Name: Gen-ifadesi Makinaları Fonksiyonel Tahliller için Küçük ölçekli Nükleer ayıklar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Öğrenin, küçük ölçekli HeLa nükleer ekstraktları hazırlayarak gen ifadesi fonksiyonel analizleri yapmayı. Bu yöntem, sınırlı hücre sayılarıyla transkripsiyon ve splicing aktivitelerini değerlendirmeyi mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz M. Winkelbauer-Hurt, E. İbrahim P. Valencia, K. Dufu, yararlı tartışmalar için H. Cheng minnettarız. HeLa hücrelerinde Ulusal Hücre Kültür Merkezi (Minneapolis, MN) elde edildi. Ayrıca ışık mikroskobu ile yardım için Harvard Tıp Okulu&#39;nda E7107 ve Nikon Görüntüleme Merkezi sağlamak için Eisai Co, Ltd teşekkür ederim. Bu çalışma JLH RR ve EGF ve NRSA dostluk için bir NIH hibe GM043375 tarafından desteklenmiştir.

1. Nükleer Ekstraksiyon için Büyüyen HeLa Hücreleri <ol><li> DMEM ortamı ile üç 150 mm levha üzerine plakası HeLa hücreleri% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş. Hücrelerinin% 90 konfluent kadar% 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör büyür. </li></ol> 3 gün ayrıldıktan sonra bir konfluent plaka ve hasattan 01:10 İpucu-hücreleri ayırır. Tip-Fazladan bir plaka üç plakaları ile yeterince hücreler (örneğin, hücreler% 90&#39;ından daha az birleşik eğer) bulunmaması halinde yetiştirilebilir. 2. Nükleer Özü Çözümler hazırlayın ve soğutun <ol><li> Tablo 2&#39;de belirtildiği gibi taze çözümler hazırlayın. </li><li> 15 ml Falcon tüp içine Hipotonik Buffer tablet 10 ml. 1.5 ml Eppendorf tüpler içine alikotu yüksek tuz Tampon ve Düşük Tuz Tamponu, 1 ml 1 ml. Buz üzerinde tamponlar soğutun. (Bakınız kullanmak üzere, her bir tampon PMSF ve DTT, uygun hacimleri ekleme hemen önce <strong&gt; Tablo 1). </li></ol> 3. Nükleer Ekstraksiyon için HeLa Hücreleri Hasat <ol><li> Hücrelerinden ortamı aspire ve levha oda sıcaklığında 1X PBS 13 ml ile bir kez hücreleri yıkanır. </li><li> PBS yıkama aspire. </li></ol> Sonra birkaç saniye bekleyip, kalan aspire, yan plaka duruyordu, ilk Çekiş tarafından olduğu kadar, PBS mümkün olduğunca Tip-aspire. <ol start="3"><li> Bir hücre yükleyici kullanılarak, plakaların alt kenarına hücreleri sıyırmak ve ardından bir Eppendorf tüpüne hücreleri transfer. Kabarcıkları yapmaktan kaçının. Kazınarak hücrelerin 3 tabak, 1,5 ml Eppendorf tüpe uygun olmalıdır. </li></ol> Tip-O bir Eppendorf tüpüne kullanıldığı takdirde hücrelerinin hacmi tahmin etmek için daha kolaydır. Ölçek için yukarı, Falcon tüpleri kullanın. <ol start="4"><li> Pelet hücrelere xg 100, 5 dakika süre ile, bir mikrofüj içerisinde 4 ° C&#39;de santrifüje. </li></ol> 4. Hipotonik Tampon yılında HeLa hücreleri şişer </p&gt; <ol><li> Dikkatle hücre pelletini gelen PBS aspire ve tüp üzerinde tonlama bakarak Paketli Hücre Hacim (PCV) tahmin ediyoruz. HeLa hücrelerinin Üç konfluent plakaları PCV yaklaşık 500 ul verim. </li><li> Hücre topağı için Hipotonik tampon PCV 2X ekleyin. Hücrelerin tekrar süspansiyon hafifçe sallayın. Hafifçe gerekirse, aşağı ve yukarı pipetleme tarafından hücreleri tekrar süspansiyon bir P1000 Pipetman kullanın. </li><li> Pelet hücrelere xg 100, 5 dakika süre ile, bir mikrofüj içerisinde 4 ° C&#39;de santrifüje. * Hücreleri bu kez şişmeye başlamış olacak ve hücre hacmi şu anda 750 ul-1000 ul hakkında olmalıdır. </li><li> Dikkatle Hipotonik Tampon aspire ve 1.5 ml nihai hacme yeni Hipotonik Buffer ekleyin. Hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> 10 dakika süreyle buz üzerinde inkübe tekrar süspanse şişmiş hücreleri. </li></ol> 5.. Bir Dounce Homojenizatör kullanma Hücreleri Lyse <ol><li> Dounce durulayın ve ardından buz üzerine chill Hipotonik Tampon kullanın. Hassas bir görev wip ile havaneli kurulayınızER (örn. Kimwipe). 1000 ul genişletilmiş mikropipet ucunu kullanarak Dounce geri kalan tamponu çıkarın. </li><li> Dounce içine şişmiş hücreler aktarın. Yavaş yavaş kabarcıkları önlemek için dikkatli olmak, akyuvarlar için 5 kez Dounce sıkı havaneli, yukarı ve aşağı. </li><li> Dounce hücrelerin bir alikotu 5 ul kullanılarak hücre parçalanması için Assay. Bir Eppendorf tüp içinde tablet yerleştirin ve Tripan Mavi eşit hacimde ekleyin. Slayt üzerindeki karışımı koyun ve bir ışık mikroskobu kullanılarak hücrelerin inceleyin. Eridi hücrelerin çekirdekleri mavi görünecektir. Yaklaşık% 90 parçalama idealdir. </li></ol> İpucu-hücreleri dounced gereken zamanlarda sayısı Dounce gerginliğini bağlı olarak değişecektir. Ilk kez bu protokolü taşırken, Dounce her inme sonrası adımı 5.3 yaparak Dounce için sayısını belirler. Aşırı Dounce yapmayın, aşırı douncing çekirdeklerinin yok edecektir. <ol start="4"><li> Bir ön-chille ile lizlendi hücreleri aktarmakd Eppendorf tüpüne ve 1500 x g&#39;de 5 dakika boyunca 4 ° C de mikrofuj spin. Pelet çekirdeği içermektedir. Dikkatle çekirdek bozmadan yeni bir tüpe süpernatant aktarın. Süpernatant sitoplazma içerir. </li></ol> İpucu-sitoplazma toplu özler (toplu özleri etkin bir S100 hazırlamak için 1) için kullanılan aynı yüksek hızlı sıkma kullanarak olarak kullanılabilir veya başka bir S100 için işlenebilir. 6. Çekirdekler Tuz Özü <ol><li> Tüpün üzerinde derecelendirme bakarak Paketli Nükleer Hacim (PNV) tahmin ediyoruz. 500 ul&#39;lik bir PCV tipik olarak 400 ul&#39;lik bir PNV verir. </li><li> Borusunun alt ucu, bir mikropipet ekleme ve yavaş hafifçe karıştırma çekirdek içine tampon squirting tarafından çekirdekler Düşük Tuz Tampon ½ X PNV ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı yapmayın. Yavaşça pelet tamamen devam etmeden önce Düşük Tuz Tampon yeniden süspanse emin olmak için tüp hafifçe vurun. </li> &lt;li&gt; Add ½ X Yüksek Tuz Tampon ve hızlı bir şekilde ters tüp 1 kez karıştırın ve PNV. Sallamayın. 