Name: Bulaşıcı Mürin Norovirüs Ters Genetik Aracılı Kurtarma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Keşfedin, ters genetik yöntemlerle hücre kültüründe bulaşıcı murin norovirus (MNV) kurtarma tekniklerini. Bu protokoller, norovirus replikasyon ve patogenez araştırmaları için genetik olarak tanımlı viral izolatlar oluşturmayı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Ian Goodfellow ve Armando Arias verilen Marie Curie Avrupa İçi Bursu (7.ÇP Avrupa Araştırma Konseyi) verilen bir Wellcome Trust Kıdemli Kardeşliği tarafından finanse edildi. Biz, bize onların Agilent bioanalyser kullanma izni veren ve RNA örnekleri çalışan yardım için Io Hong Cheong, Dr Rebecca Robey ve Dr Mike Skinner teşekkür etmek istiyorum.

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreaks+of+gastroenteritis+associated+with+noroviruses+on+cruise+ships--United+States%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Morb.+Mortal.+Wkly.+Rep%22%5BJournal%5D)">Outbreaks of gastroenteritis associated with noroviruses on cruise ships--United States.</a> MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51, 1112-1115 (2002).</li>
<li>Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+cost+of+nosocomial+gastroenteritis%2C+Avon%2C+England%2C+2002-2003%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and cost of nosocomial gastroenteritis, Avon, England, 2002-2003.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 2002-2003 (2004).</li>
<li>Duizer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+efforts+to+cultivate+noroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Laboratory efforts to cultivate noroviruses.</a> J. Gen. Virol. 85, 79-87 (2004).</li>
<li>Karst, S. M., Wobus, C. E., Lay, M., Davidson, J., Virgin, H. W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT1-dependent+innate+immunity+to+a+Norwalk-like+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus.</a> Science. 299, 1575-1575 (2003).</li>
<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432(2004).</li>
<li>Bok, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+norovirus+replication+by+morpholino+oligomers+targeting+the+5%27-end+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of norovirus replication by morpholino oligomers targeting the 5'-end of the genome.</a> Virology. 380, 328-337 (2008).</li>
<li>Kim, Y., Thapa, M., Hua, D. H., Chang, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+nanogels+for+oral+delivery+of+interferon+for+norovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Biodegradable nanogels for oral delivery of interferon for norovirus infection.</a> Antiviral Res. 89, 165-173 (2011).</li>
<li>McFadden, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+Regulation+of+the+Innate+Immune+Response+and+Apoptosis+Occurs+via+the+Product+of+the+Alternative+Open+Reading+Frame+4%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Norovirus Regulation of the Innate Immune Response and Apoptosis Occurs via the Product of the Alternative Open Reading Frame 4.</a> PLoS Pathog. 7, e1002413(2011).</li>
<li>Kormelink, R., van Poelwijk, F., Peters, D., Goldbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+heterogeneous+sequences+at+the+5%27+ends+of+tomato+spotted+wilt+virus+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Non-viral heterogeneous sequences at the 5' ends of tomato spotted wilt virus mRNAs.</a> J. Gen. Virol. 73, 2125-2128 (1992).</li>
<li>Shuman, S., Hurwitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+mRNA+capping+by+vaccinia+virus+guanylyltransferase%3A+characterization+of+an+enzyme--guanylate+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of mRNA capping by vaccinia virus guanylyltransferase: characterization of an enzyme--guanylate intermediate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 187-191 (1981).</li>
<li>Jang, S. K., Pestova, T. V., Hellen, C. U., Witherell, G. W., Wimmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-independent+translation+of+picornavirus+RNAs%3A+structure+and+function+of+the+internal+ribosomal+entry+site%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme%22%5BJournal%5D)">Cap-independent translation of picornavirus RNAs: structure and function of the internal ribosomal entry site.</a> Enzyme. 44, 292-309 (1990).</li>
<li>Chaudhry, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caliciviruses+differ+in+their+functional+requirements+for+eIF4F+components%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Caliciviruses differ in their functional requirements for eIF4F components.</a> J. Biol. Chem. 281, 25315-25325 (2006).</li>
<li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4%5BTitle%5D)+AND+%22E.+EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4.</a> E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).</li>
<li>Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+protein+linked+to+the+genomic+and+subgenomic+mRNAs+of+feline+calicivirus+and+its+role+in+translation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation.</a> J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).</li>
<li>Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+genetically+defined+murine+norovirus+in+tissue+culture+by+using+a+fowlpox+virus+expressing+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase.</a> J. Gen. Virol. 88, 2091-20100 (2007).</li>
