Name: Içinde Synaptic florasan Otomatik Sayısallaştırma C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Öğrenin, C. elegans'ta sinaptik florasan proteinlerin üç boyutlu otomatik sayısallaştırma yöntemini. Bu teknik, tek bir örnekte yüzlerce sinapsin hızlı karakterizasyonunu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar protokolünün gelişimi ile yardımcı A. Benham teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma BAB NIH hibe NS06747 tarafından finanse edildi

1. Görüntüleme için Worms hazırlanması Bu protokolün segmenti yayınlanan C. dayanmaktadır elegans kültür teknikleri 1,2 ve Şekil 1&#39;de belirtilmiştir. <ol><li> NA22 E. ile yüksek pepton NGM agar (10 cm) numaralı seribaşı üzerine solucanlar büyür coli bakterisinin neredeyse açlıktan kadar. Immun Eğer, bir tabak güvenilir yol boyunca hesap kayıpları dikkate alındığında, ve görüntüleme için worm (Part 2) seçmek için kullanılan katı kriterleri, leke 1 kişi için yeterli solucanlar üretecek. </li><li> Tabağa GKD 2 0 birkaç ml dökerek Hasat solucanlar, kısaca dönen ve 15 ml konik tüp (tekrar tüpe solucanlar en aktarmak gerekirse) içine sıvı dökme. 3 dakika, 1000x g klinik santrifüj Pelet. Süpernatant kalan bakteriler kaldırmak için netleşene kadar GKD 2 O ile 1-3x pelet yıkayın. Solucanlar cam sopa gibi, süpernatantlar kaldırmak için polipropilen transferi pipet kullanın(Bu adım itibaren yumurta canlılık kayıpları önlemek için adımlar arasındaki zaman en aza indirmek için önemlidir). </li><li> Son yıkamadan sonra, Pastör pipetiyle solucan pelet 5 ml alkalin hipoklorit solüsyonu içinde solucanlar ve serbest yumurta lyse için. Hafifçe sallayın ve bir kere dakikada bir mikroskop altında tüpleri inceleyin. Solucanların yaklaşık% 50 (bunlar eğildi ve açık kırık görünecektir) parçalanır zaman, Yumurta Tampon, tersini birkaç kez üst tüp dolum ve 3 dakika, 1000x g pelet tarafından parçalama feshedebilir. Lizis süresi 5 dk geçmemelidir. </li><li> Transferi pipetle süpernatantı ve Yumurta Tampon ile pelet 3x yıkayın. </li><li> Enkaz yumurta ayırmak için, GKD 2 O% 30 sakaroz bir yastık onları yüzer: adım 1.4 den son yıkamadan sonra, dikkatle 5 ml GKD 2 0 süpernatan ve Pastör pipetiyle pelet çıkarın. GKD 2 O 5 ml steril% 60 sakkaroz ekleyin ve iyice karıştırın. Klinik santrifüj 6 dk, 1000x g Spin. Yumurta (bunlar ha olacak menisküs de toplayacak) bulutlu bir görünüm ettik, enkaz pelet olacak iken. </li><li> Plastik bir transferi pipet kullanarak, minimal hacim yumurta emmek ve dereceye giremeyen NGM agar transfer. Tüp yan yapışan yumurta hafifçe aşağı durulanır ve de transfer edilebilir. Bir adet 10 cm analiz zorlanma başına plaka yeterli dereceye giremeyen. </li><li> 20 gece boyunca yumurta (~ 16 saat) ° C ile dereceye giremeyen inkübe edin Birkaç saat için biraz kapalı kapağı bırakarak kurutun ilk birkaç saat için plaka havalandırın, ama bir gecede kapsayacak emin olun. </li><li> Yumurtadan çıktıktan sonra, S Bazal bir 15 ml konik boru (tüp içine dökün, birkaç mL S plaka Bazal, girdap eklemek) için L1 larva transferi. Klinik S Bazal minimum hacmi tekrar süspansiyon santrifüj (3 dk, 1000x g) ve NA22 bakteri ile tohumlanan 10 cm NGM agar için transfer Pelet. Adım 1.1 &#39;den her orijinal plaka için buraya 2 tabak kullanın. Solucanlar istenilen yaşına kadar inkübe edin. </li><li> Bir veya iki kez günlük kültürleri izler. Tehlike o isenizf açlıktan, taze NA22 plakaları transfer. Vahşi tip N2 solucanlar için, açlıktan hayvanları uzak gıda tükenmiş bölgeleri kitleler halinde göç gibi plaka üzerinde hareket ettiği solucanlar bir çizgi veya dalga oluşumu önce gelmelidir. Bu formları sonra, gıda tamamen birkaç saat içinde seyreltilmiş edilecektir. </li><li> Worms şimdi immun veya canlı görüntüleme için hazırdır. Sağlam solucanlar, çok sayıda kolaylıkla görüntülenebilir çünkü Tespit ve süspansiyon solucanlar boyama en uygunudur. Solucanlar sayıda görüntüleme için gerekli olduğundan ve Finney Ruvkun protokolüne göre 3-6 boyanması prosedürler dondurma-çatlama prosedürler için tercih edilir. </li></ol> 2. Konfokal