CD4 İzolasyon Miltenyi MACS Arıtma Fare lenf düğümleri + T hücreleri

Bu bir Max MIDI mıknatıstır. Üzerinde, dikkat aşırı güçlü manyetik alanlar yazmaktadır. Merhaba, ben Kaliforniya Üniversitesi Irvine Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü'ndeki Mike Collins laboratuvarından Melanie Matthew.

Bugün size Milton Biotechnology kitlerini kullanarak CD4 pozitif T hücrelerinin negatif seçilim hazırlamasını göstereceğiz. Burada Minimax ve MiniMax mıknatısları mevcut; Minimax daha büyük ayırmalar için kullanılır. Minimax'e uyan bir kolondan 10⁹ hücreye kadar geçirebilirsiniz; MiniMax ise çok daha küçük hücre hacimleri için kullanılır.

Bu nedenle, pozitif veya negatif ayrıştırma yapıp yapmadığınıza bağlı olarak, hücrelerinizi uygun antikorla işaretleyeceksiniz. Bu antikorların üzerinde, mıknatısa tutunacak manyetik boncuklar bulunur. Negatif seçim durumunda, ilgilendiğiniz hücreler kolondan geçip gidecek ve hedef hücrelerinizi içeren elüatı toplayabileceksiniz.

Bu gece size gösterdiğim tekniklerin steril olmadığını belirtmeliyim. Bu nedenle, bu hücreleri hücre kültürü için kullanmak isterseniz, her şeyi steril aletlerle doku kültürü kabininde yapmalısınız. CD4 pozitif T hücreleri için bir hazırlama işlemi gösteriyor olsam da, bu tekniklerin çoğu Miltenyi Biyoteknoloji kitleri kullanılarak diğer hücre tiplerinin saflaştırılmasında da uygulanabilir.

Tamam, fareden lenf düğümlerini çıkardım; bunu nasıl yapacağınızı JoVE'nin yedi numaralı sayısındaki iki foton görüntüleme için lenf düğümü hazırlama bölümünde ayrıntılı olarak gösteriyorum. Şimdi lenf düğümlerini 70 mikronluk bir hücre süzgecinin içinde tek hücre süspansiyonu haline getirmek için ezeceğim. Tamam, şimdi lenf düğümlerini 6 mL'lik bir şırınganın arkasını kullanarak tek hücre süspansiyonu haline getireceğim.

Lenf düğümleri bir filtre içerisinde RPMI içindedir ve uygun bir tek hücre süspansiyonu oluşturmak önemlidir. Bunu bir filtre içinde yapmamızın nedeni, herhangi bir hücre kümelenmesi olmadığından emin olmak istememizdir. Öğütme işlemini tamamladığımda, filtreyi ortamdan çıkaracağım ve ardından süzgeçten geçen tüm hücreleri ve tek hücre süspansiyonunu kullanacağım.

Ezme işlemi sırasında, tüm dokuyu mümkün olduğunca fazla parçaladığınızdan emin olmalısınız. CD4 pozitif T hücrelerini saflaştıracağımız materyal bu tek hücre süspansiyonudur. Tamam, dokuyu ezme işlemini tamamladım ve lenf nodlarının çoğunun neredeyse tamamen yok olduğunu görebilirsiniz.

Hala burada, altı lenf düğümünün tamamından birbirine yapışmış küçük yağ parçaları, bir miktar bağ dokusu ve lenf düğümünün dış çeperi benzeri yapılar mevcut. Şimdi hücre süzgecini çıkarıyorum. Burada medyumun oldukça bulanık olduğunu görebilirsiniz.

Filtreden maksimum sayıda hücre elde etmeyi sağlamak ve bazı hücrelerin filtreye yapışacağını göz önünde bulundurmak için, tek hücre süspansiyonuyla tamamen doldurulur. Birkaç ml besiyeri ile yıkıyorum ve ardından tüm besiyerini 15 ml'lik Falcon tüpüne pipetleyip, sonraki saflaştırma aşaması için hücreleri çöktürmek üzere santrifüj ediyorum. İşte 300 G'de 10 dakika boyunca santrifüj edilip çöktürülmüş tek hücre süspansiyonum.

Tek hücre süspansiyonunuzda yüksek oranda ölü hücre olacağını düşünüyorsanız, Miltenyi'nin ölü hücre uzaklaştırma kitini kullanmak iyi bir fikirdir. Şimdi, hücreleri pellet haline getirdiğime göre, besiyerini dökeceğim ve eritrosit lizizi gerçekleştireceğim; ardından hücreleri sayıp bu özel hücreler üzerinde bir CD4 pozitif T hücresi negatif seleksiyon kiti uygulayacağım. Tamam, şimdi bir RBC lizizi yapacağım.

Önce su ekleyip ardından 10 X-D-B-P-S ekleyerek çözeltiyi tekrar 1 X çözelti haline getirip ozmolariteyi düşürerek, lenfositlerle birlikte çöktürdüğümüz kırmızı kan hücrelerini lize edeceğiz. Lenfositlerimiz ozmolarite değişimine kırmızı kan hücrelerinden daha dirençlidir, ancak yine de hızlı çalışmamız gerekir; aksi takdirde istemediğimiz bir durum olan lenfositlerin lizesi gerçekleşebilir. Hızlı çalışmanın bir parçası olarak, sisteme su eklemeden önce liz için ihtiyaç duyacağım hacimleri önceden hazırlarım.

