında meydana gelen devam eden DNA replikasyonunu temsil eder. FL, bir, H veya FITC ile Y ekseninde bir günlük ölçeğinde ve PI ile X ekseninde doğrusal bir ölçekte gösteren bir çizim oluşturun.

Bu grafik, çeşitli kontrolleri kullanarak kalan parametreleri ayarlamak ve veri toplamak için kullanılacaktır. Analiz için, yalnızca PI leke örneğini akış sitometresinin yükleme portuna yerleştirin, kazancı G bir'i x ekseninde yaklaşık 200'e yerleştirecek şekilde ayarlayın. Bu, PI lekesinin histogram grafiğinde görselleştirmek daha kolay olacaktır.

Ardından, yalnızca BRDU örneğini yükleme portuna yerleştirin ve çalıştırın. Kazancı, BRDU pozitif ve BRDU negatif olmak üzere iki hücre popülasyonu grafikte görünecek şekilde ayarlayın. İdeal olarak, BRDU negatif hücreler bire 10'un hemen altında veya altında konumlandırılır.

Son kontrol, BDU eğik çizgi PI negatif örneğidir. Hücrelerin üst veya sağ kadranların hiçbirinde görünmediğinden emin olmak için bu negatif kontrolü çalıştırın. Çeşitli grafiklerin parametreleri ayarlandıktan sonra, akış sitometresi kalibre edilir ve BRDU ve PI'nin işlenmesi için hazır hale gelir. Lekeli hücreler, her numune için en az 10.000 PI kapılı hücreden veri toplar.

Daha sonra FlowJo veya faks diva gibi bir yazılım kullanarak, PI'ye karşı FL iki W grafiğinden PI pozitif olarak geçitli hücrelerle PI'ye karşı FITC'nin bir grafiğini oluşturun. Bisiklete binen popülasyonu ayırt etmek. Ardından, BRDU pozitif popülasyonunu izole etmek için ikinci bir kapı oluşturun.

Daha sonra, hücre döngüsü ilerlemesinin zaman seyrini izlemek için, hücre ilerleme döngüsünü karşılaştırmak için zamanın bir fonksiyonu olarak G bir veya G iki içerikli BRDU pozitif hücrelerin sayısını çizin. İki kolorektal hücre hattı arasındaki kinetik: HT 29 ve LS 180. Hücreler, A-B-R-D-U nabzının çıkarılmasını takiben sekiz saat boyunca her saat başı toplandı.

İki profilin kinetiği karşılaştırıldığında, LS 180 hücrelerinde BRDU'dan dört saat sonra t'de, bu zirveye sahip olmayan HT 29 hücre hattı için karşılık gelen zaman noktası ile karşılaştırıldığında, bir G bir zirvenin ortaya çıkması belirgindir. Bu, hücre döngüsünün G iki fazı boyunca hızlandırılmış bir hücre döngüsü ilerlemesini gösterir. Kolorektal hücre hattında LS 180, meme kanseri hücre hattının bir döngü profilini oluşturmak için.

MC yedi hücre, sekiz saat boyunca her saat başı toplandı. BRDU nabzının çıkarılmasının ardından. İmmüno etiketli ve DNA karşı lekeli hücreler daha sonra floresan sinyallerine göre sıralandı.

Burada görülebileceği gibi, KF yedi hücresi, test edilen iki kolorektal hücre hattından herhangi birinden önemli ölçüde daha yavaş bir hızda döngü yaptı. Bu videoyu izledikten sonra, zaman noktası hasadı ile birlikte DNA'nın metabolik etiketlemesinin hücre döngüsü kinetiğini izlemenize nasıl izin verdiğini iyi anlamış olmalısınız.