Bir Multiplex Antikor Tarama Yöntemi kullanılarak bir Luminex xMAP Tahlil için bir Capture ELISA Dönüşüm

Aşağıdaki deneyin genel amacı, alternatif antikor çiftlerini değerlendirirken TNF Alfa sitokin için önceden optimize edilmiş bir Eliza testini Xap platformuna dönüştürmektir. Bu, ELIZA kitinden gelen yakalama antikorunun, diğer üç aday yakalama antikoru ile birlikte, birlikte karıştırıldığında dört farklı mikroküre veya boncuk setine bağlanmasıyla elde edilir. Bu dört set, en iyi antikor çiftini belirlemek için dört ayrı tespit antikoru ile dört adayın tümünün aynı anda test edilmesine izin verir.

Sonraki iki Xap testi, en optimal iki antikor çifti ile oluşturulur. Tahlillerin performansı daha sonra sinyal gücü, dinamik aralık ve hassasiyet açısından orijinal EISA tahlilininkiyle karşılaştırılır. Sonuçlar, benzer antikorların aynı koşullar altında çok farklı performans gösterebileceğini ve Luminex Xap testi kullanılarak birkaç antikorun aynı anda taranabildiğini ve testin EISA ile karşılaştırıldığında daha fazla duyarlılığa ve dinamik aralığa sahip olduğunu ortaya koymaktadır.

Bu tekniğin EIS A gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, xap bazlı immünolojik testlerin araştırmacının birden fazla hedefi test etmesine veya bu durumda olduğu gibi aynı anda birden fazla antikoru test etmesine izin vermesidir. Gösterilen en iyi antikoru tanımlamak için. Prosedür, Luminex Corporation'da yardımcı bilim adamı olan Erica Lopez olacak.

Bu protokole, yazılı protokolde tarif edildiği gibi insan TNF alfa için spesifik dört yakalama antikoru ve dört tespit antikorunun seçimi ve hazırlanması ile başlayın. Ayrıca, yakalama antikorlarının konakçı türüne özgü bir doğrulama antikoru hazırlayın. Antikor birleştirme kitindeki reaktifleri oda sıcaklığına getirin.

Dört reaksiyon tüpünü, birleştirme reaksiyonu için seçilen boncuk bölgesi numaralarıyla etiketleyin. Dört manyetik plex mikro küre şişesinin içeriğini etiketli dört reaksiyon tüpüne aktarın. Boncuk setlerinin her birini 500 mikrolitre aktivasyon tamponunda iki kez yıkayın ve her bir boncuk setini antikor birleştirme kitinde tarif edildiği gibi sülf, ONHS ve EDC çözeltileri ile aktive edin.

Kullanım kılavuzu Bir döndürücü üzerinde 20 dakikalık bir inkübasyonun ardından, 500 mikrolitre aktivasyon tamponu ile şimdi aktive edilmiş boncuklarla önceki yıkama adımını toplam üç kez tekrarlayın. Her yıkama için dört ayrı 500 mikrolitrelik solüsyon hazırlayın. Her biri 7.5 mikrogram yakalama antikoru inaktivasyon tamponu içerir.

Bu dört yakalama antikoru çözeltisini ilgili reaksiyon tüplerine ekleyin. Her tüpü hemen vorteksleyin ve bir döndürücü üzerinde iki saat inkübe edin. Antikor birleştirme kitiyle birlikte verilen 500 mikrolitre yıkama tamponu ile şimdi çift boncuklarla yıkama adımını toplam üç kez tekrarlayın.

Son yıkama adımından sonra, mililitre girdap başına 5 milyon antikor bağlı boncuktan oluşan bir nihai stok konsantrasyonu sağlamak için her reaksiyon tüpüne 500 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve ardından boncukları dağıtmak için reaksiyon tüplerini sonikleştirin. Bir hücre sayacı veya hemo sitometre kullanarak birleştirme reaksiyonundan sonra geri kazanılan boncuk sayısını sayın. Birleştirme reaksiyonundan geri kazanım tipik olarak %90'ın üzerindedir Tahlil tamponunda mikrolitre başına 100 boncukluk bir nihai konsantrasyona sahip her set için birleştirilmiş boncuk stoklarının test çözeltilerini hazırlayarak birleştirme reaksiyonunun başarılı olduğunu onaylayın, FICO erything etiketli antis türlerinin seyreltmesini hazırlayın.