<li>Ward, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+infectious+murine+norovirus+using+pol+II-driven+expression+of+full-length+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-11055 (2007).</li>
<li>Yunus, M. A., Chung, L. M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+optimized+RNA-based+murine+norovirus+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system.</a> J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).</li>
<li>Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+mutants+of+VPg+reveal+new+cytopathology+determinants+in+a+picornavirus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus.</a> PLoS One. 5, e10735(2010).</li>
<li>Werf, S. vander, Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+infectious+poliovirus+RNA+by+purified+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-2334 (1986).</li>
<li>Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+substitution+in+the+murine+norovirus+capsid+protein+is+sufficient+for+attenuation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo.</a> J. Virol. 82, 7725-7728 (2008).</li>
<li>Bailey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+RNA+structures+present+at+the+3%27+extremity+of+the+murine+norovirus+genome%3A+the+variable+polypyrimidine+tract+plays+a+role+in+viral+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence.</a> J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Burada hücre kültüründe enfeksiyon MNV iyileşme sağlayan iki farklı ters genetik yaklaşımlar gösterdik. Etkili bir şekilde daha sonra hücresel ribozom tarafından tanınan kapaklı MNV transkriptlerin üretimi ile viral RNA genomu 5 &#39;ucuna VPG arasında kovalan bağlantı için kaçınılmaz bir gerekliliktir bypass yaklaşır hem. Enzimatik kapaklama takiben in vitro transkripsiyonu sonucunda da daha etkili olduğunu transkriptlerin FPV kapaklama enzimleri ile kaplı edilebildiği T7 RNA polimeraz, Salgılayan hücrelerin enfeksiyöz plasmidlerin transkripsiyon daha bulaşıcı MNV geri kazanımı. Bu karşıt genetik sistem ile geri kazanılan virüs titreleri enfekte hücre kültürlerinde 17 (Şekil 5) ile saflaştırılmış viral VPG-bağlı RNA transfeksiyon ile elde edilen bu gibidir. Müsamahakar Raw264.7 hücrelere kapaklı MNV RNA transfeksiyonundan transfectio içeren deneyler ile kıyaslandığında sadece 1-log daha düşük bir virüs titre vermektedirn viral VPG-bağlı RNA (Şekil 5) içeren enfekte olmuş hücreler elde edilen toplam RNA. Bu gerçek, bu sistem tarafından üretilen transkriptlerin 5 &#39;ucuna bir VPG molekülün Ayrıca VPG ilişkili hücrelerinde MNV enfektivite yatan işlevsel yönlerini ortaya çıkarabilir artış virüsü verimleri ile sonuçlanabilir olup olmadığını belirlemek için daha ileri araştırmalar teşvik eder. Diğer RNA virüsleri ile karşılaştırılabilir bir yüksek verimli bir genetik sistemleri şu anda in vitro transkripsiyon RNA virionlar 19, 20 gerçek enfeksiyonları daha sadece 10-100 düşük titreleri kurtarma olanak sağlayan kullanılan ters olarak Bununla birlikte, bu ters genetik sistem görüyoruz. Genel olarak, mevcut metodolojiler norovirüs moleküler biyoloji alanında önemli bir adım oluşturan ve norovirüs genomlarında proteinler ve korunmuş RNA motiflerin fonksiyonel rolleri araştırmak için araçlar bize. Bu yaklaşımlar zaten c ile kombine edilmiştir10 günden daha kısa 4, 21 farelerde - urrent fare modelinde kullanılabilir ve MNV bulaşıcı cDNA&#39;dan geri göstermiştir ki,&gt;% 80 STAT1-/ öldürücü enfeksiyonunun yol edebilmektedir. Biz kapsid protein ve in vivo 21, 22 biraz zayıflatılmış fenotipleri gösterilecek farklı konakçı faktörleri (PTB ve PCBP) bağlayıcı karışan polypyrimidine yollarının uygulanabilir murin norovirüs mutantlar iyileşti bu sistemin kullanılması. Buna ek olarak, son zamanlarda yeniden hücre kültürü içinde etkin bir şekilde çoğaltmak ORF4 gelen VF1 proteini ifade etme yeteneğine ancak yoksun virüsler WT MNV 8 ile ilgili olarak, farelerde virülans azaltılmış olduğunu göstermiştir. Bu çalışmalar bize potansiyel aşı adayı olarak incelenebilir MNV çalışmalara dayalı insan noroviruses zayıflatılmış sürümleri tasarlamak için teşvik ediyoruz.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Lityum klorür yağış çözüm </td><td> Ambion </td><td> AM9480 </td></tr><tr><td> RNA depolama çözümü </td><td> Ambion </td><td> AM7000 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 komut </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ScriptCap m7G Sistemi Kapatma </td><td> Epicentre Biyoteknoloji </td><td> SCCE0610 </td></tr><tr><td> Neon transfeksiyon sistemi </td><td> Invitrogen </td><td> MPK5000 </td></tr><tr><td> Neon transfeksiyon sistemi kiti </td><td> Invitrogen </td><td> MPK1025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM I </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td></tr><tr><td> Lipofektamin 2000 Transfeksiyon Reaktif </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td></tr><tr><td> Agilent RNA 600 Nano kiti </td><td> Agilent </td><td> 5067-1511 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 bioanalyzer </td><td> Agilent </td><td> G2939AA </td></tr><tr><td> Misal GFX PCR DNA ve Jel Band izolasyon kiti </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9034-70 </td></tr><tr><td> RiboMAX Büyük Ölçekli RNA Üretim Sistemi-T7 </td><td> Promega </td><td> P1300 </td></tr></tbody></table>

