Tek Oosit Bisülfit Mutagenez

Bu prosedürün genel amacı, tek bir oositteki DNA metilasyonunu analiz etmektir. Bu, önce toplanan oositlerden kümülüs hücrelerinin ve sabun palitasının çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, çok az miktarda DNA'nın kaybolmasını veya bozulmasını önlemek için oositi iki ila bir aros lizis çözeltisine gömmektir.

Daha sonraki bi sülfit mutajenezi gerçekleştirilir, ardından iç içe polimeraz zincir reaksiyonu yoluyla amplifikasyon yapılır. Son adım, PCR ürününün bağlanması ve klonlanmasıdır. Klonlar daha sonra toplanır, PCR ile çoğaltılır ve dizileme için gönderilir.

Sonuç olarak, bisülfit mutajenezi ve dizilemesi, tek bir oositte ilgilenilen bir bölgenin sitozin fosfat gine veya CPG dinükleotidlerinde DNA metilasyonunu göstermek için kullanılır. Bu tekniğin, büyük hücre sayılarının bi sülfit mutajenezi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, sitleri, PCR yanlılığını ve kemoterapi hücre kontaminasyonunu bir araya getirmeden tek bir oositten veri elde edilebilmesidir. Oosit toplama gününde, solüsyon yaparken yazılı protokolde listelenen solüsyonları taze olarak hazırlayın, eldivenleri sık sık değiştirerek ve filtre uçlarını kullanarak DNA kontaminasyonu olasılığını azaltın, ayrıca tüpleri açıkken açılı tutun ve kullanılmadığında tüm tüpleri yeniden kapatın.

Diseke fare yumurtalıklarını M iki ortama yerleştirerek ve kümülüs hücre kompleksini çıkarmak için M kasnağını yırtarak OSI toplamaya başlayın. Daha sonra, 30 mikrolitrelik bir M iki ortam damlasında mililitre hyaluronidaz çözeltisi başına 0.3 miligram kullanarak sitleri kümülüs hücre kompleksinden ayırın. Sitleri sadece kümülüs hücrelerini çıkarmak için gereken süre boyunca çözelti içinde tutun, çünkü uzun süre maruz kalmak onlara zarar verebilir.

Oositleri damla damla M iki besiyerinde 30 mikrolitrelik damlalarla yıkayın ve oositleri damla damla aktarın. Toplam üç yıkama için kümülüs hücrelerinin periyodik olarak çıkarılması. Asidik tyro çözeltisi kullanarak LUCITA'nın Z'sini çıkarın.

Önce oositleri 30 mikrolitrelik bir çözelti damlasına yerleştirin, ardından başka bir 30 mikrolitrelik damlaya aktarın. Taşınan herhangi bir ortam asidi seyreltecek ve verimliliğini azaltacaktır. Sitleri sadece zonayı çıkarmak için gereken süre boyunca çözelti içinde tutun, çünkü uzun süre maruz kalmak onlara zarar verebilir.

Zonanın çıkarılmasından sonra, önce lizis çözeltisini 70 santigrat derecelik bir ısı bloğuna yerleştirin ve agros gömmeyi gerçekleştirmek için sitleri 30 mikrolitrelik bir M iki besiyerinde tekrar yıkayın. Önceden ısıtılmış düşük erime noktasını veya LMP Agros'u lizis çözeltisine ekleyin ve ikiye bir AGROS'tan lizis çözeltisine elde edin. Ardından, tek bir oositi en az M iki ortamda temiz bir cam slayta yerleştirin.

Bir sonraki adım, tek siti Agros ve lizis çözeltisine gömmektir. Agros 65 santigrat derecenin altındaki sıcaklıklarda sertleşeceği için bu hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Mikroskop altında bir pipet ucuna 10 mikrolitre Agros lizis solüsyonu alın.

Agros lizis çözeltisinin yaklaşık bir mikrolitre veya daha azını cam slayt üzerine nazikçe boşaltın ve minimum ortamla karışmasına izin verin. Oositi yavaşça pipet ucuna alın. Daha sonra 10 mikrolitrenin tamamını 300 mikrolitre mineral yağ içeren bir einor tüpüne koyun, böylece elde edilen boncuk küresel bir şekil alır.

