Name: Bir Multiplex Antikor Tarama Yöntemi kullanılarak bir Luminex xMAP Tahlil için bir Capture ELISA Dönüşüm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Öğrenin, TNF Alfa sitokin tespiti için ELISA testini Luminex xMAP platformuna dönüştürme yöntemini. Çoklu antikor taraması ile hassasiyet ve dinamik aralığı artırarak maliyetleri düşürün.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Luminex Corporation tarafından finanse edildi.

<ol><li>Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+multiplexed+analysis+with+the+FlowMetrix+system%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system.</a> Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).</li>
<li>Carson, R. T., Vignali, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantation+of+15+cytokines+using+a+multiplexed+flow+cytometric+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay.</a> J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).</li>
<li>Peck, D., Crawford, E. D., Ross, K. N., Stegmaier, K., Golub, T. R., Lamb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+gene+expression+signature+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput gene expression signature analysis.</a> Genome Biol. 7, 61(2006).</li>
<li>VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+extract+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+from+Schirmer+strips+and+analyze+using+Luminex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex.</a> Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).</li>
<li>Liu, J., Kibiki, G., Maro, V., Maro, A., Kumburu, H., Swai, N., Taniuchi, M., Gratz, J., Toney, D., Kang, G., Houpt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+reverse+transcription+PCR+Luminex+assay+for+detection+and+quantitation+of+viral+agents+of+gastroenteritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Virol%22%5BJournal%5D)">Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis.</a> J. Clin. Virol. 50, 308-313 (2011).</li>
<li>de Jager, W., Prakken, B. J., Bijlsma, J., WJ Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+multiplex+immunoassay+performance+in+human+plasma+and+synovial+fluid+following+removal+of+interfering+heterophilic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heterophilic antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 300, 124-135 (2005).</li>
<li>Codorean, E., Nichita, C., Albulescu, L., Raducan, E., Popescu, I. D., Lonita, A. C., Albulescu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+xMAP+and+ELISA+cytokine+profiles%3B+development+and+validation+for+immunotoxicological+studies+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Roum.+Arch.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Correlation of xMAP and ELISA cytokine profiles; development and validation for immunotoxicological studies in vitro.</a> Roum. Arch. Microbiol. Immunol. 69, 3-19 (2010).</li>
<li>de Jager, W., te Velthuis, H., Prakken, B. J., Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+15+human+cytokines+in+a+single+sample+of+stimulated+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).</li>
<li>DuPont, N. C., Wang, K. H., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+comparison+of+Luminex+multiplex+cytokine+analysis+kits+with+ELISA%3A+Determinations+of+a+panel+of+nine+cytokines+in+clinical+sample+culture+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants.</a> J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).</li>
<li>Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+validation+and+comparison+of+multiplex+cytokine+kits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).</li>
<li>Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+development+of+a+Luminex-based+assay+for+the+detection+of+human+IL-23%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23.</a> Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).</li>
</ol>

Bu çalışma Luminex Corporation üretilen ekipmanlar ile Luminex Corporation yapıldı. R &amp; D Systems &amp; EMD Millipore Luminex Corporation&#39;ın stratejik ortakları olan; multipleks xMAP dayalı testler geliştirmek ve ticarileştirmek için lisanslı.