bulaşıcı mürin norovirüs ters genetik aracılı kurtarma

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

İnsan noroviruses insan gastroenterit (GE), dünya çapında çoğu sorumludur ve yakın kişiden kişiye temas 1, 2, kaçınılması mümkün olmayan ortamlarda tekrarlayan bir sorundur. Son yıllarda hastanelerde salgınların görülme sıklığında artış operasyonel kapasitesinin yanı sıra büyük ekonomik kayıpları önemli aksamalar neden bildirilmiştir. Yeni antiviral yaklaşımların belirlenmesi hücre kültürü 3 üretken bir enfeksiyon tamamlamak için insan noroviruses yetersizlik nedeniyle sınırlı kalmıştır. Yakın insan norovirüs 4 fakat ilgili bir kemirgen norovirüs (MNV), son dönemde izolasyon hücrelerine 5 yayılır edilebilir bu patojenler 6, 7 ve soruşturma için yeni yollar açtı. Yeni pozitif anlamda genomik ve alt genomik RNA moleküllerinin senteziyle in MNV replikasyon sonuçlar, bu sonuncusu son thi tekabülviral genomun rd (Şekil 1). MNV ORF1 genomunun en kaplar ve bir poliproteini prekürsör salınan yedi yapısal olmayan protein (NS1-7) kodlayan olan dört farklı açık okuma çerçeveleri (Orfs) içerir. ORF2 ve ORF3 alt genomik RNA bölge içinde ihtiva edilen ve kapsid proteinler (sırasıyla VP1 ve VP2), (Şekil 1) kodlayan edilir. Son zamanlarda, ORF2 örtüşen ek ORF4 belirlendi ancak farklı bir okuma çerçeve içinde fonksiyonel ve bir mitokondrial lokalize virulans faktörü (VF1) 8 kodlar var. Noroviruses dahil olmak üzere pozitif anlamda RNA virüsleri, çoğaltma için yeni bir kapağını açıp RNA genomu ile senteziyle sonuçlanır sitoplazması içinde yer alır. Viral çeviri teşvik etmek, virüsler hücresel protein sentezi makine 9-11 işe yönelik farklı stratejiler istifade eder. İlginçtir, norovirüs çeviri çok fonksiyonlu viral protein-astar VPG tarafından tahrik edilirkovalent genomik ve alt genomik RNA&#39;lar 12-14 hem 5 &#39;ucuna bağlanmış. Çeviri Bu sofistike mekanizması konvansiyonel ters genetik yaklaşımlarla viral toparlanmanın sınırlı verimliliği önemli bir faktör olması muhtemeldir. Burada mürin norovirüs-1&#39;in kuşak (ilişikte MNV olarak anılacaktır) 5 &#39;ucunda kapatılmış transkriptlerin göre iki değişik stratejiler rapor etmektedir. Ikinci yaklaşımın T7 RNA polimeraz ifade eden hücrelerdeki cDNA MNV transkripsiyonunu gerektirir, oysa yöntemlerden biri, in vitro ve in sentezi viral RNA&#39;nın kapaklama hem içerir. MNV çalışma ve küçük bir hayvan modeli için bu ters genetik sistemlerin kullanılabilirliği çoğaltma ve patogenezi 15-17 viral dizilerin rolünü incelemek için eşi görülmemiş bir yetenek sağlamıştır.

