Tek ve Çok hücreli Bağlamlarda Invadopodia aracılı Ekstrasellüler Matriks Proteoliz Kantitatif Ölçümü

Bu standart teknik, kantitatif istila podyumu matriks degradasyon deneyleri için uygun olan, floresan işaretli jelatinle kaplanmış lameller üretir. Lameller floresan işaretli jelatinle kaplandıktan sonra, hücreler ekilir ve matriks degradasyonu için kültüre edilir. Ardından, istila podyumu marker proteinleri için hücreler fikse edilir ve floresanla boyanır, görüntüler alınır ve matriks degradasyonu kantitasyonla belirlenir.

Tipik sonuçlar, seçili genlerin farklı şekilde manipüle edildiği veya farmakolojik ajanlarla işlem görmüş hücreler arasında, podia aracılı matriks degradasyonundaki farkları nicelleştirebilir. Homojen floresansa sahip jelatin kaplı lamellerin hazırlanması, floresan jelatinin düzensiz kaplanması veya jelatin kaplı lamellerin yanlış kullanımı nedeniyle zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Prosedürü, araştırma yardımcı profesörü Karen Martin, doktora sonrası araştırmacı Mandy Ammer ve lisansüstü öğrenciler Elise Walk, Karen Hayes ve Steve Markwellle birlikte gösterecektir.

Etiketlenmemiş %5 jelatin sukroz stok çözeltisini hazırlamak için, jelatin ve sukrozu PBS içinde birleştirin ve 37 °C'de tamamen çözünmasını sağlayın. Ardından 4 °C'de saklayın. Cam lamellerin temizleme işlemine geçin.

24 kuyucuklu plastik doku kültürü plağının her bir kuyucuğuna birer lamelle yerleştirin ve her kuyucuğa 500 µL %20 nitrik asit ekleyip 30 dakika inkübe edin. Nitrik asit çözeltisini uzaklaştırdıktan sonra, lamelleri deiyonize su ile üç kez yıkayın. Ardından kaplama işlemine geçin.

Her bir lamel üzerine 50 µg/mL konsantrasyonunda 500 µL polilizin ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Polilizin çözeltisini uzaklaştırın ve PBS ile üç kez yıkayın. Poli-L-lizin kaplama, üzerine eklenecek işaretli jelatinin eşit şekilde kaplanmasını ve bağlanmasını kolaylaştırır. 24 kuyucuklu plakaları buza yerleştirin ve her birine taze hazırlanmış 0,5% glutaraldehitten 500 µL ekleyin.

Plakaları 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Soğuk PBS ile üç kez yıkama yapın ve ardından jelatin kaplamadan önce tüm PBS kalıntılarını aspire edin. Bu sırada, glutaraldehit inkübasyonu sırasında Oregon Green 4 88 konjuge jelatini yeniden çözün.

Üreticinin protokolüne uygun olarak, bunu ve etiketlenmemiş %5 jelatin sakroz stok çözeltisini 37 °C'ye ısıtın. Ardından, 500 µL etiketli jelatini dört mililitre etiketlenmemiş jelatin ile seyreltin. Seyreltilmiş 4 88 jelatin karışımının 100 µL'sini her bir lamelin üzerine pipetleyin.

Manuel yayma işlemi yapmadan lameli kaplayacak kadar jelatin kullanın. Erken katılaşmayı önlemek için kaplama işlemi sırasında seyreltilmiş 4 88 jelatin karışımını 37 °C'de tutmak önemlidir. Ayrıca, potansiyel fotobezmeyi önlemek için bu adımdan itibaren lamelleri mümkün olduğunca karanlıkta tutun.

Tüm lamel kapçıkları tek bir plakada kaplandıktan sonra, plağı eğik tutun ve her bir kuyucuktaki fazla jelatini vakumlu aspirasyonla uzaklaştırın. Ardından, kaplanmış lamel kapçıklarını oda sıcaklığında, karanlıkta 10 dakika boyunca inkübe edin. Lamel kapçıklarını üç kez PBS ile yıkadıktan sonra 500 µL sodyum borohidrür ekleyin.

Hidrür efervesan özelliktedir ve her bir lamın üzerinde ve çevresinde küçük kabarcıklar belirginleşecektir; kalıntı glutaraldehidi indirgemek ve inaktive etmek için oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Sodyum borohidrür çözeltisini, her bir kuyucuğun dış çevresinde hızlı bir süpürme hareketiyle vakumlu aspirasyon kullanarak uzaklaştırın. Sodyum borohidrür işlemi sırasında doku kültürü plağının tabanından ayrılmış olabilecek yüzen lamları çekmemeye dikkat edin. Üç kez PBS ile yıkadıktan sonra, lamları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %70 etanol içerisinde inkübe edin.

