Name: Hastalık Patogenez Eğitim için Bir Araç Olarak Nöronlar içine Antikor Transfeksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Keşfedin, nöronlara antikor transfeksiyonu ile nörolojik hastalık patogenezinde antikor etkileşimlerini hızlıca inceleyin. Bu yöntem, immünofloresan mikroskopi kullanarak nöroimmünoloji araştırmalarında değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Araştırma ve Geliştirme Dairesi, Tıbbi Araştırma Servisi, Gazi İşleri Bakanlığı tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma bir VA Liyakat İnceleme Ödülü (MCL) ve Tennessee Sağlık Bilimleri Merkezi Multipl Skleroz Araştırma Fonu Üniversitesi tarafından finanse edildi.

1. Antikor Etiketleme (Şekil 1) <ol><li> 0.1 M NaHCO3 tampon yapın: <ul type="circle"><li> 8.4 g NaHCO 3 </li><li> 29.2 g NaCl </li><li> 1 litre H2O </li></ul></li><li> Bu çözelti (10.6 gr Na 2 CO 3, 29.2 g NaCl, 1 litrelik 2 H 0) ile 8.4 arasında bir pH değerine tampon getirin. </li><li> 70 ul anti-hnRNPA1 ve 500 ul NaHCO 3 tamponu ile 35 ul Atto550 NHS ilave edin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca döndürmek. Saat süren dönüş sonra bir diyalizer karışımı içine enjekte ve geceleme PBS 2 litre dialyze. </li><li> Ertesi gün, bir spin kolon (Amicon Ultra 0.5) kullanarak anti-hnRNPA1 diyalizlenmiş Atto550 NHS konsantre. </li><li> Atto550 NHS anti-hnRNPA1 antikor konsantre edilmiş etiketlenmiş sonra, nano-bırakma örnek konsantrasyonunun belirlenmesi. </li></ol> 2. Antikor Transfeksiyon (Şekil 2) <ol><li> Dulbecc Tohum 10 5 hücre / 500 içine ulönce transfeksiyon için 8 sıra slayt 24 saat içinde o Modifiye Kartal Orta (DMEM/F12 +10% FBS +1% antibiyotik). Hücre konfluense en az% 70 olması gerekir. </li><li> Yirmi dört saat tohumlama sonra, bir Eppendorf tüp içine Ab-deliverin reaktifi 2 ul ekleyin. </li><li> Sonra aynı Eppendorf tüp anti-hnRNPA1 antikoru etiketli Atto550 NHS 2 mikrogram (0.5 mikrogram / ul) ekleyin ve oda sıcaklığında 10-15 dk inkübe. </li><li> İnkübasyon sırasında, medya aspire ve hücre taze DMEM ortam 394 ul ekleyin. </li></ol> Not: bir kontrol olarak hareket etmek bakir hücrelerden birinin odasına 500 ul DMEM ekleyin. <ol start="5"><li> İnkübasyondan sonra, antikor karışımı, 100 ul DMEM eklemek için aşağı yukarı ve pipetleme ile karıştırmak, ve 500 ul toplam hacim için DMEM içinde hücrelere ilave edin. </li><li> Antikor teslimat 48 saat sonra ortamı değiştirin. </li></ol> Not: Protokol FITC pozitif kontrol olarak Rigg etiketli ile yinelenmiştir. 