Noroviruses karakterizasyonu için gastroenterit henüz moleküler tekniklerin önemli bir nedeni vardır hala nispeten yeni. Burada fare norovirüs (MNV), hücre kültürü içinde yayılır edilebilir bu cinsin tek üyesi etkin kurtarma için iki farklı ters genetik yaklaşımlar rapor.

Bulaşıcı Mürin Norovirüs Ters Genetik Aracılı Kurtarma

İnsan norovirüsleri, dünya çapındaki insan gastroenteriti (GE) vakalarının çoğundan sorumludur ve yakın temasın olduğu ortamlarda tekrarlayan bir sorundur...

Bu prosedürün genel amacı, iki ters genetik sistem kullanarak enfeksiyöz mu göz nörovirüsü geri kazanmaktır. Merhaba, ben Imperial College of London'daki Viroloji bölümünden Armando Arias. Grubumuzda, nörovirüs replikasyonunun altında yatan moleküler mekanizmaları incelemekle ilgileniyoruz.Norovirüsler, gastroenteritin başlıca nedenlerinden biridir. Dünya genelinde karakterizasyonları için kullanılan moleküler teknikler hala nispeten yenidir. Hücre kültüründe üretken bir enfeksiyonu tamamlayamamaları nedeniyle, yeni antiviral yaklaşımların belirlenmesi ve norovirüs yaşam döngüsüne dair öngörüler sınırlı kalmıştır.Fareleri enfekte edebilen ve hücre kültüründe çoğalabilen bir antiviral olan mirror nörovirüsün yakın zamanda izole edilmesi, bu önemli patojenlerin araştırılması için yeni yollar açmıştır. Bu raporda, hücre kültüründe genetik olarak tanımlanmış nörovirüs izolatlarının üretilmesini sağlayan iki stratejiyi göstereceğiz. Her iki strateji de beş prime ucundan kaplanmış viral transkriptlerin üretilmesine dayanmaktadır.Birincisi, hücrelere transfeksiyondan önce viral RNA'nın in vitro sentezini ve kapsulanmasını içerir. İkinci yaklaşım ise T7 RNA polimeraz eksprese eden hücrelerin içinde MI nöroviral cDNA'nın transkripsiyonunu kapsar. Prosedür genel bakış. Kapsulanmış RNA transkriptlerinden nöronorovirüsün geri kazanımı için protokol, lineerizasyon ile başlatılır.mmv one için MV CD NA içeren plazmit kullanılır. Bu işlem NHE one restriksiyon enzimi ile gerçekleştirilir. DNA daha sonra T seven RNA polimeraz kullanılarak in vitro ortamda RNA'ya transkribe edilir.Ardından, M-M-V-R-N-A in vitro ortamında kapaklanır ve enfeksiyöz MMV'nin geri kazanımını sağlamak amacıyla hücrelere transfekte edilir; T7 RNA polimeraz eksprese eden FAL PX virüsü kullanılarak doğrudan transfekte edilen cDNA klonlarından enfeksiyöz MNV'nin geri kazanımı için hücreler önce rekombinant bir FAL PX virüsü ile enfekte edilir. FAL PX enfeksiyonu, T7 RNA polimerazın yanı sıra sentezlenen RNA'nın bir kısmını kapaklayabilen viral RNA kapaklama enzimlerinin ekspresyonu ile sonuçlanacaktır. Daha sonra M-M-V-C-D-N-A, lipid aracılı transfeksiyona yoluyla FPV enfekte hücrelere transfekte edilir. T7 RNA polimeraz ardından M-M-V-R-N-A'yı üretir ve bunların bir kısmı F-P-V-R-N-A kapaklama mekanizması tarafından kapaklanabilir.Bir ribozim dizisi, her RNA transkriptinin tanımlanmış bir 3' ucuna sahip olmasını sağlar. Kapaklanmış MMV transkriptleri, replikasyon öncesinde proteine çevrilecek ve bu durum yeni enfeksiyöz partiküllerin üretimine yol açacaktır. Enfeksiyöz MMV'nin geri kazanımı için RNA transkripsiyonu ve kapaklama protokolü ile enfeksiyöz kapaklanmış MMV transkriptlerinin sentezi.