Gen-ifadesi Makinaları Fonksiyonel Tahliller için Küçük ölçekli Nükleer ayıklar

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hücrelerden ekstrakte edilen fonksiyonel nükleer makineleri kullanarak gen ekspresyonunu test etmektir. Bu, ilk olarak hela hücrelerinin şişirilmesiyle hasat edilerek elde edilir. Daha sonra, hücreler indirilerek bağlanır ve daha sonra üçüncü adımda çekirdekleri peletlemek için santrifüjlenir.

Çekirdekler, çözünür ve işlevsel gen ekspresyon makineleri elde etmek için tuzla ekstrakte edilir, konsantre edilir ve diyalize edilir. Sonuç olarak, nükleer ekstraktların işlevselliği, transkripsiyon ve birleştirme sistemine birleştirilmiş bir RNA polimeraz ile değerlendirildiği gibi transkripsiyon ve birleştirme aktivitelerine dayalı olarak değerlendirilebilir. Bu tekniğin, toplu çekirdek özü hazırlama gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu teknikle çekirdek ekstraktını hazırlamak için az miktarda hücre kullanılabilmesidir.

Hela hücrelerini FBS ve antibiyotiklerle desteklenmiş DMEM ortamı ile üç adet 150 milimetrelik plaka üzerine kaplayarak başlayın, kültürleri 37 derecelik bir inkübatörde %5 CO2 ile hücreler %90 Co akıcılığına ulaşana kadar büyütün, bu noktada ortamı HELOC hücre kültürlerinden aspire edin ve 13 mililitre oda sıcaklığında bir kez yıkayın. Plaka başına PBS daha sonra aspire edin. PBS, her plakayı birkaç saniye yan yatırır ve PBS'nin geri kalanını aspire eder.

Daha sonra, hücreleri her bir plakanın alt kenarına kazımak için bir hücre kaldırıcı kullanın ve ardından hücreleri 1.5 mililitrelik bir einor tüpüne çekin. Son olarak, hücreleri yüz kez G ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca bir mikro füje koyun. Şimdi PBS'yi hücre peletinden aspire edin ve tüp üzerindeki derecelendirmeye bakarak paketlenmiş hücre hacmini veya PCV'yi tahmin edin.

Daha sonra hücre peletine PCV'nin iki katı hacimde hipotonik tampon ekleyin. Yeniden askıya almak için tüpü hafifçe sallayın. Hücreler, hücre kümelerini gerektiği gibi çıkarmak için hücre süspansiyonunu 1000 mikrolitrelik bir pipetle nazikçe yukarı ve aşağı pipetler.

Daha sonra hücreleri daha önce olduğu gibi aynı santrifüj koşulları altında peletleyin. Santrifüjlemeden sonra, hipotonik tampon tabakasını dikkatlice aspire edin. Hücreler şişmeye başlayacak ve hücre hacmi yaklaşık 750 ila 1000 mikrolitreye yükselmiş olacaktır.

1.5 mililitrelik son hacme yeni hipotonik tampon ekleyin ve tampondaki hücreleri yeniden süspanse edin. Yine. Son olarak, hücreler soğurken yeniden askıya alınan şişmiş hücreleri buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Bir aşağı homojenizatörü hipotonik tampon ile durulayın ve ardından hücrelerle birlikte buzun üzerine yerleştirin.

Ardından, Kim mendili gibi hassas bir görev sileceği kullanarak havaneli kurulayın. Tamponu inişlerden çıkarmak için 1000 mikrolitrelik uzatılmış bir mikro pipet ucu kullanın. Şimdi soğutulmuş şişmiş hücreleri aşağı doğru aktarmak için pipeti kullanın.

Başarılı bir giriş için bu prosedürün en zor kısmı mı: Lizis olup olmadığını kontrol edin. Mikroskopta her çıkıştan sonra, kabarcıkları önlemek için dikkatli bir şekilde hücreleri bitlemek için aşağıların sıkı havaneli beş kez yavaşça yukarı ve aşağı hareket ettirin. Daha sonra, lys hücre süspansiyonunun beş mikrolitrelik bir Eloqua'sını bir einor tüpüne aktarın ve 10 mikrolitre trian mavisi ve 15 mikrolitre bir XPBS ekleyin.

Hücre çözeltisini bir slayta ekleyin ve hücreleri lizis için ışık mikroskobu altında inceleyin, lys hücrelerinin çekirdekleri üç ons sonra mavi görünecektir. Çok sayıda canlı hücre görülebildiği için yeterli lizis yoktur. Beş onstan sonra, yeterli lizis var.