30 dakika süre ile 4 ° C&#39;de dönerler. </li></ol> Onları parçalama önlemek için Yüksek Tuz Tampon bulunan çekirdekleri ile nazik Tip-olun. <ol start="4"><li> 18,000 x g&#39;de 15 dakika boyunca bir mikrofüj içerisinde 4 ° C&#39;de dönerler. Süpernatant yüksek tuz nükleer ekstraktı (HS-NE) &#39;dir. Hücrelerin üç tabak genellikle HS-NE 500-600 ul verim. </li></ol> 7. Nükleer Özü Konsantre ve Dialyze <ol><li> Soğutulmuş mini centricons (Amicon) ve 14000 x g bir mikrofuge&#39;de 4 50 dakika ° C için spin içine HS-KD 500 ul aktarın. Mini-centricon (Amicon) haricindekileri ve yeni bir Eppendorf tüp yerleştirin. 4 2 dakika süreyle Spin ° C HS-NE kurtarmak için 1000 xg. HS-NE yaklaşık 115 ul kadar konsantre olacak. </li><li> Bir P200 Pipetman kullanarak, mini diyaliz Slide-A-Lyzers içine HS-NE 45 ul alikotları aktarabilir ve 50 koyunSoğutulmuş Diyaliz Tampon 0 ml. Slide-A-Lyzer alt şamandıranın altında aynı hizada olduğundan emin olun. 4 ° C&#39;de 1-2 saat için karıştırılmaya KD diyaliz sonra bulanık görünür. </li></ol> İpucu-Do Bu santrifüj ekstresinin aktivitesini azaltır olarak, diyaliz sonrasında gözlenen bulutlu çökelti kaldırmak için santrifüjlenmez. <ol start="3"><li> KD hemen veya bölünüp edilebilir. Örnek kısımları flaş sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve -80 ° C&#39;de muhafaza edilmelidir KD depolanır ve aktivitesini kaybetmeden en az iki donma-çözülme döngüleri tabi olabilir. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar Son zamanlarda, raptetme için RNAP II transkripsiyon akuplaj için in vitro sistemleri etkin 2-5 geliştirilmiştir. Bu sistemler, toplu olarak yetiştirilen HeLa hücrelerinde istihdam ve böylece hızla çoklu numuneler üzerinde spesifik hücresel tedavilerin etkilerini test etmek mümkün olmamakta. Dayanarak, bu bir ihtiyaçnd küçük ölçekli bir özü protokolünün genel yarar (Tartışma bakın), biz sağlam bir küçük ölçekli nükleer özü yöntemi kurdu. Dökme Nükleer ekstresi ile küçük ölçekli nükleer özü RNAP II transkripsiyon / raptetme reaksiyon karşılaştırarak temsili veriler Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. CMV promot.örünü içerir ve standart bir raptetme substrat (Ftz 3, Şekil 2A) Analiz için kullanılan kodlayan bir DNA CMV-yapı,. Bu yapı toplu (şerit 1-3) ya da küçük ölçekli (şerit 4-6) özü inkübe edildiğinde, pre-mRNA doğmakta benzer düzeylerde 5 dakika zaman noktasında (Şekil 2, hat 1 ve 4 ile sentezlenmiştir ). Daha da transkripsiyon engellemek için α-amanitin arasında ilavesinden sonra, raptetme ara ürünler ve raptedilmektedir ekstrelerin her iki tür (Şekil 2, şerit 2, 3, 5, 6) da benzer kinetiği olan zaman içinde birikmiş. Bu temsilcisi sonuçlar gösteriyor ki darbe verimliliği<html> liderliğindeki RNAP II transkripsiyon / yapıştırma sistemi dökme ve küçük ölçekli nükleer özler benzer. Küçük ölçekli özü yöntemin yararlılığını ortaya özü raptetme inhibitörü, E7107 veya negatif kontrol bileşiği pladienolide F 6,7 ve ardından birleştirilmiş RNAP II transkripsiyon / raptetme deneyi yapılmıştır ile muamele HeLa hücreleri hazırlandı. Şekil 3, Pladienolide F ve E7107 tedavi edilen hücreler (10 dk zaman noktalarında) hem de hazırlanan ekstreler içinde etkin bir şekilde meydana RNAP II tarafından transkripsiyonu gösterilmiştir. Buna karşılık, yapıştırma Pladienolide F-tedavi hücrelerinden hazırlanan ekstrenin normal oluştu ama (Şekil 3, 20-60 dakika sürede puan) E7107 ile tedavi edilen hücrelerde kaldırıldı. Bu veriler, küçük ölçekli hücrelerin özel bir tedavi için küçük ölçekli nükleer ekstreleri kullanarak kavramının kanıtı. jpg &quot;/&gt; Şekil 1.. Küçük ölçekli Özü Protokolü şematik. P1 Adım. Hücreler, mono tabakalar gibi yetiştirilen bir hücre yükleyici kullanılarak plakalardan hasat edilmiş ve hipotonik tampon ilave edilerek şişmiş edilir. P2 Adım. Hücreler bir Dounce homojenizatör kullanarak eridi ve pelet için çekirdekleri santrifüj edilir. P3 Adım. Çekirdekler sitoplazma ayrılmış ve tuz ekstraksiyonu geçirilir. P4 Adım. Nükleer ekstrakt konsantre edilir ve diyaliz edildi. P5 Adım. Sonuçları nükleer ekstreleri (daha fazla ayrıntı için bakınız Şekil 2) işlevsel olduğunu olduğunu göstermektedir elde edilir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4140/4140fig2.jpg" /> Şekil 2. Küçük ölçekli nükleer özleri eşleşmiş RNAP II transkripsiyon / yapıştırma tayininde sağlamdır. A. Coupled RNAP II transkripsiyon / yapıştırma için kullanılan CMV Ftz DNA örneğinin şematik. CMV promoter ve ekzondan ve intron boyutları gösterilir. Coupled RNAP B. KarşılaştırılmasıToplu nükleer özü veya küçük ölçekli nükleer özü kullanılarak II transkripsiyon / yapıştırma testi. Transkripsiyon ve raptetme 5 dakika 30 ve 60 dakika süre ile meydana gelmesine izin sonra α-amanitin ilave edildi. RNA, bir fraksiyonlara ekstre edilmiş ve% 5 denatüre poliakrilamid jel üzerinde ve phosphoimager ile tespit edildi. Raptetme ara ürünler ve gösterilir. Endojen U6 snRNA ve tRNA özü mevcut ve 32 inkübasyon sırasında P-etiketli belirtilmiştir olduğunu. Kuplajlı RNAP II transkripsiyon / yapıştırma sistemi üzerinde ayrıntılı bir protokol için 3 bakın. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4140/4140fig3.jpg" /> Şekil 3. Kırpılma inhibitörü ilaç E7107 ile tedavi HeLa hücrelerinden hazırlanan küçük ölçekli nükleer özleri ekleme de bozuk. Hücreler 3 mM Pladienolide ile tedavi edildi F veya E7107 gibi6 açıklanan ve daha sonra küçük ölçekli nükleer ekstreler hazırlamak için kullanılmıştır. Bir kez tabii Şekil 2 &#39;de anlatılanla aynı transkripsiyon / raptetme deneyi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Raptetme ara maddeler ve ürün, ve U6 snRNA ve tRNA gösterilir.

