Içinde Synaptic florasan Otomatik Sayısallaştırma C. elegans

Bu prosedürün amacı, GAN'lardaki noktasal floresan sinyallerinin boyutlarını ve parlaklıklarını verimli bir şekilde nicelleştirmektir. Böylece geniş nesne popülasyonları analiz edilebilir. İstatistiki olarak sinaptik proteinlerin görüntülemesi yapılır.

Bu gösterimde, prosedürün ilk adımı, ilgili ELEGANS'ın yüksek yoğunluklu senkronize kültürlerinin oluşturulmasıdır. Ardından, görüntülerdeki birebir değişkenliği en aza indirgeyecek şekilde etiketlenmiş sinapsların konfokal görüntüleri elde edilir. Sinaptik noktalamalar otomatik olarak tanımlanır ve arka plan floresansından ayırt edilir.

Son adım, verimli bir alt analiz için verilerin tablo haline getirilmesi ve düzenlenmesidir. Nihayetinde sonuçlar, deneysel koşulların sinaptik proteinlerin dağılımını veya yüksek kontrastlı noktasal yapılara lokalize olan diğer herhangi bir proteinin dağılımını nasıl etkilediğini doğru bir şekilde gösterebilir. Bu tekniğin, Zack projeksiyonlarının analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, sinaps hacimleri de dahil olmak üzere tüm verilerin korunması ve otomatik tanımlamanın koşul başına yüzlerce örneğin hızla toplanmasına olanak tanımasıdır.

Bu protokol, NA 22 E. coli bakterileri içeren 10 santimetre yüksekliğinde peptit NGM agar plaklarında büyütülmüş, yüksek yoğunlukta yetişkin C. elegans solucan kültürleri gerektirir; planlanan her immünolojik boyama için tam olarak bir plaka hazırlayın. Solucanları birkaç mililitre su ile hasat ederek işleme başlayın. Solucanları 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve solucanların çoğu toplanana kadar bu işlemi tekrarlayın.

Solüsyon berraklaşana kadar solucanları çöktürün ve peleti üç kez suya kadar yıkayın. Bu işlem, kalıntı bakterileri uzaklaştırır; solucan veya yumurta içerebilen çözeltileri her zaman plastik pipetlerle aktarın çünkü bunlar cama yapışabilir. Yumurta canlılığının kaybını önlemek için kalan adımların hızla tamamlanması şu an kritik önem taşımaktadır.

Solucan yumurtalarını, beş mililitre alkali hipoklorit çözeltisi içinde onları tekrar bükerek serbest bırakın. Tüpleri hafifçe sallayın ve yaklaşık her bir dakikada bir diseksiyon mikroskobu altında inceleyin. Beş dakika sonra veya bir tüpteki solucanların yaklaşık yarısı bükülmüş ve açılmış göründüğü anda işlemi tamamlayın.

Tüpü ağzına kadar yumurta tamponuyla doldurun ve birkaç kez altüst edin. Canlı solucanlar çöktürüldükten sonra süpernatantı aspire ederek atın. Ardından çökeleği yumurta tamponuyla üç kez yıkayın.

Yıkama işlemlerinden sonra, Reese peleti beş mililitre su içinde süspande eder, ardından beş mililitre steril %60'lık sükroz ekleyerek iyi karıştırır. Süspansiyon pelletlendikten sonra, yumurtalar menisküs seviyesinde olacak ve bulanık görünecektir.

Her bir yumurta koleksiyonunu, ekim yapılmamış ayrı bir 10 santimetre NGM Agar plakasına aktarın. X'i plakaya durulamak için su kullanılabilir, ancak aktarılan sıvı miktarını minimumda tutmaya çalışın. Plakaları ilk birkaç saat boyunca 20 degrees Celsius sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Kapakları hafifçe aralık bırakarak plakaları havalandırın, ancak gece boyunca kapalı olduklarından emin olun.

Kuluçka sonrası, L1 larvaları S basil ile doldurulmuş 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. L1 larvalarını çöktürün ve minimal hacimdeki S basil içinde yeniden süspansiyona getirin. Ardından, her bir L1 koleksiyonunu NA 22 bakterileri ile ekilmiş iki adet 10 santimetrelik NGM agar plağına paylaştırın.

