Hücre Survival üzerinde Bakteriler ve Etki Dondurma-kurutma için formülasyonlar

Bu deneyin amacı, farklı dondurarak kurutma formülasyonlarının hücre sağkalımı üzerindeki etkisini gözlemlemektir. Başlangıç olarak, hücre kültürünü dondurarak kurutmak için farklı formülasyonlar hazırlanır. Ardından, her bir formülasyon hücre kültürü ile karıştırılır, dondurularak kurutulur ve daha sonra yeniden hidrate edilerek sağkalım oranları ölçülür.

Sonuçlar, karakterize edilen özelliklerle ilişkilendirilebilen sağkalım oranlarındaki farklılıkları göstermektedir. Bu yöntem, bir formülasyonun dehidrasyon sırasında hücre sağkalımı için hangi fiziksel ve yapısal özelliklerinin önemli olduğunu anlamanıza yardımcı olabilir. Pseudomonas putter'ın başlangıç kültürünü hazırlamak için, triptik soya soyu veya TSB eklenmiş agar üzerinde kültüre edilmiş bir hücre kolonisi ile 100 mililitre triptik soya soyu veya TSB'yi inoküle ederek başlayın; kültürü 30 °C'de, 130 RPM'de çalkalayarak yedi saat boyunca inkübe edin.

Kültürden bir alikotu taze TSB'ye aktarın ve 16 saat boyunca büyütün. Hücreleri, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1.500 ×g kuvvetinde santrifüj ederek hasat edin. Hücre peletini, 150 mM sodyum klorür içinde süspanse ederek Resus ile yıkayın.

Hücreleri pelletleyin ve yeniden süspanse edin. Hücreleri formülasyon ortamında süspanse edin. Hücrelerin dondurularak kurutulması için formülasyon çözeltilerini hazırlamak amacıyla.

İlgili matris bileşenlerini tartın ve izotonik koşullar elde etmek için suda çözün. Çözeltiyi eksipiyan, sodyum klorür veya diğer hücre uyumlu çözünür maddelerle ayarlayın. Hücreleri düşük viskoziteli bir çözelti içinde homojen olarak yeniden süspande etmek için, yüksek viskoziteli çözeltileri vorteksleyin.

Bir manyetik karıştırıcı ekleyin ve karışımı çalkalayın. Ardından, formülasyonları önceden tartılmış dondurarak kurutma tüplerine paylaştırın ve tüpleri tartın. Her örnekten 100 µL çekin ve on katlı seri dilüsyonlar hazırlayın; istenen dilüsyonları plakaya ekin ve oda sıcaklığında inkübe edin. Tüpler dondurarak kurutucunun içinde mühürlenecekse, ekilen hücrelerden gelen her tübe bir kauçuk tapa yerleştirin.

Her bir formülasyondaki hücreleri sayın. Kurutulmuş bakteri karışımlarının yüzey gerilimini ölçmek için dune yöntemi kullanın. Platin halkayı, kırmızı renk alana kadar renksiz bir alevde tutarak temizleyin.

Aseton ve tüy bırakmayan bir mendil kullanarak ölçüm kabını durulayıp silin ve iç kısmını yakmak için bir alev kullanın. Dengelenmesi zaman alan çözeltiler için, ölçüm yapmadan önce kabı çözeltiyle doldurun ve yüzeyin sabitlenmesini bekleyin. Burada kullanılan düzenek, yüksek viskoziteye sahip formülasyonlar için kalitatif veriler sağlayacaktır.

Yüzey gerilimini ölçmek için daha düşük konsantrasyonlu bir çözelti kullanın ve dondurarak kurutma koşullarının formülasyonun fiziksel özelliklerine göre ayarlanması gerektiğini ekstrapole edin. En önemli parametre, formülasyonun camlaşma sıcaklığı veya TG'sidir; dondurarak konsantre edilmiş örnek için TG prime olarak belirtilen bu değer, suyun hala mevcut olduğunu gösterir. Formülasyonun donma davranışını belirlemek için, 5 ila 10 miligram örneği kapaklı bir diferansiyel taramalı kalorimetri veya DSC alüminyum panına yerleştirin.

Referans olarak boş bir kap hazırlayın. DSC sıcaklık tarama programını, dondurarak kurutma programındaki dondurma adımını taklit edecek şekilde ayarlayın. Bu işlem, soğutma kinetiğinin, ısıtma taraması başlamadan önce dondurularak kurutulmamış formülasyonların TG'si üzerinde etkili olabilmesi nedeniyle yapılır.