<ol><li>Krainer, A. R., Maniatis, T., Ruskin, B., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+mutant+human+beta-globin+pre-mRNAs+are+faithfully+and+efficiently+spliced+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Normal and mutant human beta-globin pre-mRNAs are faithfully and efficiently spliced in vitro.</a> Cell. 36, 993-1005 (1984).</li>
<li>Ghosh, S., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+in+vitro+synthesis+and+splicing+of+RNA+polymerase+II+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Coupled in vitro synthesis and splicing of RNA polymerase II transcripts.</a> Rna. 6, 1325-1334 (2000).</li>
<li>Das, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+coupling+of+RNAP+II+transcription+to+spliceosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Functional coupling of RNAP II transcription to spliceosome assembly.</a> Genes Dev. 20, 1100-1109 (2006).</li>
<li>Hicks, M. J., Yang, C. R., Kotlajich, M. V., Hertel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+splicing+to+Pol+II+transcription+stabilizes+pre-mRNAs+and+influences+splicing+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Linking splicing to Pol II transcription stabilizes pre-mRNAs and influences splicing patterns.</a> PLoS Biol. 4, e147(2006).</li>
<li>Yu, Y., Das, R., Folco, E. G., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+in+vitro+system+for+co-transcriptional+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A model in vitro system for co-transcriptional splicing.</a> Nucleic Acids Res. 38, 7570-7578 (2010).</li>
<li>Kotake, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+factor+SF3b+as+a+target+of+the+antitumor+natural+product+pladienolide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Splicing factor SF3b as a target of the antitumor natural product pladienolide.</a> Nat. Chem Biol. 3, 570-575 (2007).</li>
<li>Folco, E. G., Coil, K. E., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-tumor+drug+E7107+reveals+an+essential+role+for+SF3b+in+remodeling+U2+snRNP+to+expose+the+branch+point-binding+region%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">The anti-tumor drug E7107 reveals an essential role for SF3b in remodeling U2 snRNP to expose the branch point-binding region.</a> Genes. 25, 440-444 (2011).</li>
<li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).</li>
<li>Lee, K. A., Bindereif, A., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-scale+procedure+for+preparation+of+nuclear+extracts+that+support+efficient+transcription+and+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Anal.+Tech%22%5BJournal%5D)">A small-scale procedure for preparation of nuclear extracts that support efficient transcription and pre-mRNA splicing.</a> Gene Anal. Tech. 5, 22-31 (1988).</li>
</ol>