Tahlil tamponunda mililitre başına dört mikrogramda IgG doğrulama antikoru, her bir test çözeltisinin 50 mikrolitresini, toplam 16 kuyucuk için yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakanın dört oyuğuna tamponlayın. Daha sonra, arka planı ölçmek için sekiz oyuğa 50 mikrolitre tahlil tamponu ve kalan sekiz oyuğa 50 mikrolitre seyreltilmiş doğrulama antikoru ekleyin. Çok kanallı bir pipetleyici ile birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek reaksiyonları nazikçe karıştırın.

Plakayı örtün ve 30 dakika inkübe edin Oda sıcaklığında bir tabak çalkalayıcı üzerinde. Boncukları çözeltiden çıkarmak için plakayı bir ila iki dakika boyunca manyetik bir plaka ayırıcı üzerine yerleştirin. Ardından, ayırıcı üzerindeyken plakayı bir atık kabı üzerinde zorla ters çevirerek sıvıyı çıkarın.

100 mikrolitre tahlil tamponu ekleyerek ve SANE'yi benzer şekilde plakadan çıkararak her bir kuyuyu iki kez yıkayın. Manyetik plaka ayırıcıyı kullanarak, çok kanallı bir pipetleyici ile beş kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek boncukları 100 mikrolitre tahlil tamponunda yeniden süspanse edin. magix cihazı gibi luminex xap cihazı üzerinde analiz yapın.

Bu reaksiyonun floresan sinyalinin yoğunluğu, boncukların yüzeyindeki protein miktarı ile doğru orantılıdır ve boncuklara bağlı nispi protein miktarının hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Xap testindeki en etkili antikor çiftini belirlemek için, her birinden 10 mikrolitre 0.96 mililitre test tamponuna ekleyerek dört boncuk setinin tümünün bir başlangıç karışımını hazırlayın. Tahlil tamponunda her bir antikoru mililitrede bir mikrograma seyrelterek tespit antikor çözeltilerini hazırlayın.

Ayrıca bir tahlil tamponu. R ve d sistemleri TNF alfa protein standardını mililitre başına 2000 pikogramda hazırlayın ve Streptavidin R FICO eryn'i mililitre başına sekiz mikrograma seyreltin. Tarama testi için bir CoStar yuvarlak tabanlı 96 oyuklu plakanın 16 oyuğunun her birine 50 mikrolitre antikor bağlı boncuk karışımı ekleyin.

Ardından, arka planı ölçmek için 16 kuyucuğun sekizine 50 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin. Daha sonra, yanıtı ölçmek için TNF alfa standardının 50 mikrolitresini diğer sekiz kuyucuğa pipetleyin. Bir tahlil plakası çalkalayıcı üzerinde çalkalarken ışıktan korunarak oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Daha sonra, dört tespit antikorunun her birinden 50 mikrolitreyi, ikisi arka plan kuyusu ve ikisi yanıt kuyusu olan dört oyuğa ekleyin. Tüm kuyucuklara 50 mikrolitre SAPE reaktifi eklendikten sonra aynı koşullar altında 30 dakika inkübe edin. Aynı koşullar altında tekrar 15 dakika inkübe edin.

Plakayı bir dakika boyunca manyetik plaka ayırıcı üzerine yerleştirin. Ardından, ayırıcı üzerindeyken plakayı bir atık kabı üzerinde zorla ters çevirerek sıvıyı çıkarın. 16 kuyucuğun her birine 100 mikrolitre tahlil tamponu pipetleyin.

Ardından manyetik ayırma kullanarak sıvıyı boncuklardan çıkarın. Daha sonra, 16 kuyucuğun her birine 100 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin. Luminex mag picks cihazıyla plakayı okuyun, düzgün çalıştırma için kullanım kılavuzuna bakın.