Kültürleri günde bir veya iki kez izleyin. Besin yetersizliği riski oluşursa, açlık başlamadan önce onları taze NA 22 plaklarına aktarın; zira tip N iki toplama hatları oluşur ve plaklardaki besinle tükenmiş bölgelerden bir dalga gibi birlikte uzaklaşırlar, besinler birkaç saat içinde tamamen tükenecektir.

Solucanlar istenen yaşa ulaştıklarında, immunboyama veya canlı görüntüleme için montaj işlemine hazır hale gelirler. Konfokal görüntüleme için, yoğunluklarını mikrolitre başına birkaç yüz solucan olacak şekilde ayarlamak amacıyla Antifa montaj medyası kullanın.

Deneyimle, bu yoğunluk süspansiyonun bulanıklığından anlaşılabilir. İdeal olarak, solucanlar mikroskop lamı üzerinde yoğun bir şekilde dizilmeli ancak aşırı derecede üst üste binmemelidir. Lam üzerinde, ince bir vazelin halkasıyla çevrelenmiş ESP bazlı %2'lik aros'tan oluşan bir alan hazırlayın.

Görüntüleme sırasında buharlaşmayı önlemek için, ucu kesilmiş 25 gauge iğne takılı üç mililitrelik bir şırınga aracılığıyla Vazelin uygulayın. Şimdi, solucanların parçalanmasını önlemek için ucu kesilmiş bir pipet ucu kullanarak solucan süspansiyonundan birkaç mikrolitreye lamelle kapatma camı üzerine pipetleyin ve agaroz pedi lamelle kapatma camının üzerine indirerek, mikroskop altında solucanları ped üzerine eşit şekilde yayın. İlgilenilen sinapslar, yalnızca doğrudan merceğe doğru veya merceğin 45 derece açısı içerisinde olacak şekilde yönlendirilmelidir.

Foto-beyazlamayı önlemek için burada birkaç saniye bekleyin. Kültür ve koşullar, burada ventral kordonun doğrudan objektif lensine doğru yöneldiği ideal bir oryantasyon olarak gösterilen bu katı kriteri karşılayacak yeterli sayıda solucan sağlamalıdır. Bir sonraki solucan, ventral kordonu objektif lensinin tam tersi yönünde olduğu için reddedilmelidir.

Bu örneğimde, lense doğru yönelmiş olan dorsal kordun daha keskin odaklanmış bir görüntü oluşturduğuna dikkat edin. İşte dorsal ve ventral kordların solucanın kenarlarında konumlandığı için reddedilecek olan bir başka örnek. Bu durumda uyarılma ve emisyon ışığının daha fazla solucan dokusundan geçmesi gerekecek ve görüntü bozulacaktır.

Temel zorluk, tedavi grupları içindeki değişkenliği en aza indirmektir; yaş senkronizasyonu yapmak ve ilgilenilen yapının doğrudan objektif merceğe dönük olduğu solucanları seçmek bu konuda oldukça yardımcı olabilir. Büyük kültürlerle başlamak, maksimum tutarlılık için seçebileceğiniz solucan sayısını artırır. En iyi görüntüleme sonuçları için, 14 veya daha az sayıda görüntüden oluşan bir yığınla kapsanabilecek nispeten düz örnekler seçin.

0,4 mikron kalınlığında kesitler. Hızlı ve doğru veri toplama işlemi için yüksek hızlı, düşük çözünürlüklü görüntüler yeterlidir. Floresan sinyallerinin olduğundan düşük tahmin edilmesine neden olacağı için dedektörü aşırı sinyal güçleriyle doyurmaktan kaçının.

Bu demonstrasyonda, en az 4.0 sürümü olması gereken, ticari olarak mevcut olan velocity yazılım paketi kullanılmaktadır. Birçok alternatif yazılım seçeneği üç boyutlu bilgileri kaybetmektedir. Konfokal mikroskoptan alınan multi tiff çıktı dosyalarını açtıktan sonra sırasıyla image, extended focus ve freehand seçeneklerini belirleyin.

