Farelerde Makrofajlar tükenmesi ve Sulandırma

Aşağıdaki deneyin amacı, polarize makrofajların in vivo biyolojik bir süreçteki rolünü belirlemektir. Bu, ilk önce farelerden makrofajların tükenmesiyle elde edilir. Daha sonra, benzersiz özellikleri ifade eden ve farklı işlevlere sahip yeni makrofajlar üretilir.

Daha sonra polarize makrofajlar, ilgilenilen biyolojik süreçteki rollerini belirlemek için farelere evlat edinilerek aktarılır. Sonuç olarak, klinik ve histolojik hastalığa dayalı makrofaj aracılı inflamasyondaki farklılıklar ölçülebilir. Bu tekniğin, fareleri bir CD 11 BDTR arka planına geçmek gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu yöntemin üreyen farelerden daha hızlı olmasıdır.

Deneyler için. Nispeten kolay ve uygun maliyetlidir ve herhangi bir genetik geçmişe sahip farelerle gerçekleştirilebilir. Bu yöntem bağırsaktaki makrofajların rolü hakkında fikir verebilse de, karaciğer, dalak ve akciğer dahil olmak üzere çeşitli diğer organlara da uygulanabilir.

Enjeksiyondan iki saat önce, lipozom ve PBS tüplerini dört santigrat derece depodan çıkarın. Lipozomlar oda sıcaklığına ulaştığında, eşit bir dağılım sağlamak için tüpleri sekiz ila 10 kez ters çevirin. Daha sonra 200 mikrolitre ılık ila lipozom süspansiyonunu bir mililitrelik bir şırıngaya yükleyin ve 26 gauge bir iğne takın.

Şırıngayı her iki elinizin avuç içi arasında yuvarlayın ve enjeksiyondan önce lipozom çözeltisini eşit olarak dağıtmak için altı kez ters çevirin. Şimdi bir elinizi tırmalamak için kullanın, kulakların hemen altında bir fare, başını ve uzuvlarını hareketsiz hale getirecek kadar deri tutun ve ardından fareyi başı hafifçe yere doğru olacak şekilde eğin. Ardından şırıngayı 30 ila 40 derecelik bir açıyla tutun.

İğneyi karnın sağ alt çeyreğine yerleştirin ve 200 mikrolitre lipozom çözeltisi enjekte edin. Sekiz ila 12 haftalık bir fareye ötenazi uyguladıktan ve uzuvları gergin bir pozisyonda tutturduktan sonra, diseksiyon işlemi sırasında mümkün olduğunca fazla kas keserek femurları ve tibiasları çıkarın. Ardından% 10 FCS ile IMDM ile beş mililitrelik bir şırınga yükleyin.

26 gauge bir iğne takın ve iliği kemiklerden yıkayın. Kemik iliği aspiratlarını 40 mililitre IMDM'de FCS ile seyreltin ve ardından hücreleri 75 santimetre karelik bir Doku kültürü şişesine aktarın. Kültürü dört saat sonra 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Supinatı 50 mililitrelik konik bir tüpte toplayın ve yapışmayan progenitörleri 300 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüjleyin. Saydıktan sonra, geri kazanılan hücreleri, taze 75 santimetre karelik şişelerde tam ortamda mililitre başına 0.5 kez 10 ila altı hücre konsantrasyonunda kültürleyin. Dördüncü günde, yapışmayan hücreleri döndürün ve taze ortamdaki şişelere geri koyun.

Yedinci günde, yapışmayan hücreleri atın ve bunları taze ortamla değiştirin. 10. günde, medyayı atın. Daha sonra şişeye beş mililitre hücre ayrışma tamponu ekleyin.

Beş dakika sonra, şişenin kenarına bir elin avucunun topuğuyla birkaç kez sıkıca vurun. Şişenin dibinden kalktıklarından emin olmak için hücreleri mikroskop altında inceleyin. Daha sonra yeniden süspanse edilmiş hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe pipetleyin.

Şişeyi ilave 10 mililitre IMDM artı FCS ile yıkayın ve ardından hücreleri 300 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca döndürün. Saydıktan sonra, geri kazanılan hücreleri, steril PBS'de mililitre başına 10 ila yedi hücre konsantrasyonunda yeniden süspanse edin, makrofaj fenotipi değerlendirmeleri için altı makrofaja bir kez 10 kez ayırarak, yeni hazırlanmış makrofaj süspansiyonunda 100 mikrolitre ile doldurulmuş bir mililitrelik şırıngayı 26 gauge iğne ile donatarak başlayın. Sonraki ısıtıcı fare, kuyruk damarını genişletmek için beş ila 10 dakika boyunca bir ısı lambası kullanıyor.