Luminex xMAP platformuna bir ELISA testinin dönüşüm streptavidin fikoeritrin (SA-PE) ile tipik bir ELISA kiti streptavidin horseradish peroksidaz (SA-HRP) yerine, ve performans için optimize kadar basit olabilir. Kadar yerden bir xMAP immunoassay yaratmak isteyenler için, bu da antikor çiftlerinin hızlı, multipleks değerlendirilmesini sağlar basit bir protokol ile gerçekleştirilebilir. XMAP tayini için reaktifler kolayca çift belirlenmiş yakalama antikorlar MagPlex düşük konsantrasyonda mikrosferler ile xMAP Antikor Kuplaj kiti kullanılarak hazırlandı. Düşük konsantrasyonda mikrosferler kullanımı daha yüksek konsantrasyonda mikrosferler ile aynı test performansı sağlarken assay gelişme maliyetini düşürür. Birleştiğinde MagPlex mikrosferler hazırlamak için gerekli zaman miktarı olan 22 daha hızlıdır, yaklaşık 3 saat - 24 saat tedavi ardından, mont, bir ELISA plaka iyi için gereklikaplamalı kuyuların. XMAP testinin performanslı bir algılama (&lt;4 pg / mL vs&gt; 31 pg / mL) ve dinamik aralık (&lt;4 pg / ml&gt; 8000 pg / mL vs 16 sınırı açısından da ELISA üstündür pg / ml 1000 pg / ml). Plaka okuyucuların bir deney için dinamik aralığı üst sınırını kısıtlayarak, ya 3 ya da 4 OD sınırlı bir OD yelpazesi var. Kuşkusuz, tüm antikorların ELISA biçimde çalışır ve bir ELISA iyi çalışmamaktadır tüm antikorlar xMAP tahlil formata kolayca aktarılabilir. XMAP testler (aynı anda çalışabilir, yani) çoğaltılmış olabilir beri Ancak, bir deney için kullanılacak en iyi çifti belirlemek için aynı anda birden fazla yakalama ve algılama antikor kombinasyonları değerlendirmek mümkündür. Bu süreç, önemli zaman ve her seferinde bir çiftin değerlendirilmesi ile sınırlıdır ELISA geliştirme prosedürü göre reaktifleri kaydeder. Iki veya daha fazla antikor çiftleri eşdeğer yapmalıdır; testin diğer parametreleri olabilirçift ​​(örneğin, kullanılabilirlik, maliyet, vb) uygunluğunu belirlemek için düşünülebilir. XMAP tayini ile geliştirilmiş test performans ve esnekliğe ek olarak, önemli maliyet tasarrufları da vardır. Bir xMAP assay of iyi bir kullanılan boncuklar için gerekli miktarı yaklaşık 7.5 ng iken antikor tavsiye edilen miktarı, tek bir kat ve bir ELISA plaka 400ng olduğu için gereklidir. Böylece, bir ELISA için gerekli olan antikor miktarını iyi bir xMAP deneyde kullanılır ise, 50 den fazla test sonuçları sağlayacaktır. Değerli örnekleri içeren uygulamalar için, xMAP ayrıca önemli bir avantajı vardır. XMAP tahlil için gerekli hacminin yarısı veya daha az olabilir, oysa ELISA için önerilen örnek hacmi 100 uL olduğunu. Üstün dinamik aralık ve duyarlılık ile test üretirken Özetle, Luminex xMAP platformuna bir ELISA testinin dönüştürme, komplikasyonsuz verimli ve maliyet tasarrufu sağlar.

<table border="1"><tbody><tr><td> Tanım </td><td> Satıcı </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> İnsan TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA kiti </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY210 </td><td> Monoklonal ve biyotin birleştiğinde poliklonal antikorlar ve rekombinant TNF-α standart protein içerir </td></tr><tr><td> TNF-α, monoklonal antikor </td><td> Abcam </td><td> Ab18696 </td><td> , Klon CH8820 Antikor Capture </td></tr><tr><td> TNF-α, monoklonal antikor </td><td> Abcam </td><td> Ab16166 </td><td> Biotin coupled Algılama Antikor, klon AS1 </td></tr><tr><td> TNF alfa protein </td><td> Abcam </td><td> Ab9642 </td><td> Rekombinant TNF-α protein standart </td></tr><tr><td> TNF-α, monoklonal antikor </td><td> Novus </td><td> NBP1-50115 </td><td> , Klon 4H31 Antikor Capture </td></tr><tr><td> TNF-α, monoklonal antikor </td><td> Novus </td><td> NB100-78.162 </td><td> Biotin coupled Algılama Antikor, klon MAb11 </td></tr><tr><td> TNF alfa protein </td><td> Novus </td><td> NBC1-18460 </td><td> Rekombinant TNF-α protein standart </td></tr><tr><td> TNF-α, monoklonal antikor </td><td> EMD Millipore </td><td> MAB1141 </td><td> Antikor Capture, 3C7.2 clone </td></tr><tr><td> TNF-α için poliklonal antikor </td><td> EMD Millipore </td><td> 654250 </td><td> Tavşan poliklonal Algılama Antikor </td></tr><tr><td> Streptavidin-Fikoeritrin </td><td> Yosun </td><td> SAPE-001 </td><td> Luminex xMAP Assay için Floresan muhabiri reaktif </td></tr><tr><td> MAGPIX w / xPONENT Yazılım </td><td> Luminex Şirketi </td><td> MAGPIX-XPONENT </td><td> Luminex Enstrüman </td></tr><tr><td> xMAP Antikor Kaplin (AbC) Kit </td><td> Luminex Şirketi </td><td> 40-50016 </td><td> EDC reaktifi, sülfo-NHS reaktifi aktivasyon tampon, yıkama tamponu, 1.5 ml reaksiyon tüpleri ve tek kullanımlık pipetler içerir </td></tr><tr><td> MagPlex mikroküreleri Düşük Konsantrasyon </td><td> Luminex Şirketi </td><td> MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID </td><td> Düşük konsantrasyon boncuklar (@ 2.5 x 10 6 boncuk / mL) </td></tr><tr><td> EZ-Link sülfo-NHS-LC-Biotin </td><td> Thermo Fisher </td><td> PI-21335 </td><td> Değiştirilmemiş algılama antikor biyotinilasyon kiti </td></tr><tr><td> Tecan Sonsuz F200 Okuyucu </td><td> Tecan </td><td></td><td> ELISA plaka okuyucu </td></tr><tr><td> Fosfat Tamponlu Salin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-3688 </td><td> % 1 BSA-PBS, Tayin tamponu </td></tr><tr><td> Bir Pint Kompakt Ultrasonik Temizleyici, 115 VAC </td><td> Cole-Parmer </td><td> WU-08.849-00 </td><td> 55 kHz etkili bir çalışma frekansı üretin </td></tr><tr><td> Manyetik Boru Ayırıcı </td><td> Luminex Şirketi </td><td> CN-0288-01 </td><td> Kaplin yıkama adımları tek 1.5mL tüp manyetik ayırma için </td></tr><tr><td> Manyetik Kalıp Ayırıcı </td><td> Luminex Şirketi </td><td> CN-0269-01 </td><td> Tahlil yıkama adımda 96-plaka manyetik ayırma için </td></tr></tbody></table>