3. Verimlilik Belirlenir Canlı ve Sabit Görüntüleme <ol><li> Görüntü hücreler görüntü transfekte Atto550 NHS etiketli antikorlar bir floresan mikroskop Cy3 filtre kullanarak 48 saat canlı. </li><li> Canlı görüntüleme tamamlandıktan sonra, medya ve düzeltme hücreleri aspire. </li><li> Ortam aspire sonra, oda sıcaklığında 15 dakika için% 0.4 paraformaldehid ile hücrelerin tedavi. Hücreler 4 x 5 dk her PBS ile yıkayın. Sonra, DAPI reaktif ve düzeltme lamel içeren montaj medya ile hücreler monte. Axiovision yazılım ile sabit hücrelerin transfeksiyon etkinliği ölçün. Axiovision yazılımı taraftan değilse, sadece 3.7 &#39;de hesaplama içine el ve fiş sonuçları ederek görüntü olayları saymak. Alternatif olarak, ImageJ yazılım Bu hesaplamalar için de kullanılabilir. </li><li> Birincisi, 20x büyütmede seçtiğiniz görüntü hücrelerinin toplam sayısını saymak için &quot;Olaylar&quot; ölçümü kullanın. </li><li> Sonraki değildi hücreleri saymak &quot;Olaylar&quot; ölçümü kullanınbaşarıyla aynı 20x büyütme görüntü antikorlar ile transfekte. </li><li> Excel tarzı biçiminde ölçülen &quot;Olaylar&quot; a erişmek için, &quot;Özellikler&quot; üzerine tıklayın &quot;Ölçüm&quot; sekmesini tıklatın ve görüntülemek için tıklatın &quot;Tablo gibi.&quot; </li><li> Son olarak, iki önceden ölçülen olayları karşılaştırarak transfeksiyon verimliliği belirlemek için aşağıdaki hesaplamayı kullanın: ((Toplam hücreleri - Untransfected Hücreleri) / Toplam Hücreler) x 100 = Transfeksiyon Verimliliği. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Untransfected ve canlı görüntüleri (Şekil 3A) transfekte (Şekil 3B) nöronlar göre antikor etiketleme (her resimde kırmızı veya yeşil) açıkça hücreleri (Şekil 3B, C, D) içinde gözlenen olduğunu ortaya koymaktadır. Aspirasyon sonra ve antikorlar arasında veya hücre yüzeyine yapışık çıkarmak için ortam ile yıkama, etiketlenmiş antikor yine de nöron (Şekil 3C, D) içinde mevcut bulunmaktadır.<html> Transfeksiyon verimliliği hesaplamak için başarıyla transfekte değildi hücrelere göre toplam hücreleri hesaplamak için Axiovision yazılımı kullanın. Bu değerler, toplam hücrelerin yüzdesi (Şekil 4) ve transfeksiyon etkinliğini elde etmek için bir transfeksiyon etkinliği formül girilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig1.jpg" /> Şekil 1. Atto 550 NHS ester ile etiket antikorlar için kullanılan prosedürleri akış şeması etiketli antikorlar konsantre için gerekli adımları izledi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4154/4154fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4154/4154fig2.jpg" /> Şekil 2. Kültür canlı hücrelerin içine etiketli antikorlar transferinde kullanılan prosedürlerin Akış diyagramı.arge.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig3.jpg" /> Şekil 3. Transfekte nöronlar 48 saat aşağıdaki transfeksiyon görüntüleri canlı. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4154/4154fig4.jpg" /> Şekil 4,. Transfeksiyon etkinliği belirlemek için sayıldı olaylar ile Resimler sabit ve durulanır.