Bu makalenin Üretim ve Serbest Giriş Abcam, Plc tarafından desteklenmektedir.

Biz monotabaka olarak yetiştirilen HeLa hücrelerinde az miktarda nükleer özler hazırlanması için hızlı ve tekrarlanabilir bir yöntem kurduk. Biz bu özler RNAP II transkripsiyon / yapıştırma tahlillerin kinetik ve verimliliği, küçük ölçekli ve toplu nükleer özler benzer olduğunu göstererek sağlam olduğunu gösterdi. Biz kırpılma inhibitörü ilaç ile tedavi hücrelerinden hazırlanan özler transkripsiyon ama yapıştırma kusurlu için aktif olduklarını göstererek özlerinin yardımcı gösterdi. Küçük ölçekli nükleer ekstreler hazırlanması için yöntem, daha önce büyük ölçekli 1,8 içinde süspansiyon yetiştirilen HeLa hücreleri ekstreler ve ekstre 9 küçük ölçekli hazırlanması için bir yöntem yapmak için yöntemler kurulan birleştirerek ve optimize etmek kurulmuştur. Önceki küçük ölçekli özleri gibi birleştiğinde transkripsiyon / sp, bazı testler için işlevsel değildi, çünkü bizim protokol kurulantahlil licing. Önceki küçük ölçekli protokolü 9 ile bizimki arasında önemli bir fark, önceki protokolü bir küçük iğne ile 9 aktararak hücreleri parçalanır, oysa biz bir mini-Dounce kullanarak hücrelerini parçalayan koşulları optimize olmasıdır. Ekstreleri, bazı testler için yeniden etkin ve / veya zordu neden açıklayabilir kabarcıklar iğne parçalama sonuçları. Biz de protokole bir konsantrasyon adımı ekledi. Bu adım konsantrasyonu son derece duyarlı olan özler, aktivitesini artırır ve aynı zamanda küçük ölçekli hazırlıklarına doğasında vardır özleri arasında değişkenlik sınırlar. Son olarak, rutin olarak hazırlanması dökme ekstreler göre aktivitesi üzerinde anlamlı bir etkisi olmayan, tek tabaka hücrelerin sadece üç 150 mm levha ile gerçekleştirilir. Böylece, işlem masraflı reaktifler veya sınırlı hücre durumu gerektiren küçük ölçekli hazırlıkları için hazır tâbidir. Örneğin, biz sma hazırladıkll ölçekli RNAi Knockdown hücrelerinden ve Kronik Lenfositik Lösemi (KLL) hasta hücreleri alıntılar ve fonksiyonel ve / veya biyokimyasal testler (EGF, JLH, TY ve RR, yayınlanmamış) için bu özleri kullanılmaktadır. Biz RNAi gibi immunopreciptations, Batılıların ve gümüş boyama gibi özel biyokimyasal testler, takip için özler değerli olduğunu bulduk. Belirli bir protein vurma etkinliği kurduktan sonra, daha ayrıntılı bir çalışma düşük maliyetle ilave ekstreler hazırlamak için kullanılabilen bir stabil demonte hücre hattı, yaparak gerçekleştirilebilir. Proteinlerin kütle spektrometrisi, aynı zamanda yöntemin yararlı bir uygulama olacak bu demonte hücre hatları elde immunoprecipitates içinde mevcut. Buradaki protokol açıklama için bir örnek olarak kullanılmaktadır ki çiftli transkripsiyon / assay raptetme ek olarak, küçük ölçekli ekstreler gibi farklı st için kullanılanlar gibi, çok sayıda işlevsel ve biyokimyasal deneyleri için genel olarak uygulanabilir olmalıdırgen ekspresyonu eps (kapatma, yapıştırma, transkripsiyon, poliadenilasyon, mikroRNA işleme gibi). Protokol ayrıca iki süspansiyon elde (örneğin KLL hücreleri gibi) ya da (örneğin hastanın fibroblast gibi) kültür yetiştirilebilir hasta hücre türleri için adapte edilebilir. Son olarak, işlem sırasında elde edilen sitoplazmik fraksiyonu sitoplazma gerektiren işlevsel ve biyokimyasal hem deneyleri için yararlı olmalıdır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Reaktif tam adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 4 - (2-Hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit </td><td> Sigma </td><td> H3375-500G </td></tr><tr><td> MgCl2 0,6 H2O </td><td> Magnezyum Klorür hekzahidrat </td><td> Sigma </td><td> M2670-500G </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Potasyum Klorür </td><td> Balıkçı </td><td> P335-212 </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Fenilmetansülfonil florür </td><td> Sigma </td><td> P7626-100G </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Ditiyotretol </td><td> Biyoanalitik Amerikan </td><td> AB00490-5G </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Etilendiamintetraasetat, disodyum, dihidrat </td><td> Biyoanalitik Amerikan </td><td> AB00500-01000 </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td></td><td> MP Biomedicals </td><td> 800689 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Dulbecco Minimal Essential Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-073 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Sığır fetüs serumu </td><td> Gibco </td><td> 16140 </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td></td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Fosfat Tamponlu Salin </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CV </td></tr><tr><td> Tripan Mavi% 0.4 Leke </td><td></td><td> Gibco </td><td> 15250 </td></tr><tr><td> Hücre Kaldıraçlar </td><td></td><td> Corning </td><td> 29442-200 </td></tr><tr><td> 150mm Tabaklar </td><td></td><td> VWR </td><td> 353025 </td></tr><tr><td> Genişletilmiş Mikropipet İpucu </td><td></td><td> Denville </td><td> P1126 </td></tr><tr><td> Sıkı havaneli ile Homojenizatör, 1ml, Dounce </td><td></td><td> Wheaton </td><td> 357538 </td></tr><tr><td> Slidealyzers, MWCO 10kDa </td><td></td><td> ThermoScientific </td><td> 69572 </td></tr><tr><td> Mini-Centricons, MWCO 3kDa </td><td></td><td> Millipore (Amicon) </td><td> UFC500396 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Özel Reaktifler ve Ekipmanları. <table border="1"><tbody><tr><td> Çözüm </td><td> Son </td><td> Stok </td><td> Dağıtmak </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hipotonik </td><td> 10 mM HEPES, pH 7.9 </td><td> 1M HEPES, pH 7.9 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td></td> &lt;td&gt; 1.5 mM MgCl2 </td><td> 1M MgCl2 </td><td> 750 ul </td></tr><tr><td></td><td> 10 mM KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 1.67 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 mM PMSF </td><td> 200 mM PMSF </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td></td><td> 0.5 mM DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 125 ul </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Su ile 500 ml kadar getirin </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Düşük Tuz </td><td> 20 mM HEPES, pH 7.9 </td><td> 1M HEPES, pH 7.9 </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td></td><td> 1.5 mM MgCl2 </td><td> 1M MgCl2 </td><td> 150 ul </td></tr><tr><td></td><td> 20 mM KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 667 ul </td></tr><tr><td> &amp; Nbsp; </td><td> 0.2 mM EDTA </td><td> 0,5 M EDTA </td><td> 40 ul </td></tr><tr><td></td><td> % 25 Gliserol </td><td> Gliserin </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 mM PMSF </td><td> 200 mM PMSF </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td></td><td> 0.5 mM DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 25 ul </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Su ile 100 ml&#39;ye kadar getirin </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Yüksek Tuz </td><td> 20 mM HEPES, pH 7.9 </td><td> 1M HEPES, pH 7.9 </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td></td><td> 1.5 mM MgCl2 </td><td> 1M MgCl2 </td><td> 150 ul </td></tr><tr><td></td><td> 1.4M KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 48 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 mM EDTA </td><td> 0,5 M EDTA </td><td> 40 ul </td></tr><tr><td></td><td> % 25 Gliserol </td><td> Gliserin </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 mM PMSF </td><td> 200 mM PMSF </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td></td><td> 0.5 mM DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 25 ul </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Su ile 100 ml&#39;ye kadar getirin </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diyaliz </td><td> 20 mM HEPES, pH 7.9 </td><td> 1M HEPES, pH 7.9 </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td></td><td> 100 mM KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 16,625 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 mM EDTA </td><td> 0,5 M EDTA </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td></td><td> Gliserol% 20 </td><td> Gliserin </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 mM PMSF </td><td> 200 mM PMSF </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td></td><td> 0.5 mM DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 125 ul </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Su ile 500 ml kadar getirin </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Nükleer Özü hazırlanması için çözümler.