bir multiplex antikor tarama yöntemi kullanılarak bir luminex xmap tahlil için bir capture elisa dönüşüm

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Enzim bağlı immünosorbent assay (ELISA) uzun yaşam bilim araştırma ve klinik teşhis hem de biyolojik örnekler ilgi analitlerin tespiti için temel araç olmuştur. Bununla birlikte, ELISA sınırlamaları vardır. Bu, tipik olarak bir 96-kuyucuklu mikroplaka gerçekleştirilir ve kuyuları, ilgilenilen bir antijen yakalamak için örnek nispeten büyük bir miktarda gerektiren, yakalama antikoru ile kaplanır. Kuyularının geniş yüzey alanına ve antikor çekimi hidrofobik bağlayıcı da spesifik olmayan bağlama ve yüksek arka yol açabilir. Ayrıca, çoğu ELISA&#39;lar makul bir hassasiyeti elde etmek için sinyallerin enzim-aracılı amplifikasyon dayanır. Böyle amplifikasyon her zaman doğrusal değildir ve can böylece çarpık sonuçlar. Geçen 15 yıl içinde, yeni bir teknoloji benzer bir wo ile, bu ELISA faydalar sunar, aynı zamanda daha yüksek verim, yüksek esneklik, azaltılmış örnek hacmi ve düşük maliyet sağlayan ortaya çıkmıştırrkflow 1, 2. Luminex xMAP Teknoloji monoplex protein ve nükleik asit uygulamalarının 3-5 hem uygulanabilir multipleks testler ile birlikte etkin bir mikroküre (boncuk) dizi platformudur. Boncuklar ELISA ile karşılaştırıldığında, daha az ve daha küçük antikor çekimi Örnek miktarlara, kovalent olarak daha küçük bir yüzey alanı üzerine sabitlenmiş yakalama antikoru sahiptir, ve spesifik olmayan bağlanma önemli ölçüde azalır. Gibi beyin omurilik sıvısı, eklem sıvısı, vb 6 gibi sınırlayıcı örnekleri ile çalışırken daha küçük örnek hacmi önemlidir. Tahlil multiplekslemesi daha tek bir örnekten çok sayıda sonuç sağlayarak, örnek hacmi gereksinimlerini azaltır. Luminex tarafından son gelişmeler şunlardır: Yeni MAGPIX sistemi, bir küçük, daha ucuz, kolay kullanımlı analizörü; Düşük Konsantrasyon Manyetik MagPlex Mikroküreler pahalı filtre plakaları olan ihtiyacı ortadan kaldırmak ve daha iyi analiz gelişimi için uygun bir çalışma konsantrasyonu gelir vedüşük hacimli uygulamalar ve xMAP Antikor Kaplin (AbC) Kit, bir protokol, reaktifler ve ilgi yakalama antikor boncuk bağlanması için gerekli sarf malzemeleri içerir. (Kit içeriğini ayrıntılı bir listesi için malzemeler bölümüne bakınız.) Bu deneyde, biz xMAP platformuna TNF-alfa sitokin için bir ön optimize ELISA testi dönüştürmek ve iki yöntem 7-11 performansını karşılaştırmak. TNF-alfa otoimmün hastalığı olan hastalarda inflamatuar yanıtların ölçümünde kullanılan bir biyolojik belirteç olduğunu. Biz dört farklı mikroküre setleri veya bölgelere dört aday yakalama antikorlar kaplin ile başlar. Birlikte karıştırıldığında, bu dört takım iyi antikor çifti, tasarruf reaktifler, örnek ve zamanı belirlemek için dört ayrı algılama antikorlar ile dört adayların aynı anda test için izin verir. İki xMAP testlerin ardından iki en iyi antikor çiftleri ile inşa ve performans edilirsinyal gücü, dinamik aralık ve duyarlılık konusunda özgün ELISA testi kıyasla.