<ol><li>Burkhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope-specific+recognition+of+type+II+collagen+by+rheumatoid+arthritis+antibodies+is+shared+with+recognition+by+antibodies+that+are+arthritogenic+in+collagen-induced+arthritis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse.</a> Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).</li>
<li>Chester, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambert-Eaton+syndrome+antibodies%3A+reaction+with+membranes+from+a+small+cell+lung+cancer+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft.</a> J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).</li>
<li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTLV-1+induced+molecular+mimicry+in+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).</li>
<li>Reeves, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+lupus+erythematosus.+Antibodies+to+DNA%2C+DNA-binding+proteins%2C+and+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Rheum.+Dis.+Clin.+North+Am%22%5BJournal%5D)">Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones.</a> Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).</li>
<li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmunity+due+to+molecular+mimicry+as+a+cause+of+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of neurological disease.</a> Nat. Med. 8, 509-513 (2002).</li>
<li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+that+recognize+functional+domains+of+hnRNPA1+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies that recognize functional domains of hnRNPA1 implicate molecular mimicry in the pathogenesis of neurological disease.</a> Neurosci. Lett. 401, 188-193 (2006).</li>
<li>Kalume, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mimicry%3A+cross-reactive+antibodies+from+patients+with+immune-mediated+neurologic+disease+inhibit+neuronal+firing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing.</a> J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).</li>
<li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reactivity+between+immunodominant+human+T+lymphotropic+virus+type+I+tax+and+neurons%3A+implications+for+molecular+mimicry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry.</a> J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).</li>
<li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+link+between+autoimmunity+and+neurodegeneration+in+immune-mediated+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).</li>
<li>Smeenk, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinuclear+antibodies%3A+cause+of+disease+or+caused+by+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease.</a> Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).</li>
<li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+glycosylation+of+target+proteins+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+HTLV-1+associated+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).</li>
<li>Reisinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+transfection+of+CHO+cells+with+chemically+defined+transfection+systems+and+investigation+of+their+potential+for+transient+and+stable+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection.</a> Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).</li>
<li>Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-mediated+intracellular+delivery+of+antibodies+into+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells.</a> Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).</li>
<li>Radic, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+P2+is+an+autoantibody+target+in+mice+deficient+for+Mer%2C+Axl%2C+and+Tyro3+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases.</a> J. Immunol. 176, 68-74 (2006).</li>
<li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+%27passive+transfer%27+of+paraneoplastic+stiff+person+syndrome+with+antibodies+to+an+intracellular+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen.</a> Brain. 133, 3164-3165 (2010).</li>
<li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiff%2C+twitchy+or+wobbly%3A+are+GAD+antibodies+pathogenic%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic.</a> Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).</li>
<li>Magrys, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+anti-alpha-enolase+autoantibodies+in+pathogenicity+of+autoimmune-mediated+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy.</a> J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).</li>
<li>Geis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiff+person+syndrome-associated+autoantibodies+to+amphiphysin+mediate+reduced+GABAergic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition.</a> Brain. 133, 3166-3180 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Özel moleküller ve bunların ekspresyon hipotezi test etmek için, genler ve diğer vektörler genel olarak hücre içine transfekte edilir. Bu işlemin özgün yönü kolaylıkla hedef hücre içine transfekte etmek için antikorlar yeteneğidir. Biz beş ayrı deneylerde çiftleri her bu yöntemi uygulandı. Transfeksiyon verimliliği sonuçları tüm deneyler arasında benzer olarak bulundu. Önemli olarak, yöntem, antikor yapısı veya fonksiyonu değiştirmeden hücre içine antikorların giriş sağlar. Ayrıca, canlı nöronlar floresan mikroskobu kul...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> Floresan Mikroskop AxioObserver A1 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Axiovision sürüm 4.2 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Anti-rhnRNPA1 </td><td> Abcam </td><td> Ab4791 </td></tr><tr><td> FITC etiketli anti-Rigg </td><td> OZ Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> Atto550 NHS ester </td><td> Sigma </td><td> 92835 </td></tr><tr><td> Ab-deliverin </td><td> OZ Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 +10% FBS +1% antibiyotikler </td><td> Gibco </td><td> 11320-033 </td></tr><tr><td> Poli-D-Lizin 8 oyuklu kültür Slaytlar </td><td> BD </td><td> 354632 </td></tr><tr><td> Çok Amaçlı Döndürücü </td><td> Bilimsel Industries A.Ş. </td><td> Model 151 </td></tr><tr><td> DAPI Montaj Medya </td><td> Millipore </td><td> S7113 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Ambion </td><td> 9626 </td></tr><tr><td> Diyalizer </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> 66380 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-0.5 </td><td> Millipore </td><td> UFC501096 </td></tr><tr><td> Paraformaldehit (% 4 çözelti) </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimleri </td><td></td></tr><tr><td> Nano-Bırak </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td></td></tr></tbody></table>