İstenen sinyal gücünü karşılayan bir antikor çifti seçin. Antikoru yakalamak için en iyisini seçtikten sonra, bu antikorun 100 mikrolitresini test tamponu ile 10 mililitreye seyreltin. İki CoStar yuvarlak tabanlı 96 kuyulu plakanın 78 oyuğuna 50 mikrolitre seyreltilmiş boncuk ekleyin.

Her plaka, farklı bir tespit antikorunun performansını değerlendirmek için kullanılacaktır. Daha sonra, mililitre başına 8.000 pikogramdan başlayan ve mililitre başına dört pikogramla biten 12 noktalı standart bir eğri hazırlayın. Ar-Ge sistemleri ile.

TNF Alfa standardı, plakaların her birine her bir seyreltmenin altı adet 50 mikrolitrelik kopyasını, ayrıca plaka başına toplam 78 kuyu için arka plan olarak her biri 50 mikrolitre tahlil tamponu içeren altı kuyucuk ekler. Plakaları, bir tahlil plakası çalkalayıcı üzerinde çalkalarken ışıktan korunan oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra, ilk plakanın 78 oyuğunun tümüne 50 mikrolitre ilk tespit antikoru ekleyin.

İkinci plakadaki ikinci tespit antikoru için tekrarlayın. Plakaları aynı koşullar altında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra 50 mikrolitre SAPE reaktifini her bir plakanın tüm kuyucuklarına ekleyin.

İki plakayı ışıktan koruyarak 15 dakika çalkaladıktan sonra, plakaları bir dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıların üzerine yerleştirin. Ayırıcı üzerindeyken plakayı bir atık kabı üzerinde zorla ters çevirerek sıvıyı çıkarın. Daha sonra, sıvıyı manyetik boncuklardan çıkarmadan önce plakalar üzerindeki 78 kuyucuğun her birine 100 mikrolitre tahlil tamponu pipetleyin.

Plakalar üzerindeki 78 kuyucuğun her birindeki boncuklara yüz mikrolitre tahlil tamponu ekledikten sonra, düzgün çalışma için kullanım kılavuzuna bakarak mag alma cihazındaki plakaları analiz edin. R ve d sistemlerinde bulunan talimatlara göre, insan TNF Alpha T NF SF one a DUO seti ELI A kitini ayarlar. R ve d kiti ile sağlanan standart tarafından oluşturulan yanıtı ölçün.

ELI testini üç kez daha tekrarlayın, r ve d sistemlerini yakalama ve tespit etme antikorlarını diğer satıcıların antikorlarıyla değiştirin. Basitlik için, antikorları satıcıya göre eşleştirin, her bir çifti, üç TNF Alfa protein standardının her biri ile EISA formatının gerektirdiği şekilde bağımsız olarak değerlendirin. Luminex Xap tahlilleri, Mag PLX mikrokürelerine bağlı dört set TNF alfa antikorunun birleştirilmesiyle dört yakalama antikorunun tümünü bir karışım olarak değerlendirmek için bir multipleks olarak gerçekleştirildi, yakalama antikorları, dört biyotinile edilmiş tespit antikorunun her biri ile ayrı ayrı değerlendirildi, öyle ki bir tespit antikorunun etkileşimi dört yakalama antikorunun her biri ile aynı anda belirlenebilir.

Sonuçlar, r ve d sistemleri DUO setinden gelen antikor çiftinin, 6.183 medyan floresan yoğunluğu veya MFI birimlerinde ortaya çıkan bir yanıtla en iyi performansı gösterdiğini gösterdi. Ayrıca, Millipore ve ABAM'dan gelen tespit antikorlarının, RD sistemleri yakalama antikoru ile birleştirildiğinde XAP testinde makul bir yanıt sağladığı, Millipore, ACAM ve Novus'tan gelen yakalama antikorlarının XAP testinde daha az arzu edilen bir yanıt ürettiği gözlendi. Dört antikor çiftini bir EISA formatında karşılaştırmak için r ve d sistemleri DUO set protokolü kullanıldı.