Bir ELISA kolayca Luminex xMAP assay dönüştürülebilir ve, çoğullama, çeşitli antikorların avantajları ile tahlil maliyet düşürürken, artan duyarlılık ve dinamik aralığı ile sonuçlanan, optimum bir antikor çifti tanımlamak için eşzamanlı taranabilir.

Bir Multiplex Antikor Tarama Yöntemi kullanılarak bir Luminex xMAP Tahlil için bir Capture ELISA Dönüşüm

Enzim bağlantılı immünosorbent analiz (ELISA), hem yaşam bilimleri hem de klinik araştırmalar için biyolojik örneklerdeki ilgili analitlerin tespiti amacıyla uzun süredir temel araç olmuştur.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, TNF Alpha sitokini için önceden optimize edilmiş bir Eliza analizini, alternatif antikor çiftlerini değerlendirirken Xap platformuna dönüştürmektir. Bu işlem, ELIZA kitindeki yakalama antikoru ile diğer üç aday yakalama antikorunun, birlikte karıştırıldığında dört farklı mikroküre veya boncuk setine bağlanmasıyla gerçekleştirilir. Bu dört set, en iyi antikor çiftini belirlemek için dört ayrı deteksiyon antikoru ile tüm dört adayın eş zamanlı olarak test edilmesine olanak tanır.Sonraki iki Xap analizi, en optimal iki antikor çifti ile oluşturulur. Ardından, analizlerin performansı; sinyal gücü, dinamik aralık ve hassasiyet açısından orijinal EISA analizi ile karşılaştırılır. Sonuçlar, benzer antikorların aynı koşullar altında oldukça farklı performanslar gösterebileceğini ve Luminex Xap analizi kullanılarak birçok antikoru aynı anda taramanın mümkün olduğunu ortaya koyarak, bu analizle EISA'ya kıyasla artırılmış hassasiyet ve dinamik aralık elde edildiğini göstermektedir.Bu tekniğin EIS A gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, xap tabanlı immünosayımların araştırmacının birden fazla hedefi test etmesine veya bu vakada olduğu gibi, birden fazla antikoru eş zamanlı olarak test etmesine olanak tanımasıdır. En iyi antikoru belirlemek için izlenecek prosedür, Luminex Corporation'da yardımcı bilim insanı olan Erica Lopez tarafından gösterilecektir.Bu protokole, yazılı protokolde açıklandığı üzere, insan TNF alpha'ya özgü dört yakalama antikoru ve dört saptama antikorunun seçimi ve hazırlanması ile başlayın. Ayrıca, yakalama antikorlarının konakçı türüne özgü bir konfirmasyon antikoru hazırlayın. Antikor bağlama kitindeki reaktifleri oda sıcaklığına getirin.Kenetleme reaksiyonu için seçilen boncuk bölge numaralarıyla dört reaksiyon tüpünü etiketleyin. Dört mag plex mikroküre şişesinin içeriğini etiketlenmiş dört reaksiyon tüpüne aktarın. Boncuk setlerinin her birini 500 µL aktivasyon tamponu ile iki kez yıkayın ve antikor kenetleme kitinde açıklandığı şekilde her bir boncuk setini sulf ONHS ve EDC çözeltileri ile aktive edin.Kullanım kılavuzu: Rotatör üzerinde 20 dakikalık inkübasyonun ardından, artık aktive olmuş boncuklarla önceki yıkama adımını 500 µL aktivasyon tamponu ile toplamda üç kez tekrarlayın. Her yıkama için, her biri 7,5 µg yakalama antikoru inaktivasyon tamponu içeren dört ayrı 500 µL çözelti hazırlayın.Bu dört yakalama antikoru çözeltisini ilgili reaksiyon tüplerine ekleyin. Her tüpü hemen vorteksleyin ve bir rotatör üzerinde iki saat inkübe edin. Antikor bağlama kiti ile birlikte verilen yıkama tamponunun 500 microliters miktarı ile, artık bağlanmış olan boncuklar için yıkama adımını toplam üç kez tekrarlayın.Son yıkama adımından sonra, mililitre başına 5 milyon antikor bağlı boncuk nihai stok konsantrasyonu sağlamak için her reaksiyon tüpüne 500 mikrolitre yıkama tamponu ekleyip vorteksleyin ve ardından boncukları dağıtmak için