Görüntüleme <ol><li> Konfokal görüntüleme için kızaklar üzerinde solucan takın. Mikrolitre başına birkaç yüz solucanların yoğunluğunu ayarlayın. % 2 agaroz bir ped olun S-bazal (cut-off 25 iğne takılmış 3 ml şırınga ile uygulanan) görüntüleme sırasında buharlaşmayı önlemek için vazelin ince bir halka ile çevrili. Bir Pipetibir kapak kayma üzerine solucan süspansiyon birkaç mikrolitre (görüntüleme canlı solucanlar eğer anestezi kullanırlar) ve kapağı kayma üzerine agaroz pedi düşürmek, yüzey üzerinde eşit solucanlar yayılıyor. </li><li> Görüntüleme için solucanlar seçin. ± 45 ° (0 ° doğrudan hedefi yönelmiş demektir burada) daha ilgi sinapsların daha fazla radyal deplasman, objektif lens yönelmiştir solucanlar seçin. Photobleaching önlemek için (birkaç saniye) hızlı bir şekilde bu değerlendirme gerçekleştirin. İlk kültürlerin ölçekli yeterli solucanlar bu geometrik kriterleri tatmin edecek sağlamak için optimize edilmiştir. </li><li> Numunenin konfokal görüntüleme tamamlayın. 0.4 yaklaşık 14 mikron kalınlığında kesitler kapsamına girenler olabilir nispeten düz örnekleri iyi sonuçlar üretebilir. Yüksek hızlı, düşük çözünürlüklü görüntü (512 x 512 piksel) hızlı doğru veri toplanması için yeterlidir. Bu floresans hesaplanmasına yol olarak, doyurarak aşırı sinyal gücü ile dedektör kaçınınsinyalleri. </li></ol> 3. Bireysel Synaptic Kümelerin Otomatik Tanımlama ve Analiz <ol><li> Açık çoklu TIF çıkış Volocity 4.0 (veya üstü) yazılım (Perkin Elmer) kullanarak konfokal mikroskop dosyaları. </li><li> Bitki uzakta faiz yapısı içermeyen görüntünün alanlarını (Image -&gt; Genişletilmiş Odak -&gt; Actions - - &#39;Freehand ROI&#39; aracını kullanarak ilgi&gt; Alan seç Seçimi&gt; Kırp; Şekil 2A). Not Genişletilmiş Odak analizinizi yardım için bilgisayar ekranında bir z-düzlemi projeksiyon üreten, ancak temel veri etkilemez; aynı gerekirse) parlaklık ve kontrast ayarlamaları için de geçerlidir. </li><li> Line Tool kullanılarak analiz alanının uzunluğunu ölçün. Hat uzunluğu hesaplanır ve veri tablosu (Şekil 2B) eklenecektir. </li><li> Filtresi (Ölçümler modu) &#39;Yoğunluk tarafından Nesneler&#39; kullanarak nesneleri tanımlayın. Sinaptik kümeler olduğu gibi, bir eşiğin belirtinvurgulanmış ve non-sinaptik arka plan (Şekil 2C) değildir. Başka bir renk etiketli bağımsız bir sinaptik marker İçerme sinapsların açıkça belirlemek yardımcı olabilir. Tipik sinapsların bir kaç birkaç yüz voksellerden arasında değişir. Bir kontrol örneği ile bir kez eşik ayarlayın ve sonraki tüm örnekler için kullanabilirsiniz. Bu deneyci çelişki potansiyelini tanıttı çünkü her bir örnek eşikleme ayrı ayrı kabul edilemez. Objeler seçilir ve (Şekil 2B) otomatik olarak tablo haline getirilmiştir. </li><li> Düzenlemek ve İhracat verileri. Bu genellikle arka lekeler olduğundan, 2 veya daha az voksellerden nesneleri ortadan kaldırın. Bunlar, başka filtrelenmesi, bir sonraki analiz elimine edilebilir. &#39;Nesne boyutu&#39; ile bunların kaldırılmasına aşağı, yeniden sıralama veri dosyası kolaylaştırmak için böylece tüm grup birlikte olacak. Microsoft Excel veya diğer elektronik tablo programı açılabilir CSV formatında veri verir. Her resim bir çıktı dosyası oluşturur. </li><li> Eğer Volocity yumuşakeşya kullanılamaz, alternatif yöntemler 3 boyutlu bilgi kaybı olmasına rağmen (Tartışma bakın), (örneğin ref. 7 veya ImageJ kullanarak manuel analizi) faydalanilabilir konfokal veri Z-düzlem projeksiyonlar analiz etmektir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Sunulan kantifikasyon metodu farklı parlaklık ve farklı birimlerin küme nüfusu ayırt edebilmelidir. Şekil 3 &#39;de temsili görüntü ve karşılık gelen sayısal verilerin bu parametreleri esas alınarak farklılaşma örnekleri gösterirler. Genel bir kural olarak sonuçlar göze bellidir ne uygun olmalıdır. C sinirin ventral kord İmmünoboyama UNC-49 GABA reseptörünün durumda elegans, tüm hayvanlar genellikle büyüklük ve olgunluk çok benzeri çıktı ve beş solucanlar bir grup (analiz sinir kordon boyunu normalize) için toplam sinaptik floresan değerleri standart