gen-ifadesi makinaları fonksiyonel tahliller için küçük ölçekli nükleer ayıklar

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Anlayış gen ekspresyonu ilerleme çok sayıda in vitro sistemleri kullanılarak yapılmıştır. Çoğu çalışmaları için, fonksiyonel deneyleri süspansiyon yetiştirilen hücrelerinin 10-50 ya da daha fazla litre toplu olarak hazırlanmıştır ekstreler kullanılarak gerçekleştirilir. Bununla birlikte, bu büyük ölçekli preparatlar vitro etkileri hızla test edilmesi için müsait değildir vivo hücresel tedavisi ya da koşullarında çok çeşitli sonucu. Bu, Journal Video madde, örnek olarak HeLa hücreleri kullanılarak, fonksiyonel küçük ölçekli nükleer ekstreler hazırlanması için bir yöntemi göstermektedir. Bu yöntem, yapışık mono tabakalar olarak yetiştirilir hücreleri gibi birkaç 150 üç olarak mm levha kullanılarak gerçekleştirilir. Küçük ölçekli özleri etkinliğini göstermek için, biz onlar birleştirilmiş RNA Polimeraz II transkripsiyon / yapıştırma reaksiyonlar için toplu nükleer özler gibi aktif olduğunu göstermektedir. Özü protokol programı göstermek için, yapıştırma HeLa hücre hazırlanan özler kaldırılacaktır olduğunu gösteriyors raptetme inhibitörü ilaç E7107 ile muamele edilmiştir. Küçük ölçekli protokolü hücresel özleri kullanılarak in vitro araştırılması edilebilir herhangi bir işlem veya hücre tipi için genel olarak uygulanabilir olmalıdır. Bunlar, örneğin, küçük hücre popülasyonlarının ilaçların kullanımını gerektirir, DNA zarar verici ajanlar, RNAi veya transfeksiyon gibi çeşitli ajanlar maruz sınırlı miktarda veya hücrelerde yalnızca mevcut hastanın hücreleri içerir. Buna ek olarak, taze yetiştirilen hücreler, az miktarda uygun ve / veya bazı uygulamalar için gereklidir.