reaksiyon tüplerini sonikasyona tabi tutun. Bağlama reaksiyonu sonrası geri kazanılan boncuk sayısını bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak sayın. Bağlama reaksiyonundan geri kazanım tipik olarak %90'ın üzerindedir. Her set için analiz tamponu içinde mikrolitre başına 100 boncuk nihai konsantrasyonda bağlı boncuk stoklarının test çözeltilerini hazırlayarak ve FICO eritrosit işaretli antis türünün dilüsyonunu hazırlayarak bağlama reaksiyonunun başarılı olduğunu doğrulayın.Deney tamponu içerisinde mililitrede dört mikrogram konsantrasyondaki IgG konfirmasyon antikorundan, yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına, her bir test çözeltisinden toplam 16 kuyucuk olacak şekilde dört kuyucuğa 50 mikrolitre şeklinde dağıtın. Ardından, arka plan ölçümü yapmak için sekiz kuyucuğa 50 mikrolitre deney tamponu ve kalan sekiz kuyucuğa 50 mikrolitre seyreltilmiş konfirmasyon antikoru ekleyin. Reaksiyonları, çok kanallı bir pipetle birkaç kez yukarı-aşağı pipetleme yaparak nazikçe karıştırın.Plakayı kapatın ve oda sıcaklığında, bir plak sallayıcı üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin. Boncukları çözeltiden ayırmak için plakayı bir ila iki dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin. Ardından, plaka ayırıcı üzerindeyken plakayı bir atık kabının üzerinde kuvvetlice ters çevirerek sıvıyı uzaklaştırın.Her bir kuyucuğa 100 µL assay tamponu ekleyip SANE'yi plakadan benzer şekilde uzaklaştırarak iki kez yıkayın. Manyetik plaka ayırıcıyı kullanarak, çok kanallı bir pipetle beş kez nazikçe yukarı aşağı pipetleme yaparak boncukları 100 µL assay tamponunda yeniden süspanse edin. Magix cihazı gibi bir luminex xap cihazında analiz edin.Bu reaksiyonun floresan sinyalinin şiddeti, boncukların yüzeyindeki protein miktarıyla doğrudan orantılıdır ve böylece boncuklara bağlanan proteinin göreceli miktarının hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Xap analizindeki en etkili antikor çiftini belirlemek için, her bir boncuk setinden 10 µL'yi 0,96 mL analiz tamponuna ekleyerek dört boncuk setinin başlangıç karışımını hazırlayın. Her bir antikoru analiz tamponu içinde 1 µg/mL olacak şekilde seyrelterek deteksiyon antikoru çözeltilerini hazırlayın.Ayrıca bir analiz tamponudur. R&amp;D Systems TNF alpha protein standardını 2000 picograms per milliliter konsantrasyonda hazırlayın ve Streptavidin R FICO eryn'i eight micrograms per milliliter olacak şekilde seyreltin. Tarama analizi için, antikorla eşleştirilmiş boncuk karışımının 50 microliters'ını, CoStar yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu bir plakanın 16 kuyucuğunun her birine ekleyin.Ardından, arka planı ölçmek için 16 kuyucuğun sekizine 50 µL analiz tamponu ekleyin. Daha sonra, yanıtı ölçmek için diğer sekiz kuyucuğa 50 µL TNF alpha standardı pipetleyin. Bir analiz plakası çalkalayıcı üzerinde sallayarak, oda sıcaklığında ve ışıktan korunaklı bir ortamda bir saat boyunca inkübe edin.Ardından, ikisi arka plan kuyucuğu ve ikisi yanıt kuyucuğu olan dört kuyucuğun her birine, dört saptama antikorunun her birinden 50 µL ekleyin. Tüm kuyucuklara 50 µL SAPE reaktifi ekledikten sonra aynı koşullar altında 30 dakika boyunca inkübe edin. Aynı koşullar altında 15 dakika daha inkübe edin.Plakayı bir dakika boyunca manyetik plaka separatörüne yerleştirin. Ardından, plaka separatör üzerindeyken, plakayı bir atık kabı üzerinde kuvvetlice ters çevirerek sıvıyı uzaklaştırın. 