İlk olarak şu reaktifleri, transkripsiyon tamponu, nükleotidleri, suyu ve M-M-V-C-D-N-A içeren lineerize plazmidi karıştırın. Ardından reaksiyon karışımına RNA ve T seven RNA polimeraz ekleyin. Bu amaçla birçok ticari kit mevcuttur ve RNA sentezi için tekrarlanabilir bir yöntem sunar.Transkripsiyon reaksiyonu, karışımın en az iki saat boyunca 37 °C'de inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Bu transkripsiyon reaksiyonundan küçük bir miktarı denatüre edilmemiş agaroz jel üzerinde analiz edin. Öncelikle, jel ekipmanını deterjanla temizleyin ve kullanmadan önce RNase içermeyen su ile yıkayın.Agaroz jellerinin RNA'sız (RNase-free) reaktifler kullanılarak hazırlandığından emin olun. M-V-R-N-A, denatüre edilmemiş bir agaroz jelde yaklaşık üç kilobazda yürür. Ek olarak, RNA bütünlüğünü analiz etmek için hızlı bir yöntem sağlamak amacıyla bir Agilent bioanalyzer kullanılabilir.Ardından, birleşmemiş nükleotidleri uzaklaştırmak için RNA saflaştırılmalıdır. Birçok yöntem mevcut olsa da, bu protokolde maliyet etkin bir alternatif olarak RNA'yı lityum klorür çöktürme yöntemiyle saflaştırıyoruz; maksimum hızda 15 dakika santrifüj ederek RNA'yı pelet haline getiriyoruz. Yarı saydam pelete zarar vermemeye dikkat ederek süpernatantı uzaklaştırın ve %70 etanol kullanarak yıkayın.MMV transkriptini RNA saklama solüsyonunda yeniden süspanse edin ve tamamen çözündüğünden emin olun. RNA'nın 65 °C'ye ısıtılması daha sonra bu sürece yardımcı olabilir. RNA miktarını spektrometri ile belirleyin.Küçük bir alikotu %1'lik denatüre edilmemiş agroz jelde çalıştırarak RNA bütünlüğünü analiz edin. Görüldüğü üzere, capping verimliliğini artırmak için lityum klorür çöktürmesi sonrası RNA bütünlüğü aynı kalmalıdır. RNA'nın bir alikotunu 65 °C'de 10 dakika boyunca ısıtın.Tüpü derhal buz üzerine yerleştirin. Degradasyonu veya yeniden katlanmayı önlemek için, üreticinin önerdiği şekilde bir uç kapatma (capping) reaksiyon karışımı hazırlayın. Biz genellikle, 100 microliter nihai reaksiyona yaklaşık 60 micrograms M-N-V-R-N-A ekleriz.Reaksiyon ölçeği küçültülebilse de, karışımı iyice karıştırın ve 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin, ardından RNA'yı daha önce olduğu gibi lityum klorür çöktürmesiyle saflaştırın. Transfeksiyona geçmeden önce RNA bütünlüğünün tekrar kontrol edilmesi esastır. Ham hücrelere RNA elektroporasyonu ile MMV geri kazanımı için adım adım protokol.Resus.Ham hücrelerin bulunduğu flaskı DMEM içinde süspanse edin. Tek hücreli bir süspansiyon oluşturduğunuzdan emin olun. Trypan blue dışlama yöntemini kullanarak bir hemositometre yardımıyla canlı hücre konsantrasyonunu belirleyin.Hücreleri pelletleyin ve dikkatlice yeniden süspande edin. Hücreleri, transfeksiyon başına 8 milyon hücre olacak şekilde taze antibiyotiksiz besiyerinde süspande edin ve bir mikro santrifüjde pelletleyin. Besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri 500 µL PBS ile yıkayın, tekrar santrifüjleyin ve PBS'yi uzaklaştırın; hücreleri oda sıcaklığındaki 130 µL içerisinde yeniden süspande edin.Neon resüspansiyon çözeltisi. Genellikle 6 milyon hücre başına bir mikrogram RNA'ya denk gelecek şekilde, 130 mikrolitre hücre başına tipik olarak 1,3 mikrogram miktarda kaplanmış RNA ekleyin. Transkriptlerle karıştırılan hücreler, 100 mikrolitrelik neon transfeksiyon ucunda toplanır.Bu aşamada içeriye hava kabarcığı girmemesine büyük özen gösterilmelidir. Ardından, 1700 volt gerilimde 25 milisaniye boyunca tek bir darbe kullanarak elektroporasyon uygulayın. Hücreleri, 1 ml antibiyotiksiz besiyeri içeren bir ependorf tüpüne aktarın.Tüpteki hücreleri, %10 FCS içeren antibiyotiksiz DMEM bulunan bağımsız kuyucuklara dağıtın ve hücreleri 37 °C'de 24 ila 72 saat boyunca inkübe edin. MMV recovery, daha önce olduğu gibi BSR T7 hücrelerine RNA lipofeksiyonu ile gerçekleştirilir; CAP MMV transkriptleri, MMV cDNA plazmit