Sağlam, küçük ölçekli HeLa çekirdek ekstreler hazırlanması için bir protokol tarif edilmektedir. Bu protokol, örneğin ilaçların veya RNAi ile muamele hücreleri gibi hücrelerin küçük popülasyonları, kullanımını gerektiren deneyleri için önemlidir. Metodu gen ifadesi deneyleri ve hasta hücreleri dahil olmak üzere diğer hücre tipleri, geniş bir yelpazede uygulanabilir olması gerekir.

Gen-ifadesi Makinaları Fonksiyonel Tahliller için Küçük ölçekli Nükleer ayıklar

Gen ekspresyonunun anlaşılması konusunda in vitro sistemler kullanılarak büyük bir ilerleme kaydedilmiştir. Çalışmaların çoğunda, fonksiyonel analizler ... kullanılarak gerçekleştirilir.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hücrelerden çıkarılan fonksiyonel nükleer mekanizmalar kullanılarak gen ekspresyonunu analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle HeLa hücrelerinin hasat edilip şişirilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından hücreler çöktürülerek açılır ve üçüncü adımda çekirdekleri peletlemek için santrifüj edilir.Suda çözünür ve fonksiyonel gen ekspresyon mekanizmaları elde etmek amacıyla çekirdekler tuzla ekstrakte edilir, konsantre edilir vele diyalize edilir. Nihayetinde, nükleer ekstraktların fonksiyonelliği, RNA polimeraz ile eşleştirilmiş bir transkripsiyon ve splicing sistemi ile değerlendirilen transkripsiyon ve splicing aktivitelerine dayanarak analiz edilebilir. Bu tekniğin, dökme nükleer ekstrakt hazırlama gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, nükleer ekstrakt hazırlamak için az miktarda hücrenin kullanılabilmesidir.FBS ve antibiyotikler ile desteklenmiş DMEM besiyerini kullanarak HeLa hücrelerini üç adet 150 milimetrelik plağa ekerek başlayın; kültürleri, hücreler %90 konfluens seviyesine ulaşana kadar %5 CO2 içeren 37 °C'lik bir inkübatörde büyütün. Bu noktada, HeLa hücre kültürlerindeki besiyerini aspire edin ve her plak için 13 mililitre oda sıcaklığındaki PBS ile bir kez yıkayın, ardından PBS'yi aspire edin. Her plağı birkaç saniye yan tutun ve kalan PBS'yi aspire edin.Ardından, hücreleri her plağın alt kenarına sıyırmak için bir hücre kaldırma aparatı (cell lifter) kullanın ve ardından hücreleri 1,5 mililitrelik bir einor tüpüne çekin. Son olarak, hücreleri bir mikrosantrifüjde beş dakika boyunca 100 ×g'de ve 4 °C'de çöktürün. Şimdi hücre peletindeki PBS'yi aspire edin ve tüp üzerindeki derecelendirmeye bakarak paketlenmiş hücre hacmini veya PCV'yi tahmin edin.Ardından, hücre pelletine PCV hacminin iki katı kadar hipotonik tampon ekleyin. Yeniden süspansiyon oluşturmak için tüpü nazikçe çalkalayın. Hücre kümelerini çözmek için gerektiği şekilde, hücre süspansiyonunu 1000 mikrolitrelik bir pipetle nazikçe aşağı yukarı pipetleyerek hücreleri ayırın.Ardından hücreleri daha öncekiyle aynı santrifüj koşulları altında çöktürün. Santrifüjden sonra hipotonik tampon tabakasını dikkatlice aspire edin. Hücreler şişmeye başlamış olacak ve hücre hacmi yaklaşık 750 ila 1000 microliters değerine çıkacaktır.Son hacim 1,5 mililitre olacak şekilde yeni hipotonik tampon ekleyin ve hücreleri tampon içerisinde tekrar süspande edin. Son olarak, soğutulma işlemi sırasında süspande edilmiş şişmiş hücreleri 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Bir homogenizer'ı hipotonik tampon ile durulayın ve ardından hücrelerle birlikte buz üzerine yerleştirin.Ardından, Kim wipe gibi hassas bir temizleme mendili kullanarak havanı kurulayın. Alt kısımdaki tamponu uzaklaştırmak için 1000 µL'lik uzatılmış bir mikropipet ucu kullanın. Şimdi, soğutulmuş şişmiş hücreleri alt kısma aktarmak için pipeti kullanın.Bu prosedürün başarısı için en kritik nokta lizisin kontrol edilmesidir. Her bir örneğin mikroskop altındaki incelemesinden sonra, hücreleri liz etmek için örneğin sıkı havan deliğini yavaşça beş kez yukarı aşağı hareket ettirin ve bu sırada hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Ardından, liz edilmiş hücre süspansiyonundan 5 µL alarak bir ependorf tüpüne aktarın ve üzerine 10 µL trypan blue ve 15 µL 1X PBS ekleyin.Hücre solüsyonunu bir lama ekleyin ve hücreleri bir ışık mikroskobunda