16 kuyucuğun her birine 100 µL assay tamponu pipetleyin.Ardından, manyetik ayırma yöntemiyle boncuklardaki sıvıyı uzaklaştırın. Sonra, 16 kuyucuğun her birine 100 µL assay tamponu ekleyin. Plakayı, uygun çalışma prosedürü için kullanıcı kılavuzuna başvurarak Luminex mag picks cihazı ile okuyun.İstenen sinyal gücünü karşılayan bir antikor çifti seçin. En iyi yakalama antikorunu seçtikten sonra, bu antikora bağlanmış boncuk stok çözeltisinin 100 µL'sini assay tamponu ile 10 mL'ye seyreltin. Seyreltilmiş boncukların 50 µL'sini, iki adet CoStar yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu plakanın 78 kuyucuğuna ekleyin.Her bir plaka, farklı bir saptama antikorunun performansını değerlendirmek için kullanılacaktır. Ardından, R&amp;D Systems ürünleri ile mililitrede 8.000 pikogramdan başlayıp mililitrede dört pikograma kadar uzanan 12 noktalı bir standart eğri hazırlayın.TNF Alpha standardı için, her bir seyreltmeden altı adet 50 microliter tekrarlanan örneği her bir plakaya ekleyin; ayrıca arka plan için her birinde 50 microliter assay buffer bulunan altı kuyucuk ekleyerek plaka başına toplam 78 kuyucuk oluşturun. Plakaları, bir assay plate shaker üzerinde sallayarak, oda sıcaklığında ve ışıktan korunaklı bir şekilde bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, ilk plakanın tüm 78 kuyucuğuna 50 microliter ilk deteksiyon antikoru ekleyin.İkinci plaka üzerindeki ikinci saptama antikoru için işlemi tekrarlayın. Plakaları aynı koşullar altında 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, her plakanın tüm kuyucuklarına 50 µL SAPE reaktifi ekleyin.İki plakayı ışıktan koruyarak 15 dakika boyunca çalkaladıktan sonra, plakaları bir dakika boyunca manyetik plaka ayırıcılara yerleştirin. Ayırıcı üzerindeyken plakayı bir atık kabının üzerine kuvvetlice ters çevirerek sıvıyı uzaklaştırın. Ardından, manyetik boncuklardan gelen sıvıyı daha önce uzaklaştırdıktan sonra, plakalardaki 78 kuyucuğun her birine 100 microliters analiz tamponu pipetleyin.Plakalardaki 78 kuyucuğun her birindeki boncuklara yüz mikrolitre analiz tamponu ekledikten sonra, uygun çalışma için kullanıcı kılavuzuna başvurarak plakaları mag picks cihazında analiz edin. R&amp;D Systems, human TNF Alpha TNF SF1a DUO set ELISA kiti ile birlikte verilen talimatları izleyin. R&amp;D kitiyle birlikte sağlanan standart tarafından oluşturulan yanıtı ölçün.R&amp;D Systems yakalama ve tespit antikorlarını diğer tedarikçilerin antikorlarıyla değiştirerek ELI assay'ini üç kez daha tekrarlayın. Kolaylık sağlamak adına, antikorları tedarikçiye göre eşleştirin ve her bir çifti, EISA formatının gerektirdiği şekilde üç TNF Alpha protein standardının her biriyle bağımsız olarak değerlendirin. Luminex Xap assay'leri, Mag PLX mikrokürelerine bağlanmış dört set TNF alpha antikoru kombinleyerek dört yakalama antikorunun tamamını bir karışım olarak değerlendirmek için multiplex şeklinde gerçekleştirildi; yakalama antikorları, biotinillenmiş dört tespit antikorunun her biriyle ayrı ayrı değerlendirilerek, bir tespit antikorunun dört yakalama antikorunun her biriyle olan etkileşiminin eş zamanlı olarak belirlenebilmesi sağlandı.Sonuçlar, R&amp;D Systems DUO setindeki antikor çiftinin, 6.183 medyan floresan yoğunluğu veya MFI birimlik bir yanıtla en iyi performansı gösterdiğini belirtmiştir. Ayrıca, Millipore ve ABAM'dan gelen saptama antikorlarının, RD Systems yakalama antikoru ile birleştirildiğinde XAP analizinde makul bir yanıt verdiği; Millipore, ACAM ve Novus'tan gelen yakalama antikorlarının ise XAP analizinde daha az istenen bir yanıt ürettiği gözlemlenmiştir. Dört antikor