Sıcaklığı, beklenen tg değerinin oldukça altına düşürün. İncelenen formülasyonlar için uygun bir ısıtma hızı seçin. Kaydedilen ısı akışı sinyali watt cinsinden ifade edilir ve ısıtma hızından etkilenecektir.

Daha yüksek bir ısıtma hızı, daha büyük bir TG Prime sinyali verecektir; sıcaklık aralığını hem TG prime'ı hem de formülasyonun erimesini kapsayacak şekilde ayarlayın. Donma davranışı belirlendikten sonra, dondurarak kurutma sürecinin parametrelerini, numunenin sıcaklığının her zaman numunenin TG değerinin altında kalacağı ve oda basıncının formülasyondaki buzun ve kalıntı suyun hızlı süblimasyonuna izin vereceği şekilde düzenleyin. Dondurarak kurutma sonrası kuru ürünleri korumak için.

Dondurarak kurutma döngüsü sonunda vakum boşaltılmadan önce, numuneleri dondurarak kurutucuda mühürleyerek numune atmosferini kontrol edin. Alternatif olarak, flakonlar tercih edilen bir atmosferle doldurulabilir. Numunelerin ortam koşullarına maruz bırakılmaması önemlidir; çünkü saklama atmosferinde bulunan herhangi bir nem veya oksijen, hücrelerin hayatta kalma oranını etkileyecektir.

Son olarak, örnekleri x-ışını ile analiz etmek için flakonları tartın. Bakteriyel matriksten küçük bir miktarı bir numune tutucuya yerleştirin ve numune tutucuyu x-ışını refraktometresine monte edin. Numunede mevcut olan herhangi bir kristal fazı analiz etmek için x-ışını ekipmanıyla uyumlu yazılımı kullanın.

Bakteriyel matrisi elektron mikroskobu ile analiz etmek için, küçük bir miktarı taramalı elektron mikroskobu (SEM) sapına sabitlenmiş karbon banda yerleştirin. SEM tutucusunu bir kaplama cihazına yerleştirin ve numgarayı görüntülemek için numuneyi altın ve paladyum veya platin ile kaplayın. SEM tutucusunu hazneye yerleştirin ve uygun görüntüleme parametrelerini seçin.

Örneğin, bu cihazda beş kilovolt hızlandırma voltajı, üç boyutunda bir spot büyüklüğü, beş milimetre çalışma mesafesi ve sekonder elektron dedektörü kullanıyoruz. Bu tablo, donmuş formülasyonların ısıtılması sırasında DSC ile kaydedilen termal olaylar, kuru numunelerin yapısı ve formülasyon çözeltilerinin yüzey gerilimi dahil olmak üzere farklı formülasyonlara ait verileri listelemektedir. Sükrozun TG prime değeri -40 °C'dir ve ağırlıkça %20'nin altındaki sükroz konsantrasyonlarını tespit etmek zor olabilir.

Eksi 35 santigrat derecedeki termal olay, muhtemelen burada gösterilen buz çözünmesinin başlangıcıyla ilişkilidir. Farklı sakkarit bazlı formülasyonlarda hazırlanan gram-negatif P putter ve gram-pozitif a CHLOROPHYL cus için sağkalım verileri. Formülasyonun hücre sağkalımını destekleme eğiliminin her iki bakteri türü için de benzer olduğuna dikkat edin.

Bu grafik, dondurarak kurutma sonrası sağkalım ile formülasyonların yüzey gerilimleri arasındaki korelasyonu göstermekte olup, daha yüksek yüzey gerilimlerinin daha yüksek sağkalım oranlarına yol açtığını belirtmektedir. Burada gösterilen SEM görüntüleri, matrisleri gevrek kağıt görünümünde olan veya fi, ccal ve sükroz için gömülü bakterilerin olduğu oluklu desenlere sahip birbirine bağlı pürüzsüz tabakalar şeklinde olan dört farklı polimere ait kuru formülasyonları temsil etmektedir. Tabakalar yaklaşık bir mikron kalınlığında ve 10 ila 20 mikron genişliğindedir; fi ccal daha pürüzsüz bir yüzeye, HPMC ve HEC ise çok daha ince tabakalara sahiptir.

Ve bakteriler, muhtemelen bu selüloz bazlı formülasyonlarda polimer-bakteri oranının daha düşük olması nedeniyle daha kolay görünürdür. Ayrıca, HEC ve HPMC için tuz kristalleri gözlemlenmiş olup, ikincisinde polimer tabakalarının yüzeyinde daha fazla çökelek görülmüştür. Bu videoyu izledikten sonra, burada gösterilen teknikleri kullanarak hücre sağkalımının formülasyon özelliklerine nasıl bağlı olduğuna dair iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.