hata gösterdi<html> ortalama 4 yaklaşık% 10 arasında değerlere. Genetik mutasyon ve diğer deneysel tedaviler (örn. ilaca maruz kalma) hacim ve yoğunluk değerleri ve sinaptik kümelerin frekans dağılımları sadece değiştirebilir, ama belki, zaman seyri ve solucanların senkronize gelişimsel değişkenliğinin yüksek yol. Ancak nicel sonuçlar her zaman hata oluştu ve yeniden eşikleme veya artefactual nesnelerin kaldırılması gibi düzeltici eylem önermek nerede açığa çıkarmalıdır Volocity tarafından belirlenen görüntüleri ve nesneleri denetim, görsel ve değilse takdir ne yansıtmalıdır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig1.jpg" /> Şekil 1.. Senkron C. hazırlanması elegans kültürler. Senkron kültürleri bu prosedür elde çünkü C. elegans gelişimi tutuklamalar ve gıda yokluğunda L1 larva ve besin geldiğinde devam eder. <html> ove_content &quot;&gt; <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig2.jpg" /> Şekil 2. Sinaptik punktumlarda kantitasyonu. <ol class="ualpha"><li> Görüntünün gereksiz bölgeleri dosya boyutlarını azaltmak ve özgünlüğü artırmak için kırpılır. Sol panelde görüntü başlangıç ​​gösterir, orta panel seçilmiş bölgeyi gösterir, sağ panel kırpma sonra görüntü gösterir. Kırmızı sinyal UNC-49 GABA reseptör immünfloresan olduğunu, yeşil sinyal presinaptik GABA nöronlar 4 olarak ifade synaptobrevin-GFP (presinaptik belirteci) olduğunu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2alarge.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . </li><li> A hattı analiz edilecek sinir kord parçasının uzunluğu çekilir, ve uzunluğu otomatik sonuçlar Tablo kaydedilir. Bu bilgiler, solucanlar boyama sırasında parçalanır halinde birkaç misli değişebilir analiz sinir kordun uzunluğu, nedeniyle sinaptik verileri normalize için gereklidir.www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2blarge.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük rakamı görmek için buraya tıklayın. </li><li> A tek tek eşik sinaptik kümeler tanımlamak için uygulanır. Sol paneli eşik önce görüntü gösterir; farklı eşik seviyesi örnekleri ayrı paneller (yeşil sinyal atlanmıştır) &#39;de gösterilmiştir. Her tespit nesne renkli bir bölge olarak görüntü üzerinde tasvir edilmiştir. En soldaki panelinde görsel belirgin sinaptik kümeleri ve en sağ paneldeki renkli bölgeler arasındaki yazışmalar unutmayın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2clarge.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . </li><li> Her tanımlanan nesnesi sonuçlar tablo ayrıca listelenmiştir. Bireysel nesneler seçilebilir ve istenirse muayene için görüntü üzerinde vurgulanır. Bu tablo kırmızı (&#39;rodamin&#39;) ve yeşil (&#39;EGFP&#39;) kanallar için bilgi içerir; nesneleri olduklarından yeşil kanal bilgileri potansiyel yanıltıcıkesinlikle kırmızı floresan göre belirledi. Bu analizi de tek renkli görüntüler üzerinden yapılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2dlarge.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . </li></ol><img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig3.jpg" /> Şekil 3. Temsilcisi sonuçları. Temsilcisi mikrograflarından wild-tip C&#39;den önce UNC-49 GABA reseptörleri için boyandı elegans (A) ve muscimol, uzun pozlama sonra downregüle olmak reseptörleri neden olan bir GABA reseptör agonisti olan (B) tedavi sonrası. Paneller önce (solda) ve (sağda) eşikleme ve küçük arka lekeleri çıkarıldıktan sonra kırpılmış görüntüleri gösterir. (C) gösterilen örnekler için kantitatif sinaptik parametrelerin Arsalar (A) ve (B): toplam floresans sinir kablosu uzunluğu (solda) ve kümülatif olasılık histogramları bireysel sinaps floresans içerik (orta) ve sinaps hacmi (righ normalizet), agonist pozlama (muscimol tedavi için işlenmemiş, n = 115 sinaps n = 60 sinapsların ile indüklenen sinaptik içerik ve hacim olarak istatistiksel olarak anlamlı bir azalma göstererek; p &lt;0.001, Kolmogorov-Smirnov testi <a href="http://www.physics.csbsju.edu/stats/KS-test.html" target="_blank">http://www.physics.csbsju .edu / stats / KS-test.html</a> ).