çiftini bir EISA formatında karşılaştırmak için R&amp;D Systems DUO set protokolü kullanılmıştır.Günümüzde yaygın olarak kullanılan tipik EIA protokollerini yansıttığı ve xap teknolojisiyle kullanılan protokollere benzediği için, tüm antikor çiftlerinde r and d systems protokolü uygulanmıştır. EISA testleri, r and d systems'den alınan antikor çiftinin yeniden en iyi sonuçları verdiğini göstermiştir. Antikor reaktivitesindeki herhangi bir varyasyonu değerlendirmek amacıyla kullanılan Acam antikor çifti hiçbir yanıt üretmezken, Millipore ve Novas antikor çiftleri düşük düzeyde yanıtlar üretmiştir.Standart ile birlikte, dört antikor çiftinin tamamı, üç farklı tedarikçiden alınan üç farklı rekombinant TNF alfa protein standardı ile test edildi. Veriler, üç tedarikçiden gelen rekombinant TNF alfa protein standartlarının eşdeğer sonuçlar verdiğini göstermektedir. R&amp;D Systems'den alınan TNF alfa proteini, ELSA ve XAP analizleri ile standart eğriler oluşturmak için kullanılmıştır.ELI A analizi R&amp;D Systems antikor çifti ile gerçekleştirilirken, Xap analizlerinde R&amp;D Systems yakalama antikoru ile birlikte R&amp;D Systems veya Millipore saptama antikoru kullanılmıştır. R&amp;D Systems'den temin edilen TNF alfa proteini, yalnızca 8.000 ile 4 pg/mL arasında değişen konsantrasyonlar oluşturacak şekilde seyreltilmiştir. R&amp;D Systems'e ait antikor çifti, Xap analizinde gösterildiği üzere 20.000 MFI'den daha yüksek bir yanıtla beklenen sonucu vermiştir.Xap analizi için R&amp;D Systems tespit antikoru yerine Millipore tespit antikoru kullanıldığında, yanıt RD Systems tespit antikoru ile elde edilen yanıtın yaklaşık %30'u kadardı. Bu grafikteki yeşil çizgi, üretici tarafından önerilen TNF alpha aralığı 16 ila 1000 picograms per milliliter olan ELISA'nın standart eğrisini temsil etmektedir. Spektrofotometrenin limitleri nedeniyle, ELISA analizinin aralığını artırmak mümkün olmamıştır.Ayrıca, her iki yöntemin dinamik aralığı ve hassasiyeti, logaritmik ölçekte çizildiğinde daha iyi şekilde örneklendirilmektedir. EISA yanıtının eğimi ile xap analizlerinden gelen yanıtlar arasındaki belirgin fark görülebilmekte ve bu durum, EL iza'nın hem daha yüksek hem de daha düşük konsantrasyonlarda TNF alpha tespiti için daha sınırlı bir kapasiteye sahip olduğunu daha net bir şekilde göstermektedir. İki fonksiyonel TNF alpha xap analizi için tespit sınırları veya LOD, arka plan seviyesinden daha yüksek bir yanıt düzeyinin gözlemlendiği en düşük TNF alpha konsantrasyonunun, altı tekrardan elde edilen standart sapmasının (SD) üç katı eklenerek yaklaşık olarak belirlenmiştir.Burada, R&amp;D Systems çifti kullanıldığında, 3,91 pg/mL'lik en düşük TNF alfa konsantrasyonunun, arka plan artı üç standart sapma kriterini karşılayan 66 MFI'lık bir yanıt oluşturduğu gözlemlenebilir. Millipore deteksiyon antikoru R&amp;D Systems yakalama antikoru ile birlikte kullanıldığında ise tespit limiti 7,81 pg/mL'den daha düşükle çıkmıştır.Bu durumda, kabul edilebilir yanıt olarak üretilen ikinci en düşük TNF alpha konsantrasyonunun 17 MFI'lık değeri, en düşük TNF alpha konsantrasyonunun yanıtı ile bu yanıtın standart sapmasının üç katı toplamından daha büyüktür. Benzer şekilde, r and d systems duo set Eliza için tespit sınırı 63 ile 31 picograms per milliliter arasında olduğu tahmin edilmiştir. Bu prosedürü takiben, xap analizini daha fazla optimize etmek amacıyla test etme, çeşitli örnek matrisleri veya raporlayıcıdaki antikor konsantrasyonları gibi diğer adımlar gerçekleştirilebilir.