Son olarak, lys hücrelerini önceden soğutulmuş einor tüpüne aktarın ve hücre süspansiyonunu 1500 kez G ve dört santigrat derecede bir mikro füje içinde beş dakika boyunca döndürün. Ardından, peleti bozmadan süper natini dikkatlice yeni bir tüpe aktarın. Şimdi, tüp üzerindeki derecelendirmeye bakarak yama nükleer hacmini veya PNV'yi tahmin edin.

Bir mikro pipet ucunu PNV'nin yarısında düşük tuz tamponu ile doldurun. Ardından mikro pipet ucunu einor tüpünün altındaki çekirdeğe yerleştirin. Nazikçe karıştırırken tamponu yavaşça çekirdeğe püskürtün.

Peletin tamamen yeniden askıya alındığından emin olmak için tüpü hafifçe vurun. Daha sonra, PNV'nin yarısına yüksek tuz tamponu ekleyin ve tüpü ters çevirerek bir kez hızlı bir şekilde karıştırın. Tüpü dört santigrat derecede 30 dakika döndürün.

Son olarak, mikro füje içindeki çekirdekleri 18.000 kez G ve dört santigrat derecede 15 dakika boyunca döndürün. 500 mikrolitre süpernatanı soğutulmuş mikro eksilere aktararak başlayın. Santrifüjlemeden sonra yüksek tuzlu nükleer ekstraktı 14.000 kez G ve dört santigrat derecede 15 dakika döndürün, mini racon'u ters çevirin ve yeni bir ayrı EOR tüpüne yerleştirin.

1000 kez G ve dört santigrat derecede iki dakika döndükten sonra, yüksek tuzlu nükleer ekstrakt yaklaşık 115 mikrolitreye konsantre edilecektir. Şimdi yüksek tuzlu nükleer ekstraktın 45 mikrolitrelik alikotlarını mini diyaliz SLI'lerine aktarın. Sürgünün alt kısmının şamandıranın alt kısmıyla aynı olduğundan emin olun.

Ardından SLI'leri 500 mililitre soğutulmuş diyaliz tamponuna yerleştirin. Son olarak, alikotları dört santigrat derecede bir ila iki saat karıştırın, nükleer ekstrakt diyalizden sonra bulanık görünecektir. Bu şekil, küçük ölçekli bir nükleer ekstrakt ile bir toplu nükleer ekstrakt arasında birleştirilmiş bir RNA polimeraz iki transkripsiyonu ve dilimleme reaksiyonunu karşılaştıran temsili verileri göstermektedir.

ACMV-d-N-A yapısı toplu veya küçük ölçekli ekstraktlarda inkübe edildiğinde, yeni ortaya çıkan pre mRNA'nın benzer seviyeleri, daha fazla transkripsiyonu bloke etmek için alfa ve manin ilavesini takip eden beş dakikalık zaman noktası ile sentezlendi, ekleme ara ürünleri ve ekleme ürünleri, her iki ekstrakt tipinde de benzer kinetik ile zaman içinde birikmiştir. Bu temsili sonuçlar, birleştirilmiş RNA polimeraz iki transkripsiyon ve ekleme sisteminin verimliliklerinin, toplu ve küçük ölçekli nükleer ekstraktlarda benzer olduğunu doğrulamaktadır. Küçük ölçekli ekstraktın faydasını göstermek için, ekleme inhibitörü E 7 1 0 7 veya negatif kontrol bileşiği Platy analy F ile muamele edilen hela hücrelerinden yöntem ekstraktları hazırlandı ve daha sonra birleştirilmiş bir RNA polimeraz iki transkripsiyonu ve ekleme deneyi gerçekleştirildi bu şekilde gösterildiği gibi, RNA polimeraz ile transkripsiyon, hem ekose F hem de E 7 1 0 7'den hazırlanan ekstraktlarda verimli bir şekilde meydana geldi Hücre.

Buna karşılık, ekstraktasyon normal olarak analitik F ile muamele edilen hücrelerden hazırlanan ekstraktta meydana geldi, ancak E 7 1 0 7 ile muamele edilen hücrelerde kaldırıldı. Bu veriler, küçük ölçekli hücrelerin özel muamelesi için küçük ölçekli nükleer ekstraktların kullanılması için kavram kanıtı sağlar. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik beş saatten daha kısa sürede tamamlanabilir.