lizis açısından inceleyin; liz olmuş hücrelerin çekirdekleri üç saat sonra mavi görünecektir. Çok sayıda canlı hücre görüldüğü için lizis yeterli değildir. Beş saat sonra lizis yeterli düzeye ulaşmıştır.Son olarak, lizlemiş hücreleri önceden soğutulmuş eppendorf tüpüne aktarın ve hücre süspansiyonunu bir mikrosantrifüjde 1500 ×g ve 4 °C'de beş dakika boyunca çöktürün. Ardından, pelletten rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın. Şimdi, tüp üzerindeki derecelendirmeye bakarak toplam nükleer hacmi veya PNV'yi tahmin edin.Bir mikropipet ucunu, PNV'nin yarısı kadar düşük tuzlu tampon çözelti ile doldurun. Ardından, mikropipet ucunu eppendorf tüpünün dibindeki çekirdeklerin içine yerleştirin. Nazikçe karıştırırken, tampon çözeltiyi çekirdeklerin içine yavaşça püskürtün.Peletin tamamen süspanse olduğundan emin olmak için tüpe hafifçe vurun. Ardından, PNV'nin yarısı kadar yüksek tuzlu tampon ekleyin ve tüpü bir kez ters çevirerek hızlıca karıştırın. Tüpü dört derece Celsius'ta 30 dakika boyunca döndürün.Son olarak, çekirdekleri mikro santrifüjde 18,000 ×g'de ve 4 °C'de 15 dakika boyunca çöktürün. Süpernatantın 500 µL'sini soğutulmuş mikro konsantrasyon tüplerine aktararak başlayın. Yüksek tuzlu nükleer ekstraktı 14,000 ×g'de ve 4 °C'de 15 dakika boyunca çöktürün; santrifüj işleminden sonra mini raconu ters çevirin ve yeni bir bireysel EOR tüpüne yerleştirin.1000 ×g ve dört °C'de iki dakika boyunca santrifüjleme işleminden sonra, yüksek tuzlu nükleer ekstrakt yaklaşık 115 µL'ye konsantre olacaktır. Şimdi, yüksek tuzlu nükleer ekstraktın 45 µL'lik alikotlarını mini diyaliz SLI'larına aktarın. Slaytların tabanının floater tabanıyla temas ettiğinden emin olun.Ardından, SLI'ları 500 mililitre soğutulmuş diyaliz tamponuna yerleştirin. Son olarak, alikotları dört santigrat derecede bir ila iki saat boyunca karıştırın; diyaliz sonrası nükleer ekstrakt bulanık görünecektir. Bu şekil, küçük ölçekli bir nükleer ekstrakt ile dökme (bulk) nükleer ekstraktta eşleşmiş RNA polimeraz iki transkripsiyon ve ekleme reaksiyonunu karşılaştıran temsilci verileri göstermektedir.A-C-M-V-D-N-A konstrüktü dökme veya küçük ölçekli ekstraktlarda inkübe edildiğinde, yeni sentezlenen pre-mRNA benzer seviyelerde sentezlenmişti; daha fazla transkripsiyonu engellemek için alfa-amanitini eklendikten sonraki beş dakikalık zaman noktasında, splicing ara ürünleri ve splice ürünleri her iki ekstrakt tipinde de benzer kinetiklerle zamanla birikmişti. Bu temsili sonuçlar, eşleşmiş RNA polimeraz II transkripsiyon ve splicing sisteminin verimliliğinin dökme ve küçük ölçekli nükleer ekstraktlarda benzer olduğunu doğrulamaktadır. Küçük ölçekli ekstraktın kullanışlılığını göstermek için, splicing inhibitörü E 7 1 0 7 veya negatif kontrol bileşiği Platyanaly F ile işlem görmüş hela hücrelerinden metod ekstraktları hazırlandı ve ardından bu şekilde gösterildiği gibi bir eşleşmiş RNA polimeraz II transkripsiyon ve splicing testi gerçekleştirildi; RNA polimeraz II ile transkripsiyon, hem Platyanaly F hem de E 7 1 0 7 ile işlem görmüş hücrelerden hazırlanan ekstraktlarda verimli bir şekilde gerçekleşti.Buna karşın, analy F ile işlem görmüş hücrelerden hazırlanan ekstrede ekleme (splicing) normal şekilde gerçekleşirken, E 7 1 0 7 ile işlem görmüş hücrelerde ortadan kalkmıştır. Bu veriler, hücrelerin küçük ölçekli özel işlemleri için küçük ölçekli nükleer ekstrelerin kullanımına yönelik bir kavram kanıtı sunmaktadır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik beş saatten kısa sürede tamamlanabilir.

small-scale-nuclear-extracts-for-functional-assays-gene-expression

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada floresan ile birleştiğinde mikroenjeksiyon güç kullanan bir...

Mikroenjeksiyon tarafından Memeli Hücreleri mRNA Nükleer İhracat Kinetik Analizi

RNA polimeraz II olgun mRNA'nın 3 'ucunun ötesine uzanan bir ön-madde RNA sentezler. Olgun RNA uç yarılma kompleksinin endonükleaz etkinliği ile, RNA dizileri tarafından dikte bir bölgede, cotranscriptionally oluşturulur. Burada, detay in vitro bölünme reaksiyonları çalışma yöntemi biz.