LINEARIZATION, T7 polimeraz in vitro transkripsiyon ve in vitro capping yoluyla üretilir; ardından transkriptler BSR T7 hücrelerine lipofekte edilir. Bir BSR T7 hücre monokatmanını tripsinleyin ve altı kuyucuklu plaka kaplarına 7,5 × 10⁵ canlı hücre ekleyin.Hücreleri 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Medyumu hücrelerden uzaklaştırın ve yerine antibiyotik içermeyen 3 mL taze medyum ekleyin. Transfeksiyonun maksimum verimliliğini sağlamak için, 1-2 µg capped M-M-V-R-N-A'yı 100 µL optimum ile karıştırın.Ayrıca, 4 µL lipectomy 2000 ile 100 µL optimumu karıştırın. RNA ve lipectomy içeren örnekleri birleştirin ve pipetle 15 kez yukarı-aşağı çekerek iyice karıştırın. Karışımı 20 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.Ardından, capped MMV transkriptlerini içeren transfeksiyon komplekslarını damla şeklinde hücre monokatmanına ekleyin. Plağı dik yönlerde sallayın. Hücreleri 24 ila 72 saat boyunca inkübe edin.Daha önce açıklandığı üzere, T7 RNA polimeraz eksprese eden hücrelerdeki cDNA'dan enfeksiyöz MMV'nin doğrudan geri kazanımı için protokol. Bu protokol, yardımcı bir oxx virüsü ile enfekte edilmiş hücrelerde T7 RNA polimeraz ve oxx viral capping enzimlerinin ekspresyonuna dayanmaktadır. Ardından, T7 promotör kontrolü altındaki M-N-V-C-D-N-A hücrelere transfekte edilir.İlk olarak, hücre kültürü besiyerini uzaklaştırın ve her kuyucuğa, antibiyotiksiz besiyerinde seyreltilmiş 700 mikrolitre F pox virüsü ekleyin. Genellikle hücre başına yaklaşık 0,5 PFU'luk bir enfeksiyon çokluğu kullanılır; plakaları dik konuma getirin ve 37 derecede bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, iki mililitre antibiyotiksiz besiyeri ekleyin ve T7 RNA polimeraz ekspresyonu MNV CG NNA transfeksiyonu için hücreleri 37 derecede bir saat daha inkübe edin; enfekte hücrelerdeki besiyerini uzaklaştırın ve üç mililitre taze antibiyotiksiz besiyeri ekleyin.Önceki bölümde açıklandığı şekilde, bir mikrogram M-M-V-C-D-N-A ve lipectomy karışımı hazırlayın. Pipetleme yaparak iyice karıştırın. Tüpü 20 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin, ardından tekrar karıştırın ve hücre monokatmanına damla damla ekleyin.Plakayı dik yönlerde nazikçe sallayın. Bu video yayını boyunca gösterilen farklı ters genetik yaklaşımlarla enfektif MMV'nin geri kazanımını doğrulamak için hücreleri 37 °C'de 24 ila 72 saat boyunca inkübe edin; tekrarlanan dondurma-çözme işlemiyle hücrelerden enfektif varyonları serbest bırakın. Her örnekteki miktarı, TCID 50 veya plak analizi gibi standart prosedürler kullanarak belirleyin; temsilci sonuçlar aşağıdadır.mi Neurovirus'u incelemek için bu ters genetik sistemlerin mevcut olması, viral dizilerin doğal konakçıdaki nörovirus replikasyonu ve patogenezi üzerindeki rolünü çözümlemek için benzeri görülmemiş bir yetenek sağlamıştır. Bu videoda açıklanan her iki ters genetik yaklaşımı da, enfektif nöro ve nörovirusun hücre kültüründen geri kazanımı için oldukça verimlidir. Bu şekilde gösterildiği üzere.Sapekle yüklü MMV transkriptlerinin ham hücrelere veya BSRT7 hücrelerine transfeksiyondan sonra, 10⁵ TCID₅₀/ml'yi aşan enfeksiyöz MMV geri kazanılır. BSRT7 hücrelerine, önceden fowl pox virüsü yardımıyla enfekte edilmiş halde MMV-cDNA transfeksiyonu, 10⁴ TCID₅₀/ml'yi aşan viral titrelerle sonuçlanır. Ters genetik yaklaşımlarla elde edilen viral titreler, enfeksiyöz virüsten izole edilen RNA'nın transfekte edilmesiyle kurtarılan titrelerle benzerdir; bu durum, burada açıklanan ters genetik sistemlerin yüksek verimliliğini vurgulamaktadır.