Steril teknik kullanarak, plakları içeren lamel taşıyıcısını tip iki A B hücre kültürü laminar akışlı kabinine aktarın ve lamelleri steril bir iğne ve pens yardımıyla steril PBS ile üç kez durulayın. Lamelleri dikkatlice yeni bir 24 kuyucuklu plakanın boş bir kuyucuğuna aktarın ve lamelleri, kullanılacak spesifik hücre tipi için hazırlanan kültür ortamı ile dengeleyin.

Uygun inkübasyon süresinin ardından hücreleri doğrudan lamellerin üzerine ekleyin. Numuneleri monte etmek için immünofloresan görüntüleme işlemlerini gerçekleştirin. Bir mikroskop lamı üzerine bir damla prolonged gold anti-fade veya benzeri bir reaktif damlatın ve ters çevrilmiş lameli dikkatlice yerleştirerek analiz için görüntüleri alın.

Bu analiz, hücrelerin alanına veya hücre sayısına oranla matriks dejenerasyonunun normalize edilmiş alanını sağlar. birden fazla hücrenin bulunduğu ve collectively irna büyüme faktörleri veya terapötik ajanlarla tedavi edildiği tüm mikroskobik görüş alanlarının analiz edilmesi için faydalıdır. Bu analiz için, hücre popülasyonları hakkında verimli bilgi toplamak için yeterli olan düşük büyütmede toplanan görüntüler kullanılır.

Görüntüyü ImageJ programında açın. Ölçek bilgilerini kontrol edin ve ölçümleri seçin. Alanı ve eşik sınırlama seçeneklerini belirleyin. Arka plan eşiğini çıkararak jelatin boyunca meydana gelen düzensiz aydınlatmayı düzeltin ve üst ile alt piksel yoğunluk değerlerini ayarlayarak, floresan jelatin görüntüsünü kullanarak bozunma alanını hesaplayın.

Sonraki görüntülerde, degradasyon alanını seçmek için objektif bir yöntem olarak, eşik penceresindeki "set" düğmesini kullanarak tüm görüntüler için aynı eşiği belirleyin. Matriks degradasyonu olan bölgelerdeki eşik değerini ölçmek için "analyze particles" fonksiyonunu kullanın.

Seçimdeki gürültüyü gidermek için sıfırdan büyük bir parçacık boyutu seçin. İlgi bölgelerini belirlemek için ana hatları gösterin. Ardından, çizim tüm dejenerasyon alanlarını spesifik olarak belirlediyse, ölçümleri görüntülemek için sonuçları görüntüle ve özetle seçeneklerini işaretleyin.

Eğer kalıntılar gibi başka nesneler seçildiyse, toplam alan ölçümünü bir hesap çizelgesine kopyalayın ve yalnızca ilgili ilgi bölgelerinin alanlarını kaydedin. Ardından hücre alanını hesaplamak için, sonraki görüntülerde hücre kenarlarının seçilmesi amacıyla üst ve alt piksel yoğunluk değerlerini ayarlamak için görüntü eşiği (threshold) penceresini açın. Tüm görüntüler için aynı eşiği ayarlamak için eşik penceresindeki set düğmesini kullanın.

Hücre alanını seçmek için objektif bir yöntem olarak, hücre alanlarının eşik değerini ölçmek için partikülleri analiz etme (analyze particles) fonksiyonunu kullanın. Seçimdeki gürültüyü gidermek için sıfırdan büyük bir partikül boyutu seçin.

Analiz edilecek bölgeleri belirlemek için ana hatları gösterin, görüntüleme sonuçlarını kontrol edin ve alan ölçümlerini göstermek için özetleyin. Kontrol etmeyin. Hücreler ile bir küme arasında boşluklar varsa boşlukları dahil edin.

Şimdi seçin. Tamam, ilgili ilgi bölgeleri için alan sonuçlarını bir hesap tablosuna kopyalayın ve toplam hücre alanı başına jelatin degradasyon alanını hesaplayın. Alternatif bir yaklaşım, degradasyon alanını DAPI boyanmış çekirdeklerin sayılmasıyla belirlenen hücre sayısına göre normalize etmektir.

Manipülasyonlar ortalama hücre alanını değiştiriyorsa bu durum önem kazanır. Bu yaklaşım için çekirdekleri otomatik olarak saymak amacıyla nucleus counter eklentisini kullanın. Seçenekleri görüntülerinize göre optimize edin. Çekirdekler aşırı derecede üst üste biniyorsa, otomatik sayım bu durumda doğru bir sayım sağlamayabilir.

Doğru şekilde gerçekleştirildiğinde, hücre sayacı eklentisi kullanılarak manuel sayım kolaylaştırılabilir. Lamel camlar, Oregon Green 488 konjuge jelatin ile eşit şekilde kaplanır. Jelatin kaplı lamel camların kaplanması ve işlenmesi sırasında çeşitli artefaktlar oluşabilir.