Fareyi bir kısıtlama cihazına aktardıktan sonra, kuyruğu damar yukarı bakacak şekilde 90 derece döndürün. Enjeksiyon bölgesini alkollü bir çubukla temizleyin ve ardından iğneyi eğimli tarafı yukarı bakacak şekilde tutun. Ve hafif bir açıyla, iğneyi damara neredeyse paralel olarak yerleştirin.

İğne düzgün bir şekilde yerleştirilirse, herhangi bir direnç hissedilmemeli ve enjeksiyondan sonra damar belirginleşmelidir, enjeksiyonu takiben kanama durana kadar enjeksiyon bölgesine hafif bir baskı uygulayın. Bir fare kolonunun bu immünohistokimyasal bölümleri, lipozom içeren klonorların intraperitoneal enjeksiyonunun, DSS'nin neden olduğu kolit sırasında F dört 80 pozitif makrofajda bir azalmaya yol açtığını göstermektedir, çünkü kontrol PBS enjekte edilen farelere kıyasla kahverengide F dört 80 boyamadaki azalma ile kanıtlanmıştır. arginaz bir pozitif. Alternatif olarak, kahverengi renkte aktive edilmiş makrofajlar da klonanat lipozom enjeksiyonları kullanılarak başarılı bir şekilde tüketilir.

Bu ve önceki şekildeki mavi leke, çubuk grafik F, dört, 80 pozitif, MCSF'den türetilmiş makrofajlar ve arginaz bir pozitifin kantitatif değerlendirmesini gösterdiğinden, çekirdekleri temsil eder. Alternatif olarak, aktive edilmiş MCSF'den türetilmiş artı IL dört tedavi edilmiş makrofaj, klonronat lipozomlarının intraperitoneal enjeksiyonlarını alan farelerde her iki popülasyonun da önemli ölçüde tükendiğini gösterir. Bu veriler, lipopolisakkaritin aşağı akış metaboliti nitritini tespit ederek nitrik oksit seviyelerini ölçen tipik bir gres tahlilinin sonuçlarını göstermektedir.

Bu nedenle, klasik olarak aktive edilmiş MCSF'den türetilmiş makrofajlar, alternatif olarak aktive edilmiş MCSF'den türetilmiş artı IL ile tedavi edilmiş dört makrofajlara kıyasla önemli ölçüde daha yüksek nitrit seviyeleri üretir. Klasik olarak aktive edilmiş makrofajlar, alternatif olarak aktive edilmiş bir fenotip ile tutarlı olarak ELA ile ölçüldüğü gibi, alternatif olarak aktive edilmiş makrofajlara kıyasla daha yüksek bir IL 12 P 70 ila IL 10 oranı üretir. IL ile tedavi edilen MCSF'den türetilmiş makrofajlar, batı immün diş ipi ile tespit edildiği gibi, dördü yapısal olarak YM'yi ve arginaz birini eksprese eder.

Burada, polarize kemik iliği kaynaklı makrofajlar enjekte edilen farelerden histolojik kesitlerde sayılan klasik olarak aktive edilmiş M1 makrofajlarının toplam sayısı ve alternatif olarak aktive edilmiş M iki makrofajın sayısı gösterilmiştir. C veri çubuğu, makrofajlar olmadan PBS enjeksiyonu alan kontrol farelerini gösterir. DSS'nin neden olduğu kolit sırasında polarize makrofajların transferinin kolon üzerindeki etkisi, kilo kaybı, rektal kanama ve azalmış dışkı kıvamına dayanan ek bir skor olan hastalık aktivite indeksi ile gösterilir.

M1 makrofajlarının inflamasyonu etkilemediğini, M iki makrofajın ise hastalık aktivite indeksini önemli ölçüde azalttığını unutmayın. Bu nedenle, bu sonuçlar, dex vivo türevli evlat edinilmiş olarak transfer edilen makrofajların kolona trafik yapabileceğini ve gelişiminden sonra indüklenen inflamasyonu etkileyebileceğini göstermektedir. Bu teknik, makrofaj biyolojisi üzerine çalışan araştırmacıların farelerde makrofaj polarizasyonunun rolünü keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, farelerde homeostazda ve hastalıkta polarize makrofajların rolünü nasıl belirleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.