reverse-genetics-mediated-recovery-of-infectious-murine-norovirus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Astar ve açık okuma çerçevesi 1 (ORF1)-ORF2 kavşak bölgesidir Norovirüs genomunun en korunmuş bölgeye özgü TaqMan probları kullanan çocuk tabureleri, gelen algılama ve Norovirüs izolatların genogroup belirlenmesi için Tek Adım RT-PCR nitelendirdi. Bir ticari olmayan, maliyet-etkin RNA ekstraksiyon yöntemi ayrıntılı olarak verilmiştir.

Taqman By Çocuk Tabureler gelen Noroviruses tespiti ve Genogrouping Tek aşamalı RT-PCR

Rift Vadisi ateşi virüs MP-12 aşı suşu için ters genetik sistemi ek MP-12 mutantlar artan zayıflama ve immünojenite oluşturmak için yararlı bir araçtır. Biz NSS mutant suşlar oluşturmak ve karakterize etmek için protokol açıklar.

Rift Vadisi Ateşi Virüsü Aşı Güvenliği ve Etkinliği Artırmak İçin MP-12 Gerinim NSS Gen işleyin Ters Genetik kullanma

Burada etkin hücre kültüründe çoğaltır yalnızca norovirusa olduğunu murin norovirusa (MNV), infeksiyöz partikül ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Plak tahlil murin makrofajlar için MNV en tropizm yararlanır ve MNV içeren biyolojik veya çevresel numuneler ile kullanım için adapte edilebilir.