Örneğin, düzensiz kaplama; yetersiz karıştırma, manuel yayma veya jelatin karışımının kısmi katılaşması nedeniyle kaplama işlemi sırasında lamelin uygun şekilde örtülmemesinden kaynaklanır. Kazınmalar, taşıma sırasında iğne veya penslerle çizilme sonucu kaplanmış matrisin uzaklaştığını gösterir. Uzun süreli saklama dönemlerinde lamel yüzeyinin kuruması, arnavut kaldırımı görünümüne yol açabilir. Bu alan, görüntüleme sırasında uzun süreli veya yüksek yoğunluklu ışık maruziyeti nedeniyle floresan jelatin yüzeyinin fotobeyazlamasını yansıtmaktadır.

İyi hazırlanmış bir lamеlin, mikroskopi ile incelendiğinde nasıl homojen floresans sergilediğine dikkat edin. Bu prosedür sırasında üretilen ince matrisler, hücrelerin ECM'yi degrade etme yeteneğini değerlendirmek için hassas bir yöntem sağlar. Örneğin.

Bu görüntüler, bir OSC 19 baş ve boyun kanseri hücresinin istila edilmiş podyum matriks degradasyon aktivitesini yakalamaktadır. Burada hücreler, Oregon Green 488 konjuge jelatin kaplı bir lam üzerine ekilmiş ve hem 2D hem de 3D görüntülerde gösterildiği üzere floresan mikroskobu ile görüntülenmiştir. Oregon Green 488 konjuge jelatin lamlar üzerine ekilen bu OSC 19 hücreleri, R domine konjuge Phin ve anti kort aktin antikorları ile işaretlenmiş ve ANOR 647 sekonder antikoru ile görselleştirilerek istila edilen bölgeler yalancı renklendirme ile yeşil olarak gösterilmiştir.

Birleştirilmiş görüntüde podia, gelatin temizlenme hacmi dolum alanlarıyla örtüşen F aktin ve kortan'ın fokal sitoplazmik konsantrasyonları olarak belirgindir. Görselleştirme, istila eden podiaların ECMA alt hacmine nasıl nüfuz ettiğini betimlemekte; istila eden podiaların bulunduğu hücre içindeki bir kenarı göstermek için bir alt hacim oluşturulmuştur. Dorsal kenar görünümü, alttaki gelatin içerisine yerleşmiş olan istila eden podiaları göstermektedir.

Ventral kenar görünümü, Veda podialarında protrusionsları ve lamellenin altındaki jelatin bozunma alanlarını, yeşil matris içinde kırmızı bölgeler olarak göstermektedir. Bu görüntüler, tüm bir mikroskobik görüntü içindeki normalize edilmiş jelatin matris bozunma hücrelerinin nicelendirilmesi için önemli olan bazı adımları göstermektedir. Kırmızı eşikleme ve ilgi alanı işaretlemelerini daha iyi sergilemek için tüm floresan görüntüler gri tonlamaya dönüştürülmüştür.

Oregon Green 4 88 konjuge jelatinin bu görüntüsü, degradasyonun meydana geldiği koyu alanları göstermektedir. Eşikleme işlemiyle jelatin görüntüsü, degradasyon alanlarını belirginleştirir ve bu alanlardan seçilen ilgi bölgeleri, degradasyon alanı için ölçülür. Bu görüntü, beklendiği üzere rumine, foid ve f aktin boyanmasını göstermektedir.

Aktin görüntüsündeki eşik, ölçülecek hücre alanlarının seçildiği toplam hücre alanını vurgular. Benzer şekilde, bu teknik DAPI ile boyanmış hücre çekirdeği görüntülerini incelemek için de uygulanabilir. Bu panel, karma bir hücresel popülasyon içindeki tekil hücreler tarafından gerçekleştirilen floresan jelatin yıkımının nicelleştirilmesinde yer alan seçili adımları göstermektedir.

Bu basit nicel analiz, flag epitop etiketiyle birleştirilmiş rekombinant kort aktin aşırı eksprese eden tek bir transfekte OSC 19 hücresine aittir. Transfekte hücrelerin neden olduğu matriks degradasyonunun, transfekte ve transfekte edilmemiş hücrelerden oluşan karışık bir popülasyon içinde de analiz edilebileceğine dikkat edin. Bu prosedür uygulanırken birkaç noktayı hatırlamak önemlidir.

Öncelikle, floresan hücre markörlerinizin floresan jelatinin rengiyle örtüşmediğinden emin olun. Görüntüler toplanırken, alanların hücre varlığına göre seçilmesi önemlidir. Farklı hücre hatları arasındaki değişkenlik ve çeşitli terapötik ajanlara verilen yanıtlar nedeniyle, verileri yanlı kılabileceği için öncelikli olarak dejenerasyon bölgelerini aramayın.

Koltuk sayısı, degradasyon süresi ve immünofloresan işaretleme için protein seçimi gibi faktörler, gerçekleştireceğiniz özel deney için optimize edilmelidir. Bu videoyu izledikten sonra, beta podia aracılı degradasyon analizlerinden elde edilen, floresan jelatinle eşit şekilde kaplanmış lamel kapakların nasıl hazırlanacağının yanı sıra matris degradasyonunun kantitasyonu için kullanılan yöntemler hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.