Lizis yapmak için tüpü buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. 300 mikrolitre mineral yağı çıkarın ve 500 mikrolitre SDS lizis tamponu ekleyin. Numuneyi ikinci gün 50 santigrat dereceye ayarlanmış bir su banyosunda gece boyunca inkübe edin.

Bisülfür mutajenez çözeltilerini yazılı protokolde açıklandığı gibi taze olarak hazırlayın. 500 mikrolitre SDS lizis tamponunu tamamen çıkararak mutajeneze başlayın. Kalan herhangi bir lizis tamponunun, ısıtıldığında agrosu seyrelteceğini ve boncuğun sonraki adımlarda çözünmeye daha duyarlı olacağını unutmayın.

Lizis tamponunun tamamen çıkarılmasının ardından 300 mikrolitre mineral yağ ekleyin. Numuneyi 90 santigrat derece ısı bloğunda iki buçuk dakika inkübe edin. Sıcaklığı karıştırmak veya karıştırmak, uzatmak veya dalgalanmak için karat alın.

İki buçuk dakika sonra. Numuneyi buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Denatürasyon yapmak için, mineral yağı çıkarın ve tüp hareketine bir mililitre 0.1 molar sodyum hidroksit ekleyin ve tüpü beş ila altı kez ters çevirin.

Numuneyi 15 dakika inkübe edin. Her üç ila dört dakikada bir ters çevrilen 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir su banyosunda, boncuk sodyum hidroksit içinde yüzmelidir. Boncuğun artık tüpün dibinde olmadığına dikkat edin.

Sülfit muamelesi ile gerçekleştirmek için, önce sodyum hidroksitin çıkarılmasının ardından tüpü hafifçe döndürün. 300 mikrolitre mineral yağ ve 500 mikrolitre BIS sülfit çözeltisi ekleyin. Işığa maruz kalmamaya dikkat edin ve tüpü 50 santigrat derece su banyosunda üç buçuk saat inkübe edin.

Şimdi desinasyon yapın. İlk olarak, mineral yağı ve BIS sülfit çözeltisini çıkarmadan önce numuneyi buz üzerinde üç dakika inkübe edin. Hafif bir sıkmadan sonra, bir mililitre 0.3 molar sodyum hidroksit fiske ekleyin ve tüpü beş ila altı kez ters çevirin.

Numuneyi 15 dakika inkübe edin. Her üç ila dört dakikada bir ters çevrilen 37 santigrat derecelik bir su banyosunda, boncuk PCR'ye başlamadan önce sodyum hidroksit içinde yüzmelidir. Numuneleri önce hafifçe döndürerek yıkayın.

Daha sonra sodyum hidroksiti çıkarın ve bir mililitre xte pH 7.5 ekleyin. Oda sıcaklığında beş ila 10 dakika çalkalayın. İkinci bir hafif sıkmanın ardından, bir XTE'yi çıkarın.

Bu yıkama işlemini iki kez tekrarlayın. Sonra bir mililitre otoklav, çift damıtılmış su ekleyin. Oda sıcaklığında beş ila 10 dakika çalkalayın, üçüncü kez hafifçe döndürün ve suyu alın.

Çift damıtılmış suyla yıkamayı iki kez tekrarlayın. Son olarak, tüm süpernatanı çıkarın, sadece aros boncuğunu bırakın. Süpernatantın pH'ının 5.0 olduğunu kontrol edin.

Süpernatan hala çok bazikse, boncukları tekrar çift damıtılmış suyla yıkayın. Bu arada, ilk tur PCR karışımını yazılı protokolde açıklandığı gibi PCR tüpüne ekleyin. Katı agro hızını einor tüpünün dudağına kaydırın.

Daha sonra agro hızını dikkatlice PCR tüpüne aktarın, bir dakika boyunca 70 santigrat dereceye ısıtın ve karıştırın, ardından yazılı protokolde amplifiye edilmesi önerilir. İlk tur amplifikasyonu takiben, şablon olarak birinci tur ürünün beş mikrolitresini kullanarak ikinci tur PCR reaksiyonunu hazırlayın. Mineral yağ tabakasının altına bipa yaptığınızdan emin olun.