Mürin Norovirüs için Plak Testi

Kaynak: Leuthold, M.M., ve diğerleri. X-ışını Kristalografisi için E. coli'de İnsan Norovirüs Çıkıntılı Alanlarının Üretimi. J. Vis. Uzm. (2016).Bu video, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak rekombinant insan norovirüs P alanının saflaştırılmasını gösterir ve hedef proteinin diferansiyel gözenek erişilebilirliğine dayalı olarak daha yüksek ve daha düşük moleküler ağırlıklı safsızlıklardan ayrılmasını vurgular. Proses, UV absorbansı ile izlenir ve ayrıştırılan fraksiyonların SDS-PAGE...

İnsan Norovirüsünün Bakteri Kaynaklı Rekombinant P Alanı Proteinlerinin Saflaştırılması

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

Klonlanmış cDNAs, gibi genetik tersine adlandırılan bir yaklaşım, gelen rekombinant arenaviruses kurtarma araştırmacılar arenavirus biyolojisi birçok farklı yönlerine, spesifik viral gen ürünlerinin rolü, hem de onların farklı özel etki ve kalıntılarının katkısını araştırmak için izin verir . Benzer şekilde, insan patojen arenaviruses mücadele etmek için etkili ve güvenli aşıların üretimi için yeni olanaklar sağlar aşı geliştirilmesi için FDA onaylı hücre çizgileri (Vero) bölgesindeki genetik...

FDA onaylı Vero hücrelerinde Aşı Geliştirme için bir araya getiren Arenavirus üretimi

Newcastle hastalığı virüsü (NDV) yaygın olarak, diğerleri arasında, aşı ve tedavi için yeni vektörler geliştirmek için, son birkaç yıl içinde incelenmiştir. Bu çalışmalar nedeniyle bu tür burada açıklandığı gibi rekombinant virüs cDNA'sından kurtarmak için teknikler, mümkün olmuştur.

CDNA&#39;dan rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Rescue

Burada, ters transkripsiyon-kantitatif PCR kullanarak çevresel ve içme sularında enterovirüs ve norovirüsü ölçmek için bir prosedür sunuyoruz. EPA Metodu 1615'ten alınan bu standardize prosedürle yeraltı sularından ortalama virüs geri kazanımı, poliovirüs için %20 ve murin norovirüsü için %30 idi.

Enterovirüs Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Method 1615 Ölçümü. Bölüm III. RT-qPCR Virüs Algılama

Viral genom amplifikasyon kullanan rutin algılama yöntemleri bulaşıcı olmayan parçacıklar bulaşıcı ayırımcılık için kendi yetersizlik tarafından sınırlıdır. Bu makalenin amacı, aptamer bağlama, dinamik ışık saçılma ve transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak bulaşıcı norovirus parçacıkların ayrımcılık yardım etmek alternatif yöntemler detaylı protokollerde sağlamaktır.

Viral kapsid yapısal bütünlük belirlenmesi için alternatif Vitro yöntemleri

Plazmid DNA'sından rekombinant rotavirüslerin üretimi, rotavirüs replikasyonu ve patogenezinin incelenmesi, rotavirüs ekspresyonu vektörleri ve aşılarının geliştirilmesi için gerekli bir araçtır. Burada, floresan muhabir proteinleri ifade eden suşlar da dahil olmak üzere rekombinant rotavirüsler imal etmek için basitleştirilmiş bir ters genetik yaklaşımını tanımlıyoruz.

Rekombinant Rotavirüsleri İyileştirmek Için Basitleştirilmiş Ters Genetik Yöntemi Muhabir Proteinleri İfade Ediyor

Bu protokolün amacı ökaryotik patojen insan norovirüsünün bakterilere bağlanmasını ölçmektir. İlk virüs-bakteri eki testi yaptıktan sonra, akış sitometrisi popülasyon içinde viral bağlı bakterileri tespit etmek için kullanılır.

Akış Sitometrikullanarak Commensal Bakterilere Bağlanan İnsan Norovirüs Benzeri Partiküllerin Ölçülmesi

Keşfedin, ters genetik yöntemlerle hücre kültüründe bulaşıcı murin norovirus (MNV) kurtarma tekniklerini. Bu protokoller, norovirus replikasyon ve patogenez araştırmaları için genetik olarak tanımlı viral izolatlar oluşturmayı sağlar.

Bulaşıcı Mürin Norovirüs Ters Genetik Aracılı Kurtarma

Daha fazla video keşfet