<ol><li>Christensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33, 503-514 (2002).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li>
<li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122, 2517-2527 (1996).</li>
<li>Davis, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+lysosomal+trafficking+as+a+mechanism+for+regulating+GABAA+receptor+abundance+at+synapses+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).</li>
<li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li>
<li>Rowland, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+terminals+independently+regulate+synaptic+clustering+and+autophagy+of+GABAA+receptors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).</li>
<li>Burbea, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+and+AP180+regulate+the+abundance+of+GLR-1+glutamate+receptors+at+postsynaptic+elements+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans.</a> Neuron. 35, 107-120 (2002).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+plasticity+regulated+by+the+insulin-like+signaling+pathway+underlies+salt+chemotaxis+learning+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).</li>
<li>Sankaranarayanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li>
<li>McDonald, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+functional+characterization+of+fluorescent%2C+N-terminally+tagged+CB1+receptor+chimeras+for+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging.</a> Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).</li>
<li>Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+neuropeptide+release+induced+by+octopamine+without+Ca2%2B+entry+into+the+nerve+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan yöntemi C. sinapsların büyük popülasyonlar için kantitatif çok parametre veri ayıklamak için tasarlanmıştır elegans, tedavi grupları içindeki tutarlılığı en üst düzeye çıkarırken. Üç özellikleri bu hedeflere katkıda. İlk olarak, immun tüm hayvanlar aynı yaşta olması için senkron solucan nüfus yapılmaktadır. Ifade seviyelerinin gelişim düzenlemesi deneysel tedavinin etkisi gizleyen bu adım kritiktir (örn. UNC-49 GABA reseptörü immünfloresans içinde birkaç kat geliştirilmesi değişir (K. Da...