conversion-capture-elisa-to-luminex-xmap-assay-using-multiplex

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Luminex Corporation Xmap mikroküre teknolojisini kullanarak, çeşitli laboratuvar hayvanı türlerinin serosurveillance için Multiplexed Florometrik immunoassay (MFIA) geliştirdik. MFIA antijeni, doku kontrolü veya immünglobulin kovalent renk kodlu polistiren mikroküreler bağlantılı bir süspansiyon mikroarray olduğunu. MFIA test yöntemi hem de çeşitli giderme konularını ele almaktadır.

Multiplexed Florometrik immunoassay Test Metodolojisi ve Sorun Giderme

Video, çapraz reaktivite içermeyen çoğullanmış sandviç immünolojik testler için çıtçıtlı çip teknolojisinin uygulanmasını göstermektedir. Her biri farklı reaktifler içeren iki mikrodizi slaytını koparmanın basit eylemi, çapraz kontaminasyon olmadan reaktif transferini sağlar ve sandviç immünolojik test kullanılarak birden fazla proteinin tespit edilmesine yardımcı olur.

Çapraz Reaktivitesiz Çoklanmış Sandviç İmmünoassay için Bir Snap Chip Teknolojisi

Bu video, farklı kümelere boyanmış karboksilatlı manyetik polistiren mikroküreler kullanan çoğullanmış kantitatif bakteri tespitini göstermektedir. Prosedür, boncuk-bakteri komplekslerinin oluşumunu, manyetik ayırmayı ve akış tabanlı analizi kapsar ve aynı reaksiyon kuyusunda birden fazla bakterinin hassas ve aynı anda miktar tayinini sağlar.

Boya Etiketli Manyetik Mikroküreler Kullanılarak Çoklanmış Kantitatif Bakteri Tespiti

Karmaşık biyolojik örneklerde ölçüm biyolojik giderek karar verme klinik rehberlik. Biz aynı anda kalp miyozin bağlayıcı protein-C, kreatin kinaz MB ve miyokard infarktüsü ve sağlıklı kontrol grubu olan hastalarda serum örneklerinde kardiyak troponin I ölçmek için son derece hassas bir yöntem açıklanmaktadır.

Elektrokemiluminesan immunoassay Serum Kardiyak Miyozin Bağlayıcı Protein-C belirlenmesi için hassas ve özel miktar tayini yöntemi

Mevcut kıt kaynak ortamında, araştırmacıların çalışmaları daha ucuz, daha hızlı ve daha hassas bir şekilde yürütmelerine olanak tanıyan yeni teknolojiler ortaya çıkıyor. Burada, insanların aynı anda birden fazla çevresel patojene maruz kalmasını ölçmek için boncuk bazlı bir tükürük antikoru multipleks immünolojik testin geliştirilmesini açıklıyoruz.

Bir Tükürük Antikor Multiplex Immuoassay Gelişmekte Çevre Patojenler İnsan Pozlama&#39;yı Tedbir

Biz sadece iki slayt şaklatarak çoğaltılmış sandviç çapraz-reactivity ücretsiz uzun gerçekleştirmek için bir ek çip teknolojisi göstermek. Bir ek aparatı reaktifler Mikroarray Mikroarray güvenilir bir şekilde aktarmak için kullanılır. Ek çip olmadan Çapraz bulaşma farklı reaktifler colocalization gerektiren herhangi bir biyokimyasal reaksiyonlar için kullanılabilir.

Çip için çapraz-reactivity ücretsiz ve gözcü-Alerjik çoğaltılmış sandviç uzun snap

7 otoantikor testini bir araya getiren basit bir çoklanmış ECL testi modelliyoruz. Tahlil, çölyak hastalığı, otoimmün tiroid hastalığı ve otoimmün poliglandüler sendrom 1 dahil olmak üzere T1D ve diğer birçok otoimmün hastalığı aynı anda tarayabilir.

Yüksek Verimli Bir Elektrokemilüminesans 7-Plex Testi Aynı Anda Tip 1 Diyabet ve Çoklu Otoimmün Hastalıklar İçin Tarama

SARS-CoV-2 için nötralize IgG ve IgM antikorlarını aynı anda ölçebilen multipleks serolojik ve antikor nötralizasyon tahlillerinin geliştirilmesi için iki muhabirli okuma sağlayan boncuk bazlı çok katlı tahliller için bir akış analiz sistemi kullanılmıştır.

Çok Katlı Boncuk Tabanlı Akış Analiz Sistemi için Hızlı, Çok Katlı Çift Muhabir IgG ve IgM SARS-CoV-2 Nötralizasyon Tahlil

Tip 1 diyabet, çölyak hastalığı ve koronavirüs hastalığı 2019 için acil tarama ihtiyacı doğrultusunda, dört adacık otoantikorlarını, doku transglutaminaz otoantikorlarını ve şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2'nin reseptör bağlanma alanına karşı antikorları aynı anda tespit etmek için yüksek verimli bir 6-Plex elektrokemilüminesans testi geliştirdik.

Tip 1 Diyabet, Çölyak Hastalıkları ve COVID-19 için Yüksek Verimli Çok Katlı Tarama

Avrupa ve Kuzey Amerika'da Lyme borreliosis'e neden olan farklı Borrelia türlerinin çoklu antijenlerine karşı ortaya çıkan IgG ve IgM için serum örneklerini aynı anda değerlendiren boncuk bazlı bir multipleks immünolojik test geliştirmek için üç kanallı bir çift raportör floresan akış analiz sistemi kullanıldı.

Çoğullanmış Serolojik Testte Farklı Antikor Sınıflarının Eş Zamanlı Tespiti

Öğrenin, TNF Alfa sitokin tespiti için ELISA testini Luminex xMAP platformuna dönüştürme yöntemini. Çoklu antikor taraması ile hassasiyet ve dinamik aralığı artırarak maliyetleri düşürün.

Bir Multiplex Antikor Tarama Yöntemi kullanılarak bir Luminex xMAP Tahlil için bir Capture ELISA Dönüşüm

Daha fazla video keşfet