hastalık patogenez eğitim için bir araç olarak nöronlar içine antikor transfeksiyon

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Antikorlar canlı sistemlerde meydana gelen çeşitli olaylar içine roman fikir edinmek için yeteneği sağlar. Hedef proteinlere yüksek oranda spesifik antikorlar üretmek için yeteneği ele alınması gereken çok hassas biyolojik soruları için izin verdi. Önemlisi, antikorlar sistemik lupus eritematozus (SLE), romatoid artrit (RA), paraneoplastik sendromlar, multipl skleroz (MS) ve insan T-lenfotropik virüsü tip 1 (HTLV-1) de dahil olmak üzere insan hastalıklarının bir dizi patogenezinde oylandı myelopati / tropikal spastik paraparezi (HAM / TSP) 1-9 ilişkilidir. Antikorları hastalığın soruşturma alanıdır ve veri antikorlar ve enflamasyon çeşitli intrasellüler moleküllerin sonuçlar arasındaki etkileşimler, hücresel mesajlaşma ve apoptoz 10 değişmiş olduğunu göstermektedir neden nasıl. MS HAM ve / TSP olan hastalarda hücre içi RNA bağlayıcı protein heterojen ribonuclear protein antikorları üretmek için gösterilmiştir A05-07 Ocak (hnRNP A1) 3, 9, 11. Son veriler içi nöronal ve yüzey antijenleri hem antikor patojenik 3, 5-9, 11 olduğunu göstermektedir. Böylece hücre içi antikor çalışması için izin veren bir prosedür: protein etkileşimleri hastalığı patogenezinde büyük fikir ödünç verirdim. Genler genellikle birincil hücreler ve kültür hücre hatları transfekte edilir, hücre içine antikorların Ancak transfeksiyon antikor yapısı veya kötü transfeksiyon verimliliği 12 değiştirilmesi engellendi. Transfeksiyondan diğer yöntemler, katyonik lipozomlar (DOTAP / DOPE) ve destek polyethylenimines (PEI) göre antikor transfeksiyonu içerir; kontroller ile karşılaştırıldığında, 12 antikor transfeksiyon içinde bir on-kat azalmaya yol, her ikisi de. Bu çalışmada gerçekleştirilen yöntem katyonik lipid-aracılı yöntemler ile benzerdir ve yoluyla antikorları ile kovalent olmayan kompleks oluşturmak için bir lipid bazlı mekanizmasını kullanır elektrostatik ve hidrophobic etkileşimleri 13. Biz non-kovalent elektrostatik ve hidrofobik etkileşimler yoluyla antikor yakalama ve hücrelerin içinde onları sunma yeteneğine bir lipid formülasyonu Ab-deliverin reaktifi kullanılmıştır. Böylece kimyasal ve genetik bağlantıları canlı hücrelerin içine fonksiyonel antikorlar teslimatı için gerekli değildir. Protein etkileşimleri 9: Bu yöntem, bize çeşitli antikor proteini yerelleştirme deneyler, hem de hücre içi antikor moleküler sonuçlarının analiz izleme ve gerçekleştirmek için sağladı. Bu protokol, biz hızla çoğaltıcı ve transfeksiyon verimliliği yüksek derecede nöron içine antikorlar transfekte nasıl gösterecektir. Örnek olarak, anti-hnRNP A1 ve anti-IgG antikorları kullanır. Transfeksiyon etkililiği, kolay ölçülmesi için biz Atto-550-NHS ve FITC-etiketli IgG ile etiketli anti-hnRNP A1 antikorları kullanılmıştır. Atto550 NHS yüksek moleküler absorbsiyon ve kuantum yi yeni bir etiketsaha. Uyarma kaynağı ve Atto550 için floresan filtreleri Cy3 (Örn. 556 Em. 578) benzer. Buna ek olarak, yüksek Atto550 fotostabilite sahiptir. FITC-etiketli IgG bu yöntem bağımlı boya çok yönlü ve olmadığını göstermek için bir kontrol olarak kullanıldı. Bu yaklaşım ve oluşturulan verilerin hedef antijenleri hücre içi antikorların insan hastalıklarının patogenezinde rolü olabileceği rolü anlaşılmasına yardımcı olacaktır.

Etkileşimleri ve hücre içi bir ortam içinde antikorların varlığı ile ilgili moleküler mekanizmalar üzerinde etkisi incelemek için hızlı bir yaklaşım tarif edilmektedir. Yöntem, bir lipid formülasyonu dayanan bir kovalent olmayan kompleks oluşumu kullanılarak canlı hücreler içine transfekte antikor içerir. Bu teknik, ölümsüzleştirilmiş hücre kültürleri ve primer hücreler için uyarlanabilir.