<table border="1"><tbody><tr><td> Yazılım Adı </td><td> Şirket </td><td></td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Volocity v4.0 ya da daha yüksek </td><td> Perkin Elmer / Improvision </td><td></td><td> Bu yazılım erişim için yerel görüntüleme çekirdek tesis edin. Demo yazılımı Perkin Elmer web sitesinde mevcuttur. Bu yöntem, yalnızca Volocity kantitasyonu modülü gerektirir. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 2. Özel reaktifleri ve ekipmanları. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Yumurta tampon </td><td> NaCl KCl CaCI2 MgCl2 HEPES (7.3 pH ayarlama) </td> &lt;td&gt; 118 mM 48 mM 2 mM 2 mM 24 mM </td></tr><tr><td> Alkalin Hipoklorit (5 ml) </td><td> Taze çamaşır suyu (30 gün açıldıktan sonra şişe atmak) 10 N NaOH GKD 2 O </td><td> 1.0 ml 0.25 ml 3,75 ml </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 1. Çözümler. </td></tr></tbody></table>

içinde synaptic florasan otomatik sayısallaştırma<em&gt; c. elegans</em

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse gücü presinaptik nörotransmitter serbest olaylara postsinaptik yanıtların genlik ifade eder, ve genel nöral devre fonksiyonu üzerinde büyük etkisi vardır. Synapse gücü kritik postsinaptik membran üzerinde sinaptik da kümelenmiş ve nörotransmitter reseptörlerinin bolluk bağlıdır. Reseptör düzeyleri gelişimsel olarak kurulan ve sinaptik plastisite ve nöromodülasyon önemli mekanizmalarını temsil eden yüzey lokalize, subsynaptic ve hücre içi havuzları arasında reseptör kaçakçılığı tarafından değiştirilebilir. Synaptically-lokalize nörotransmitter reseptör bolluk ölçmek için titiz bir yöntem geliştirme ve sinaptik plastisite çalışmak esastır. Olmayan-sinaptik havuzlarından sinaptik ayırt ve sinaps farklı lokalize reseptör popülasyonlar arasında ayrım, mekansal bilgi korur, çünkü floresan mikroskobu optimum bir yaklaşımdır. Genetik model organizma Caenorhabditis Eleganlar, özellikle de sağlıklı hayvan yerli sinapsların muayene izin, küçük boyutu ve göreceli kendi sinir sisteminin basitliği, şeffaflığı, ve güçlü genetik tekniklerin durumu nedeniyle bu çalışmalar için uygundur. Burada C. floresan etiketli sinaptik nörotransmitter reseptörleri hesaplamak için bir yöntem sunmak elegans. Onun temel özelliği çoklu düzlem konfokal mikroskop çıktı dosyaları, tablolama konumu, hacmi, floresan ve her sinaps için toplam floresan üç boyutlu bireysel sinapsların otomatik tanımlama ve analiz olduğunu. Bu yaklaşım konfokal veri z-düzlemi projeksiyonlar manuel analizi üzerinde iki temel avantajı vardır. Konfokal veri seti her düzlemde yer alması nedeniyle Birincisi, hiçbir veri genellikle piksel yoğunluğu ortalamaları ya da maxima dayalı, z-düzlemi projeksiyon yoluyla kaybolur. Sinapsların İkincisi, otomatik tanımlama, ama ex kontrol edilebilirsinaps, çok sayıda veri doğru ve hızlı ekstraksiyon izin veri analizi ilerledikçe perimenter,. Örnek başına sinaps binlerce yüzlerce kolayca büyük veri üreten istatistiksel gücü maksimize etmek için ayarlar, elde edilebilir. C. hazırlarken dikkat edilmesi gereken noktalar analiz ve tedavi grupları içinde hayvanlar arasındaki değişkenliği en aza indirmek için konfokal görüntüleme gerçekleştirmek için elegans da tartışılır. C. analiz etmek için geliştirilmiş olsa da elegans postsinaptik reseptörler, bu yöntem gerçekten synaptically-lokalize protein, ya, ayrık kümeler, punktumlarda veya organeller yerleştiğini herhangi bir floresans sinyalinin herhangi bir türü için genellikle yararlıdır. Prosedür üç aşamada gerçekleştirilir: 1) örnekleri, 2 hazırlanması) konfokal görüntüleme, ve 3) görüntü analizi. Basamak 1 ve 2 C. özgü elegans, 3. adımı genellikle odaklı mikrograflar herhangi punktat floresan sinyal için geçerli iken.