Pre-mRNA Substratlarm 3 &#39;End Bölünme: Hücre Ücretsiz Sistemlerini Kullanma RNA İşleme Reaksiyonları Analizi<em&gt; In vitro</em

Hücresel ve hücre içi ölçekleme mekanizmaları hala belirsizliğini koruyor. Xenopus embriyo ekstraktlarının kullanımı, organel boyutu düzenleme mekanizmalarını aydınlatmak için giderek daha yaygın hale gelmiştir. Bu yöntem, embriyo ekstraktının hazırlanmasını ve nükleer boyut düzenleme mekanizmalarının tanımlanabildiği yeni bir nükleer ölçekleme testini tanımlar.

Kullanılarak hücresiz Deneyi<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyo Nükleer Boyut Yönetmeliğin Mekanizmaları Eğitim için ayıklar

Bu protokol, bir NLS-NES-GFP proteininin nükleer ithalatında gerçek zamanlı değişikliği niceleyerek motor nöron benzeri NSC-34 hücrelerindeki nükleositoplazmik taşınım oranını duyarlı bir şekilde ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır.

Motor Nöron benzeri NSC-34 Hücrelerinde Gerçek Zamanlı Nükleositoplazmik Taşınımı Ölçüm Testi

Bu iletişim kuralı ChIP-seq, 4sU seq, toplam RNA-seq ve hücre satırları ve Primer hücre için profil oluşturma ribozom Kombinatorik kullanımını açıklar. Transkripsiyon faktörü de novo transkripsiyon, RNA işlenmesi, ciro ve çeviri zamanla, bağlama ve olayların genel gidişatı harekete geçirmek ve/veya hızla değişen hücrelerde görüntüleme izleme değişiklikleri sağlar.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

SINEUPs çoğu sentetik antianlamlı kodlamayan RNA'ların bir bağlayıcı etki (BD) ve bir efektör etki alanı (ED) içerir ve yukarı düzenleyen-çeviri hedef mRNA. Burada, biz algılama yöntemleri için SINEUPs kültürlü hücre hatları, çeviri teşvik faaliyetlerini Western-blot ve görüntüleme sistemi yarı otomatik yüksek üretilen iş analizini açıklanmaktadır.

Özellikle mRNA çeviri geliştirebilirsiniz RNA'ların kodlamayan SINEUP deneyleri bağlı hücre

Chromatin immünoprecipitation (ChIP) gen yönetmeliğinin moleküler mekanizmalarını anlamak için güçlü bir araçtır. Ancak, yöntem mekanik kesme tarafından tekrarlanabilir kromatin parçalanma elde zorlukları içerir. Burada, enzimatik sindirim kullanarak bir çip tahlil için geliştirilmiş bir protokol sağlar.

Mammalin hücrelerinde Micrococcal Nüklenleri kullanarak kromatin Immünopmamitasyon tahlil

Onkojenik füzyon transkripsiyon faktörü fonksiyonu için özünde düzensiz alan adları önemlidir. Bu proteinleri terapötik olarak hedeflemek için, bu alanlar tarafından kullanılan düzenleyici mekanizmaların daha ayrıntılı bir şekilde anlaşılması gerekir. Burada, Ewing sarkomunda özünde düzensiz olan EWS alanının önemli yapısal özelliklerini haritalamak için transkriptomik kullanıyoruz.

Transcriptomik Analiz Kullanarak Düzensiz Onkojenik Transkripsiyon Faktörlerinin Yapı-fonksiyon İlişkilerinin Eşlenmesini

Burada, larva evresi 4 C. eleganlardan aktif nükleer özü izole etmek ve transkripsiyon aktivitesini bir in vitro sistemde görselleştirmek için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Aktif Caenorhabditis elegans'ın in vitro transkripsiyon için Nükleer Ekstrakt ve Rekonsitasyonu İzolasyonu

Burada, tek çekirdekli RNA-seq, ATAC-seq ve eklem multiomikleri (RNA-seq ve ATAC-seq) için flaş dondurulmuş, arşivlenmiş karaciğer dokularından çekirdekleri izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Tek Hücreli Multiomikler için Flaş Dondurulmuş Karaciğer Dokusundan Çekirdeklerin İzolasyonu

Burada, hücre çekirdeği hazırlığını tanımlayan bir protokol sunuyoruz. Kardiyak dokunun mikrodiseksiyonu ve enzimatik ayrışmasından sonra, progenitör hücreler donduruldu, ardından tek çekirdekli RNA dizilimi için kullanılan saf canlı hücrelerin izolasyonu ve yüksek verimli dizileme analizleri ile transpozaz erişilebilir kromatin için tek çekirdekli tahlil yapıldı.

Epigenom ve Tek Hücre Çözünürlüğünde Gen Ekspresyon Profillemesi için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu

Öğrenin, küçük ölçekli HeLa nükleer ekstraktları hazırlayarak gen ifadesi fonksiyonel analizleri yapmayı. Bu yöntem, sınırlı hücre sayılarıyla transkripsiyon ve splicing aktivitelerini değerlendirmeyi mümkün kılar.

Gen-ifadesi Makinaları Fonksiyonel Tahliller için Küçük ölçekli Nükleer ayıklar

Daha fazla video keşfet