ROI şimdi görüntünün ilgilenilen yapıyı içermeyen alanlarını kırpın. Aktif olan araç kullanılarak, genişletilmiş odaklama, ROI seçimini kolaylaştırmak için bir Z düzlemi projeksiyonu sağlar. Bu işlem temel verileri etkilemez.

Benzer şekilde, parlaklık ve kontrast ayarları temel verileri etkilemez. "Actions" (İşlemler) sekmesini seçip "Crop to Selection" (Seçime Göre Kırp) seçeneğine tıklayarak kırpma işlemini tamamlayın. Ardından, analiz edilen alanın uzunluğunu ölçün.

Çizgi aracı kullanılarak, çizginin uzunluğu hesaplanacak ve veri tablosuna eklenecektir. Şimdi, ölçüm modunda yoğunluğa göre nesne filtresini kullanarak nesneleri tanımlayın. Benzersiz bir renkle işaretlenmiş bağımsız bir sinaptik markörün eklenmesi, sinapsların kesin olarak tanımlanmasına yardımcı olabilir; sinaptik kümelerin vurgulandığı ve sinaptik olmayan arka planın vurgulanmadığı bir eşik değeri belirleyin.

Bunu sadece bir kontrol örneği kullanarak bir kez yapın ve sonraki tüm örnekler için bu işlemi uygulayın; her örneğin eşik değerinin ayrı ayrı belirlenmesi, deneyci yanlılığı potansiyeli oluşturduğu için kabul edilemez. Nesneler otomatik olarak seçilir ve tablolaştırılır. Tipik sinapslar, birkaç vokselden birkaç yüz voksele kadar değişir; verileri dışa aktarmadan önce, verileri nesne boyutuna göre sıralayın.

Bu işlem, genellikle sadece arka plan lekeleri olan iki veya daha az vokselden oluşan nesnelerin daha sonra kaldırılmasını kolaylaştırır. Şimdi, herhangi bir hesap çizelgesi programıyla açılabilecek olan verileri CSV formatında dışa aktarın. Her görüntü, tanımlanan protokolle 49 GABA reseptörünün üretildiğini gösteren CL gans ventral sinir kordonu mikrograflarını sıralamak ve dışa aktarmak için bir çıktı dosyası üretir.

Tüm hayvanlar boyut ve olgunluk açısından birbirine çok benzer görünüyordu. Beş solucanın toplam sinaptik floresans değerleri, analiz edilen sinir kordonunun uzunluğuna göre normalize edildi. Bu veriler, ortalamanın yaklaşık %10'u kadar standart hata değerleri gösterdi.

Soldaki görüntü, eşikleme ve arka plan leke giderme işlemi uygulanmamış ham görüntüdür. Sinapslar, uzun süreli maruziyet sonrası reseptörlerin aşağı regüle olmasına neden olan bir GABA reseptör agonisti olan mus carmal ile işlenmiştir. Toplam floresans miktarı belirlenmiş ve sinir kordonu uzunluğu kümülatif olasılığına göre normalize edilmiştir.

Bireysel sinaps floresan içeriğinin histogramları hesaplanmıştır. Aynı işlem sinaps hacmi için de yapılmıştır. Bu ölçümler, agonist maruziyetinin sinaptik içeriği ve hacmi önemli ölçüde azalttığını göstermektedir.

Genel olarak, kantitatif sonuçlar her zaman görsel olarak takdir edilebilenleri yansıtmalıdır. Aksi takdirde, görüntülerin incelenmesi ve hızla tanımlanan nesneler, hatanın nerede oluştuğunu ortaya çıkarmalı ve prosedür uygulanırken eşikleme veya artefaktların temizlenmesi gibi düzeltici önlemler önermelidir. Görüntüleme için solucanların, görüntü kalitesinin subjektif bir değerlendirmesinden ziyade geometrik yönelimlerine göre seçilmesi kritiktir; mümkün olduğunca kör değerlendirme yapılması şiddetle tavsiye edilir.