Tanı testi olarak metinde belirtildiği gibi ikinci amplifikasyon turunu gerçekleştirmeye devam edin. İkinci tur numuneler, sindirim ürünlerinin %8'lik bir akrilamid jel üzerinde metilasyon veya suşa özgü elektroforez olan bir kısıtlama enzimi ile kesilebilir. Ortaya çıkan herhangi bir heterojen bant, ikinci tur ürünü vektöre klonlamak ve TA klonlama plakasını takiben bu videoya eşlik eden el yazmasında açıklandığı gibi TA klonlamasını gerçekleştirmek için birden fazla diziyi temsil eder, tüm reaksiyon karışımı bir agar ve LB plakasına karışır, ampisilin, ex gal ve IPTG ile desteklenir ve plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe eder.

Ardından koloni PCR ana karışımını yazılı protokolde listelendiği gibi PCR tüpüne ekleyin. Bir pipet ucu ile plakadan beyaz bir bakteri kolonisi seçin ve bir PCR tüpünde 35 mikrolitre koloni PCR ana karışımına döndürün. PCR amplifikasyon elektroforezini takiben, PCR ürününün dört mikrolitresini %1.5'lik bir AGROS jeli üzerinde metinde açıklandığı gibi süspansiyonu amplifiye etmeye devam edin.

Son olarak, sit başına beş koloni PCR'sinin dizilimi için yaklaşık 30 mikrolitre PCR ürünü gönderin. Dizileme sonuçları elde edildikten sonra, metilasyon paternleri, metillendiği gibi kalan herhangi bir orijinal sitozin guanin okunabilir. Tersine, şimdi bir tiamin guanin olan herhangi bir orijinal sitozin guanin, bi sülfit dönüştürülmüş primerler kullanılarak iç içe PCR amplifikasyonunu takiben metillenmedi.

Bir aros jeli bireysel metafaz üzerinde doğru bir fragman boyutunu görselleştirerek başarılı bir dönüşümü doğrulamak mümkündür. İki oosit, bir ebeveyn alelini temsil eder ve teoride bir baskılı metilasyon paterni vardır. İkinci tur PCR ürünleri kasıtsız kontaminasyon açısından test edilebilir.

DNA metilasyonuna duyarlı bir kısıtlama enzimi, metillenmiş veya metillenmemiş bir alel içerip içermediğini değerlendirmek için ikinci tur PCR ürününü sindirmek için kullanılabilir. Burada, enzim tanıma dizisi içindeki metillenmiş bir sitozin parçalanır. Timine dönüştürülen metillenmemiş bir sitozin artık enzim tarafından tanınmaz ve kesilmezken, herhangi bir metafaz hem metillenmiş hem de metillenmemiş aleller içeren iki oosit örneği, kümülüs hücre kontaminasyonunun veya polar cisim inklüksiyonunun göstergesi olduğu için atılmalıdır

Başarılı koloni PCR amplifikasyonu, doğru ürün boyutuna sahip numunelerin dizileme için gönderilmesini sağlamak için bir AROS jeli üzerinde görselleştirilebilir. Bu örnek için, ligasyondan sonra beklenen amplikon boyutu yüz 56 baz çiftidir. Burada, klon beşin yanlış bir amplikon boyutu vardır ve sıralama için gönderilmemelidir.

Bir metafaz iki oositten beş ayrı klonun dizisi, beş özdeş metilasyon modeli ve aynı CPG olmayan dönüşüm oranları üretmelidir. Birden fazla desen içeren tüm örnekler atılmalıdır. Yumurtlanmış metafaz iki sit, iki kromozom kopyasına veya bağlı bir polar gövdeye sahip olduğundan, iki benzer dizi modeli elde etme olasılığı vardır.

Veriler, oldukça farklı metilasyon modellerine sahip herhangi bir siteden atılmalıdır. Kümülüs hücre kontaminasyonu göz ardı edilemeyeceğinden Bu prosedürü denerken, mümkün olduğunca çok sayıda kümül hücresini çıkarmak için HI IDE tedavisini takiben oositleri taze ortamda birkaç kez yıkamayı unutmamak önemlidir. İkincisi, düşük erime noktalı agrolar 65 santigrat derecenin altındaki sıcaklıklarda sertleşir, bu nedenle dikkatli ama hızlı çalışın.

Ve son olarak, sodyum bis sülfat ve hidrokinon ışığa duyarlıdır, bu nedenle reaksiyon tüpleri ve çözeltileri folyoya sarılmalıdır.