Kavşaklarda bulunan kümelenmiş nörotransmitter reseptörlerinin bolluğu güçlü sinaptik gücü etkiler. Bu yöntem tek-sinaps çözünürlükte üç boyutlu olarak floresan etiketli nörotransmitter reseptörleri quantifies<em&gt; C. elegans</em&gt;, Sinaps yüzlerce hızla z-düzlemi projeksiyon tarafından tanıtılan bozulmaları olmadan tek bir örnek içinde karakterize izin vererek.

Içinde Synaptic florasan Otomatik Sayısallaştırma<em&gt; C. elegans</em

Sinaps gücü, presinaptik nörotransmitter salınım olaylarına verilen postsinaptik yanıtların genliğini ifade eder ve genel ... üzerinde büyük bir etkiye sahiptir.

Bu prosedürün amacı, GAN'lardaki noktasal floresan sinyallerinin boyutlarını ve parlaklıklarını verimli bir şekilde nicelleştirmektir. Böylece geniş nesne popülasyonları analiz edilebilir. İstatistiki olarak sinaptik proteinlerin görüntülemesi yapılır.Bu gösterimde, prosedürün ilk adımı, ilgili ELEGANS'ın yüksek yoğunluklu senkronize kültürlerinin oluşturulmasıdır. Ardından, görüntülerdeki birebir değişkenliği en aza indirgeyecek şekilde etiketlenmiş sinapsların konfokal görüntüleri elde edilir. Sinaptik noktalamalar otomatik olarak tanımlanır ve arka plan floresansından ayırt edilir.Son adım, verimli bir alt analiz için verilerin tablo haline getirilmesi ve düzenlenmesidir. Nihayetinde sonuçlar, deneysel koşulların sinaptik proteinlerin dağılımını veya yüksek kontrastlı noktasal yapılara lokalize olan diğer herhangi bir proteinin dağılımını nasıl etkilediğini doğru bir şekilde gösterebilir. Bu tekniğin, Zack projeksiyonlarının analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, sinaps hacimleri de dahil olmak üzere tüm verilerin korunması ve otomatik tanımlamanın koşul başına yüzlerce örneğin hızla toplanmasına olanak tanımasıdır.Bu protokol, NA 22 E. coli bakterileri içeren 10 santimetre yüksekliğinde peptit NGM agar plaklarında büyütülmüş, yüksek yoğunlukta yetişkin C. elegans solucan kültürleri gerektirir; planlanan her immünolojik boyama için tam olarak bir plaka hazırlayın. Solucanları birkaç mililitre su ile hasat ederek işleme başlayın. Solucanları 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve solucanların çoğu toplanana kadar bu işlemi tekrarlayın.Solüsyon berraklaşana kadar solucanları çöktürün ve peleti üç kez suya kadar yıkayın. Bu işlem, kalıntı bakterileri uzaklaştırır; solucan veya yumurta içerebilen çözeltileri her zaman plastik pipetlerle aktarın çünkü bunlar cama yapışabilir. Yumurta canlılığının kaybını önlemek için kalan adımların hızla tamamlanması şu an kritik önem taşımaktadır.Solucan yumurtalarını, beş mililitre alkali hipoklorit çözeltisi içinde onları tekrar bükerek serbest bırakın. Tüpleri hafifçe sallayın ve yaklaşık her bir dakikada bir diseksiyon mikroskobu altında inceleyin. Beş dakika sonra veya bir tüpteki solucanların yaklaşık yarısı bükülmüş ve açılmış göründüğü anda işlemi tamamlayın.Tüpü ağzına kadar yumurta tamponuyla doldurun ve birkaç kez altüst edin. Canlı solucanlar çöktürüldükten sonra süpernatantı aspire ederek atın. Ardından çökeleği yumurta tamponuyla üç kez yıkayın.Yıkama işlemlerinden sonra, Reese peleti beş mililitre su içinde süspande eder, ardından beş mililitre steril %60'lık sükroz ekleyerek iyi karıştırır. Süspansiyon pelletlendikten sonra, yumurtalar menisküs seviyesinde olacak ve bulanık görünecektir.Her bir yumurta koleksiyonunu, ekim yapılmamış ayrı bir 10 santimetre NGM Agar plakasına aktarın. X'i plakaya durulamak için su kullanılabilir, ancak aktarılan sıvı miktarını minimumda tutmaya çalışın. Plakaları ilk birkaç saat boyunca 20 degrees Celsius sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Kapakları hafifçe aralık bırakarak plakaları havalandırın, ancak gece boyunca kapalı olduklarından emin olun.Kuluçka sonrası, L1 larvaları S basil ile doldurulmuş 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. L1 larvalarını çöktürün ve minimal hacimdeki S basil içinde yeniden süspansiyona getirin. Ardından, her bir L1 koleksiyonunu NA 22 bakterileri ile ekilmiş iki adet 10 santimetrelik NGM agar plağına paylaştırın.Kültürleri günde bir veya iki kez izleyin. Besin yetersizliği riski oluşursa, açlık başlamadan önce onları taze NA 22 plaklarına aktarın; zira tip N iki toplama hatları oluşur ve plaklardaki besinle tükenmiş bölgelerden bir dalga gibi birlikte uzaklaşırlar, besinler birkaç saat içinde tamamen tükenecektir.Solucanlar istenen yaşa ulaştıklarında, immunboyama veya canlı görüntüleme için montaj işlemine hazır hale gelirler. Konfokal görüntüleme için, yoğunluklarını mikrolitre başına birkaç yüz solucan olacak şekilde ayarlamak amacıyla Antifa montaj medyası kullanın.Deneyimle, bu yoğunluk süspansiyonun bulanıklığından anlaşılabilir. İdeal olarak, solucanlar mikroskop lamı üzerinde yoğun bir şekilde dizilmeli ancak aşırı derecede üst üste binmemelidir. Lam üzerinde, ince bir vazelin halkasıyla çevrelenmiş ESP bazlı %2'lik aros'tan oluşan bir alan hazırlayın.Görüntüleme sırasında buharlaşmayı önlemek için, ucu kesilmiş 25 gauge iğne takılı üç mililitrelik bir şırınga aracılığıyla Vazelin uygulayın. Şimdi, solucanların parçalanmasını önlemek için ucu kesilmiş bir pipet ucu