Hastalık Patogenez Eğitim için Bir Araç Olarak Nöronlar içine Antikor Transfeksiyon

Antikorlar, canlı sistemlerde meydana gelen çeşitli olaylara dair yeni bakış açıları kazanma imkanı sağlar. Oldukça spesifik ... üretme yeteneği ...

Bu prosedürün amacı, antikorların, nöronal fonksiyonla ilgili oto moleküler mekanizmaların ve nörolojik hastalıkların patogenezinin nasıl olduğunu araştırmak için hızlı ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunmaktır. İlk olarak antikorlar, ATO five 50 NHS floresan etiketiyle işaretlenir. Ardından antikorlar, transfeksiyon reaktanıyla karıştırılır ve nöronal hücrelere transfekte edilir.Kültürde, transfeksiyondan 48 saat sonra nöronlar DPI medyumu ile sabitlenip monte edilir ve immünofloresans mikroskobu ile görüntülenir. Transfeksiyon verimliliği, görüntüleme yazılımı kullanılarak hesaplanabilir. Bu yöntem, otoantikorların nöronal fonksiyonla ilgili moleküler mekanizmaları ve immün aracılı nörolojik hastalıkların patogenezini nasıl değiştirdiği gibi nörobilim ve nöroimmünolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu yöntem için ilk fikri, nöronlarda aşırı eksprese edilen h ve RPA 1 ve RNA bağlayıcı proteinlere karşı gelişen antikorların nörodejenerasyon mekanizmasına katkıda bulunduğu hipotezini test etmek istediğimizde edindik; prosedürü lisansüstü öğrencisi Josh Douglas gerçekleştirecektir. Prosedüre başlamadan önce, deneylerden bir gün önce, kuyuk başına 100.000 hücre olacak şekilde ekilmiş ve en az %80 konfluense ulaşmış, yüksek kaliteli ve sağlam nöronal hücrelerin hazır olduğundan emin olun. Analiz gününde, hücrelerin sağlıklı olduğunu doğrulamak için gözlem yapın.Bir litre su içerisinde 8,4 gram sodyum bikarbonat ve 29,2 gram sodyum klorürü karıştırarak 0,1 M sodyum bikarbonat tamponu hazırlayarak başlayın. Ardından, tamponun pH değerini 8,4'e ayarlayıp 500 µL tampon alın. Bu durumda transfekte edilecek antikor olan anti H-N-R-N-P-A one'dan 70 µL ve etiketleme reaktifi olarak oh five 50 NHS'den 35 µL ekleyin.Çözeltiyi oda sıcaklığında bir saat boyunca döndürün, ardından bir diyalizöre enjekte edin ve dört °C'de gece boyunca iki litre PBS içinde diyalize edin. Ertesi gün, diyalize edilmiş işaretli antikoru konsantre etmek için bir spin kolon kullanın. Son olarak, bir NanoDrop spektrofotometre kullanarak antikor konsantrasyonunu belirleyin.Sekiz kuyucuklu bir lamda, 500 µL komple DMEM hacmindeki her kuyucuğa 10.000 hücre ekleyin. Hücreleri 37 °C'de gece boyunca veya hücre konfluens seviyesi en az %70'e ulaşana kadar inkübe edin. Hücreler %70 konfluense ulaştığında işleme başlayın; iki µL antikor, transfeksiyon reaktifleri ve 0,5 µg/µL konsantrasyonda iki µg işaretli antikoru bir Eppendorf tüpünde karıştırın ve çözeltiyi oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika inkübe edin.Bu sırada, hücre kültürü kuyucuklarındaki SUP natum'u uzaklaştırın ve her kuyucuğa tam olarak 394 µL taze besiyeri ekleyin. Transfeksiyon çözeltisi hazır olduğunda, 100 µL DMEM ekleyin ve pipetle aşağı yukarı hareket ettirerek karıştırın. Ardından, hücre içeren her bir kuyucuğa, kuyucuk başına toplam hacmi 500 µL olacak şekilde tam olarak 106 µL transfeksiyon karışımı ekleyin.Antikor yerine DMEM eklenen bir UNT TRANSFECTED negatif kontrol kuyuğu eklediğinizden emin olun. Hücreleri 37 °C'de 48 saat inkübe edin. Bu inkübasyonun ardından, besiyerini taze DMEM ile değiştirin ve işaretlemeden 48 saat sonra floresan mikroskop kullanarak canlı görüntüleme yapın.ATO five 50 NHS etiketli antikorları görselleştirmek için, canlı görüntülemeden sonra SI three filtresini kullanın, medyumu aspire ederek uzaklaştırın ve %4 paraldehit ekleyip lamı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe ederek hücreleri sabitleyin. Hücreler sabitlendikten sonra, her yıkama için PBS içinde beş dakikalık bir inkübasyon süresi tanıyarak hücreleri dört kez PBS ile yıkayın. Ardından PBS'yi uzaklaştırın ve DPI içeren bir damla kapatma medyumu ekleyin.Floresan mikroskobu kullanarak her bir kuyucuktaki hücrelerin üzerine nazikçe bir kapatma lamı yerleştirin. Hücrelerin görüntülenmesine başlayın. Bu deneyde, ATO five 50 NHS ile işaretlenmiş anti H-N-R-N-P-A one antikorları ile başarıyla transfekte edilmiş nöronların canlı floresan hücre görüntülemesini gerçekleştirdik.Bu görüntü; sitoplazma nöronal çıkıntılar dahil olmak üzere nöronal hücreler içindeki antikorların yanı sıra çekirdek fiksasyonunu ve çekirdek boyamasını göstermektedir. Burada mavi renkte gösterilen DPI'nın kullanılması, transfekte edilen hücre sayısının toplam hücre sayısına bölünmesiyle transfeksiyon verimliliğinin belirlenmesine olanak tanır. Bu prosedür takip edildiğinde, bu vakadaki verimlilik %50'dir.Hücresel organeller içindeki antikorların kolokalizasyonunun yanı sıra, nöronal fonksiyon ve bütünlükteki değişikliklerin hedef antigene yönelik antikor özgüllüğü ile ilişkisini belirlemek gibi ek soruları yanıtlamak için immünositokimya, RNA ekstraksiyonu, mikroarray analizi ve western blot gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoda, antikorların floresan bir etiketle nasıl markalanacağını, floresan işaretli antikorlarla transfeksiyon reaktifi kompleksinin nasıl hazırlanacağını, nöronların nasıl transfect edileceğini ve transfeksiyon verimliliğinin nasıl hesaplanacağını gösterdik. Bu yöntem, otoantikorların canlılık, apoptoz ve nöronal transport gibi hücresel fonksiyonların yanı sıra nöronal fonksiyonla ilgili moleküler mekanizmalar ve nörolojik hastalıkların patogenezi üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesinde faydalıdır.