Lenfositlerimi lizlemediğimden emin olmak ve sadece eritrositlerin lizini sağlamak için, suyu ekledikten birkaç saniye sonra 10 X-D-B-P-S eklemek istiyorum. Bu nedenle, 900 µL su (yaklaşık 1 mL) ve 100 µL 10 X-D-B-P-S alıyorum.

Her iki pipeti de hazır hale getirdim. Lizis sırasında önce suyu ekliyorum, birkaç saniye bekleyip tüpü biraz çalkalıyorum ve ardından 10 X-D-B-P-S ekleyip tüpü biraz daha çalkalıyorum. Eğer lizis yaptığınız çok sayıda alyuvar varsa, kırılan tüm hücre membranlarından oluşan büyük, amorf bir kütlenin meydana geldiğini göreceksiniz.

Burada biraz örneğimiz var ve bunların kısmen parçalanmış hücre membranları olduğunu görebilirsiniz. Lizis işlemini gerçekleştirdikten sonra, pipetleme sırasında herhangi bir hata yapılmış olma ihtimaline karşı, osmolaritenin doğru olduğundan emin olmak ve lizisin daha fazla ilerlemesini önlemek için hücrelere birkaç mL besiyeri eklemeyi tercih ediyorum. Tamam, şu an lenfositlerim tek hücre süspansiyonu halindedir.

Tekrar, eritrosit lizini gerçekleştirdim ve şimdi hücreleri santrifüj ederek çökelteceğim. Bunu yapmadan önce, CD4 pozitif T hücresi negatif seçme kiti için ne kadar antikor eklememiz gerektiğini belirlemek amacıyla hemositometrede sayım yapacağım. Tamam, şimdi hücreleri MAX tamponu içinde santrifüj ediyorum ve RBC lizini yaptıktan sonra peletin çok daha beyaz olduğunu görebilirsiniz.

Şimdi CD4 pozitif T hücreleri için negatif seleksiyon yapacağım. Bu nedenle, hücreleri çöktürdüğüm tüm besiyerini ve tüm Max buffer'ı dökeceğim. Ardından, CD4 pozitif T hücrelerinin negatif seleksiyonundaki birinci adım olan biotin antikor kokteyli ile işaretleme yapacağım.

Ardından, buzdolabında 10 dakika boyunca inkübe ediyorum. Tamam, hücrelerimin ilk inkübasyon süreci tamamlandı. Şimdi, antibiyotik yüklü mikroboncukları ekleyeceğim ve onları tekrar 15 dakika boyunca buzdolabına koyacağım.

Bu özel hücre ayrıştırma işlemi için Miltenyi Biotec marka bir LS kolon kullanıyoruz; kolonun manyetik tutucuya yerleştirilmesi ve içinden 3 mL MAC tamponu geçirilerek hazırlanması işlemini gerçekleştireceğiz. Kolonu açıp tırnakları mıknatısa bakacak şekilde yerleştiriyoruz. Şimdi kolona MAC tamponu ekleyeceğim; tamponun LS kolonu boyunca ilerlediğini ve alttan damlamaya başladığını göreceksiniz. Kolonun kurumasıyla ilgili endişelenmeyin.

Sıvının yüzey gerilimi, hücrelerinizi ekleyene kadar kurumasını önleyecektir. Hücrelerinizi eklemeden önce, max tamponun kolon boyunca tamamen süzülmesine izin vermeniz önemlidir. Tamam, biotin manyetik boncuklar, hücreler ve max tampon ile yaptığım 15 dakikalık inkübasyonun ardından, tamponu dökeceğim ve hücreleri hücre sayımıza uygun bir tampon miktarı içinde yeniden süspanse edeceğim.

Bu nedenle, bunun için mini protokolünüzü kontrol etmeniz gerekecek. Ardından bunları, az önce max tamponu ile duruladığımız kolona uygulayacağım. Şimdi hücre süspansiyonunu kolona ekleyeceğiz.

Bu bir negatif seleksiyon kolonu olduğu için, kolondan geçen hücreleri toplayacağız ve bu durumda bunların tamamının CD4 pozitif T hücreleri olması gerekir. Şimdi kolonu 12 ml Max buffer ile yıkayacağım ve yine, sadece CD4 pozitif T hücrelerini içermesi gereken elüatı toplayacağım. Şimdi CD4 pozitif T hücrelerini santrifüjle çöktüreceğim, yeniden süspanse edeceğim ve ardından tau görüntüleme için kullanacağım uygun boya ile işaretleyeceğim.

Ayrıca, saflaştırdığım hücrelerden küçük bir örnek alacağım ve bunları anti CD3 ve anti CD4 ile işaretleyip, CD4 pozitif T hücrelerinden oluşan temiz bir popülasyona sahip olduğumdan emin olmak için FACS üzerinde analiz edeceğim. İşte az önce santrifüj ettiğimiz hücrelerin görünümü. Bunların saf CD3, CD4 pozitif T hücresi popülasyonu olması gerekir.

Böylece, CD4 pozitif T hücreleri için negatif seçimi size göstermiş oldum. Miltenyi Biotec kiti kullanarak, bu hücreleri bir fareye adaptif olarak transfer edeceğiz ve bunları kendi T-hücresi reseptörü (TCR) ve makine deneylerimizden biri için kullanacağız. Kendi deneylerinizde başarılar dilerim.