kullanarak solucan süspansiyonundan birkaç mikrolitreye lamelle kapatma camı üzerine pipetleyin ve agaroz pedi lamelle kapatma camının üzerine indirerek, mikroskop altında solucanları ped üzerine eşit şekilde yayın. İlgilenilen sinapslar, yalnızca doğrudan merceğe doğru veya merceğin 45 derece açısı içerisinde olacak şekilde yönlendirilmelidir.Foto-beyazlamayı önlemek için burada birkaç saniye bekleyin. Kültür ve koşullar, burada ventral kordonun doğrudan objektif lensine doğru yöneldiği ideal bir oryantasyon olarak gösterilen bu katı kriteri karşılayacak yeterli sayıda solucan sağlamalıdır. Bir sonraki solucan, ventral kordonu objektif lensinin tam tersi yönünde olduğu için reddedilmelidir.Bu örneğimde, lense doğru yönelmiş olan dorsal kordun daha keskin odaklanmış bir görüntü oluşturduğuna dikkat edin. İşte dorsal ve ventral kordların solucanın kenarlarında konumlandığı için reddedilecek olan bir başka örnek. Bu durumda uyarılma ve emisyon ışığının daha fazla solucan dokusundan geçmesi gerekecek ve görüntü bozulacaktır.Temel zorluk, tedavi grupları içindeki değişkenliği en aza indirmektir; yaş senkronizasyonu yapmak ve ilgilenilen yapının doğrudan objektif merceğe dönük olduğu solucanları seçmek bu konuda oldukça yardımcı olabilir. Büyük kültürlerle başlamak, maksimum tutarlılık için seçebileceğiniz solucan sayısını artırır. En iyi görüntüleme sonuçları için, 14 veya daha az sayıda görüntüden oluşan bir yığınla kapsanabilecek nispeten düz örnekler seçin.0,4 mikron kalınlığında kesitler. Hızlı ve doğru veri toplama işlemi için yüksek hızlı, düşük çözünürlüklü görüntüler yeterlidir. Floresan sinyallerinin olduğundan düşük tahmin edilmesine neden olacağı için dedektörü aşırı sinyal güçleriyle doyurmaktan kaçının.Bu demonstrasyonda, en az 4.0 sürümü olması gereken, ticari olarak mevcut olan velocity yazılım paketi kullanılmaktadır. Birçok alternatif yazılım seçeneği üç boyutlu bilgileri kaybetmektedir. Konfokal mikroskoptan alınan multi tiff çıktı dosyalarını açtıktan sonra sırasıyla image, extended focus ve freehand seçeneklerini belirleyin.ROI şimdi görüntünün ilgilenilen yapıyı içermeyen alanlarını kırpın. Aktif olan araç kullanılarak, genişletilmiş odaklama, ROI seçimini kolaylaştırmak için bir Z düzlemi projeksiyonu sağlar. Bu işlem temel verileri etkilemez.Benzer şekilde, parlaklık ve kontrast ayarları temel verileri etkilemez. "Actions" (İşlemler) sekmesini seçip "Crop to Selection" (Seçime Göre Kırp) seçeneğine tıklayarak kırpma işlemini tamamlayın. Ardından, analiz edilen alanın uzunluğunu ölçün.Çizgi aracı kullanılarak, çizginin uzunluğu hesaplanacak ve veri tablosuna eklenecektir. Şimdi, ölçüm modunda yoğunluğa göre nesne filtresini kullanarak nesneleri tanımlayın. Benzersiz bir renkle işaretlenmiş bağımsız bir sinaptik markörün eklenmesi, sinapsların kesin olarak tanımlanmasına yardımcı olabilir; sinaptik kümelerin vurgulandığı ve sinaptik olmayan arka planın vurgulanmadığı bir eşik değeri belirleyin.Bunu sadece bir kontrol örneği kullanarak bir kez yapın ve sonraki tüm örnekler için bu işlemi uygulayın; her örneğin eşik değerinin ayrı ayrı belirlenmesi, deneyci yanlılığı potansiyeli oluşturduğu için kabul edilemez. Nesneler otomatik olarak seçilir ve tablolaştırılır. Tipik sinapslar, birkaç vokselden birkaç yüz voksele kadar değişir; verileri dışa aktarmadan önce, verileri nesne boyutuna göre sıralayın.Bu işlem, genellikle sadece arka plan lekeleri olan iki veya daha az vokselden oluşan nesnelerin daha sonra kaldırılmasını kolaylaştırır. Şimdi, herhangi bir hesap çizelgesi programıyla açılabilecek olan verileri CSV formatında dışa aktarın. Her görüntü, tanımlanan protokolle 49 GABA reseptörünün üretildiğini gösteren CL gans ventral sinir kordonu mikrograflarını sıralamak ve dışa aktarmak için bir çıktı dosyası üretir.Tüm hayvanlar boyut ve olgunluk açısından birbirine çok benzer görünüyordu. Beş solucanın toplam sinaptik floresans değerleri, analiz edilen sinir kordonunun uzunluğuna göre normalize edildi. Bu veriler, ortalamanın yaklaşık %10'u kadar standart hata değerleri gösterdi.Soldaki görüntü, eşikleme ve arka plan leke giderme işlemi uygulanmamış ham görüntüdür. Sinapslar, uzun süreli maruziyet sonrası reseptörlerin aşağı regüle olmasına neden olan bir GABA reseptör agonisti olan mus carmal ile işlenmiştir. Toplam floresans miktarı belirlenmiş ve sinir kordonu uzunluğu kümülatif olasılığına göre normalize edilmiştir.Bireysel sinaps floresan içeriğinin histogramları hesaplanmıştır. Aynı işlem sinaps hacmi için de yapılmıştır. Bu ölçümler, agonist maruziyetinin sinaptik içeriği ve hacmi önemli ölçüde azalttığını göstermektedir.Genel olarak, kantitatif sonuçlar her zaman görsel olarak takdir edilebilenleri yansıtmalıdır. Aksi takdirde, görüntülerin incelenmesi ve hızla tanımlanan nesneler, hatanın nerede oluştuğunu ortaya çıkarmalı ve prosedür uygulanırken eşikleme veya artefaktların temizlenmesi gibi düzeltici önlemler önermelidir. Görüntüleme için solucanların, görüntü kalitesinin subjektif bir değerlendirmesinden ziyade geometrik yönelimlerine göre seçilmesi kritiktir; mümkün olduğunca kör değerlendirme yapılması şiddetle tavsiye edilir.