R ve d sistemleri protokolü, günümüzde yaygın olarak kullanılan tipik EIA protokollerini yansıttığı ve xap teknolojisi ile kullanılan protokollere benzer olduğu için tüm antikor çiftleri ile kullanılmıştır. EISA testleri, r ve d sistemlerinden gelen antikor çiftinin yine en iyi sonuçları verdiğini gösterdi. Acam'dan gelen antikor çifti yanıt vermedi ve Millipore ve Novas'tan gelen antikor çiftleri, antikor reaktivitesindeki herhangi bir varyasyonu değerlendirmek için mütevazı yanıtlar üretti.

Standart ile, dört antikor çiftinin tümü, üç farklı satıcıdan üç farklı rekombinant TNF alfa protein standardı ile test edildi. Veriler, üç satıcıdan gelen rekombinant TNF alfa protein standartlarının eşdeğer sonuçlar verdiğini göstermektedir. R ve d sistemlerinden TNF alfa proteini, ELSA ve XAP tahlilleri ile standart eğriler oluşturmak için kullanıldı.

ELI A testi, r ve d sistemi antikor çifti ile yapılırken, xap testleri, r ve d sisteminin yakalama antikorunu ve r ve d sistemlerinden veya Millipore'dan gelen tespit antikorunu kullandı. R ve d sistemlerinden TNF alfa proteini, sadece mililitre başına 8.000 ila dört pikogram arasında bir konsantrasyon aralığı üretmek için seyreltildi. R ve d sistemlerinden gelen antikor çifti, gösterildiği gibi 20.000 MFI'den daha büyük bir yanıtla Xap testinde beklenen sonucu üretti.

Millipore'dan gelen tespit antikoru, r ve d sistemleri tespit antikoru yerine Xap testi ile kullanıldığında, yanıt, RD sistemlerinden gelen tespit antikoru ile elde edilen yanıtın yaklaşık% 30'u idi. Bu grafikteki yeşil çizgi, üreticinin önerdiği TNF alfa aralığı mililitre başına 16 ila 1000 pikogram olan ELA'nın standart eğrisini temsil eder. Spektrofotometrenin limiti nedeniyle, Eliza testinin aralığını artırmak mümkün değildi.

Ayrıca, her iki yöntemin dinamik aralığı ve hassasiyeti, bir günlük ölçeğinde çizildiğinde daha iyi gösterilir. EISA yanıtının eğimi ile xap testlerinden elde edilen yanıtlar arasında net bir ayrım görülebilir ve ayrıca hem daha yüksek hem de daha düşük konsantrasyonlarda EL iza ile TNF alfa'nın tespiti için daha sınırlayıcı bir kabiliyeti gösterir. İki fonksiyonel TNF alfa xap testi için tespit veya LOD sınırları, arka plandan daha yüksek gözlemlenen bir yanıt seviyesi ile en düşük TNF alfa konsantrasyonunun ve ayrıca altı kopyadan standart sapmasının veya SD'sinin üç katı ile tanımlanarak yaklaşık olarak hesaplandı.

Burada, r ve d sistem çiftini kullanırken, mililitre başına 3.91 pikogramda en düşük TNF alfa konsantrasyonunun, arka plan artı üç SD toplantısı için yanıttan daha büyük olan 66 MFI'lik bir yanıt ürettiği gözlemlenebilir. Bu kriter. Milipor saptama antikoru, r ve d sistemleri yakalama antikoru ile kullanıldığında, saptama sınırı mililitre başına 7.81 pikogramdan azdı.

Bu durumda, ikinci en düşük TNF alfa konsantrasyonu, en düşük TNF alfa konsantrasyonunun yanıtından ve standart sapmasının üç katından daha büyük 17 MFI'lik kabul edilebilir yanıtta üretilir. Benzer şekilde, r ve d sistemleri ikili seti Eliza için algılama sınırının mililitre başına 63 ila 31 pikogram arasında olduğu tahmin edildi. Bu prosedürü takiben, xap testini daha da optimize etmek için test, çeşitli numune matrisleri veya raportördeki antikor konsantrasyonları gibi diğer adımlar gerçekleştirilebilir.