automated-quantification-of-synaptic-fluorescence-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol, ayrışmış nöronal kültür ve immünsitokimya kullanarak beyin bölümlerinde de sinaps sayısını ölçmek için nasıl ayrıntıları. Kompartman-spesifik antikorların kullanarak, presinaptik terminalleri yanı sıra postsinaptik uzmanlık siteleri etiket. Biz bu belirteçler tarafından oluşturulan sinyaller arasındaki sinaps ko noktaları olarak tanımlar.

Sinapslar miktarının: Synapse Numarası ölçmek için bir İmmünositokimya tabanlı Testi

Bu video, kalsiyum görüntülemenin arkasındaki kavramları tanıtır ve kalıplanmış agaroz kuyularında bulunan solucanların hızlandırılmış görüntülemesi için örnek bir protokol içerir.

Kalsiyum Görüntüleme: Canlı C. elegans'ta Nöral Aktiviteyi Görselleştirmek İçin Bir Yöntem

Kaynak: Pigazzini, M. L., et. al. Yaşlanmada Amiloid Yapıların Karakterizasyonu C. elegans{{}}. J. Vis. Uzm.  (2020). Bu video, C. elegans nöronlarında poliQ protein agregasyonunu değerlendirmek için floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobunun (FLIM) kullanımını göstermektedir, kontrol ve şaperon protein eksikliği olan solucanları karşılaştırır. Şaperon eksikliği olan solucanlarda artan agregasyon, kümelenmiş floroforlar arasında enerji transferini teşvik ederek floresan ömrünü azaltır. FLIM...

Caenorhabditis elegans Nöronlarında PolyQ Protein Agregasyonunun Floresan Ömür Boyu Görüntülenmesi

Burada sayı ve Drosophila melanogaster fotoreseptör sinaptik aktif bölgelerin mekansal dağılımını ölçmek için nasıl göstermek, genetik olarak kodlanmış moleküler işaretleyici ile vurgulanır ve ışığa uzun süreli maruz kalma sonrasında kendi modülasyonu.

Synaptic Modülasyon Analizi<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Uzun süreli ışığa maruz kaldıktan sonra Fotoreseptörler

Burada, bir çerçeve geniş menzilli diyet kısıtlaması gen ekspresyonu ve ömrü ile ilgili mevcut. Biz iletişim kuralları bu paradigma altında gen ekspresyonu kantitatif görüntüleme ve geniş menzilli diyet kısıtlaması için açıklar. Daha fazla bilgi işleme özellikleri genetik devrelerin temel gıda algılamalı içinde söz konusu ortaya çıkarmak için hesaplama analizleri anahat.

C. elegans gen ifade seviyeleri sırasında ömrü modülasyon altında geniş menzilli diyet kısıtlama tarafından kodlanmış bilginin bir miktar

Bu çalışmada, sinaptik boyut ve lokalizasyon, kas Morfoloji ve marochondrial şekil nicel ölçümler serbestçe kullanılabilir görüntü işleme araçları kullanarak C. elegans özetliyor. Bu yaklaşım, C. elegans 'da gelecekteki çalışmaların, genetik mutasyonların bir sonucu olarak doku ve organel yapısal değişikliklerin kapsamını nicel olarak karşılaştırmasına olanak sağlar.

Caenorhabditis elegans hücresel yapıları ve organelle morfoloji eğitim için nicel yaklaşımlar

Tekrarla ilişkili olmayan ATG bağımlı çeviri ürünleri, tekrarlayan genişleme tabanlı hastalıkların patojenik özellikleridir. Açıklanan protokolün amacı, c. elegansmodel sisteminde davranışsal ve hücresel tahliller kullanarak bu peptidlerin neden olduğu toksisiteyi değerlendirmektir.

C. elegans RAN Peptid Toksisitesi Ölçme

Bu protokol, C. elegans hücreleri tarafından membrana bağlı ekophers şeklinde üretilen büyük agrega ve/veya organel ekstrüzyonların (~4 μm) tespiti ve niceliği için yaklaşımları açıklamaktadır. Bu enkaz kovma mekanizmasının diseksiyonunu kolaylaştırmak için gerekli suşları, büyüme koşullarını, puanlama kriterlerini, zamanlamayı ve mikroskopi hususlarını tanımlıyoruz.

C. elegans'ta Büyük Ekofher Veziküllerde İnvivo Nöronal Agrega ve Organel Ekstrüzyon Puanlama da Kantitatif Yaklaşımlar

Aşağıdaki protokol, proteostazdaki değişikliklerin bir değerlendirmesi olarak poliglutamin agregalarını ölçmek için solucan kültürleme, floresan görüntüleme ve otomatik görüntü işleme için yüksek verimli bir iş akışının geliştirilmesini ve optimizasyonunu açıklamaktadır.

Caenorhabditis elegans'ta Agrega Niceliğinin Otomatikleştirilmesi

Makale, canlı bir nematoda tek nöron çözünürlüğünde endojen etiketli kargoların aksonal taşınmasını görselleştirmek için floresan mikroskobu edinim parametrelerinin optimizasyonunu açıklamaktadır.

Canlı Caenorhabditis elegans'ta Floresan Mikroskobu ile Endojen Yükün Aksonal Taşınmasının Görüntülenmesinin Optimize Edilmesi

Burada, geniş alan mikroskobu görüntülerinde tek tek solucanların otomatik segmentasyonu için geliştirdiğimiz bir derin öğrenme sistemi olan SegElegans'ın daha sonra ImageJ gibi görüntü analiz yazılımlarında kullanılmak üzere etkin bir şekilde kullanılmasına ilişkin talimatlar sunuyoruz. Sistemi hem çevrimiçi hem de çevrimdışı kullanmanın yollarını sunuyoruz.

SegElegans Kullanarak C. elegans Floresan Görüntülerinin Otomatik Analizi

Öğrenin, C. elegans'ta sinaptik florasan proteinlerin üç boyutlu otomatik sayısallaştırma yöntemini. Bu teknik, tek bir örnekte yüzlerce sinapsin hızlı karakterizasyonunu sağlar.

Içinde Synaptic florasan Otomatik Sayısallaştırma

Daha fazla video keşfet