antibody-transfection-into-neurons-as-tool-to-study-disease

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, protein agregasyonunu incelemek için sarı floresan proteini (YFP) ile etiketlenmiş mutant bir insan tau proteinini kodlayan bir lentivirüs ile insan nöronal hücrelerinin dönüştürülmesi sürecini göstermektedir. Nöronlarda görünür sitoplazmik tau agregatlarının oluşumuyla sonuçlanan viral girişten mutant tau ekspresyonuna kadar olan adımları ana hatlarıyla belirtir.

Tau Protein Agregasyon Analizi için İnsan Nöronlarının Lentiviral Aracılı Transdüksiyonu

Burada, adeno-ilişkili virüsün yenidoğan fare beynine intraventriküler enjeksiyonu ile yaygın nöronal transdüksiyon için bir teknik gösteriyoruz.  Bu yöntem, viral olarak verilen transgenlerin yaşam boyu ekspresyonunu elde etmek için hızlı ve kolay bir yol sağlar.

Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon

Protein ekspresyonunu kontrol etmek sadece yaşayan her organizma için gerekli değildir, aynı zamanda hücresel modellerde protein fonksiyonlarını araştırmak için de önemli bir stratejidir. Sunulan protokol, primer hipokampal nöronlar dahil olmak üzere memeli hücrelerinde antikor girişiminin uygulanmasını gösterir ve protein fonksiyonunun incelenmesinde üç boyutlu rekonstrüksiyonların kullanımını gösterir.

Incelenmesi Protein Fonksiyonu ve Antikor Girişim ve üç boyutlu Rekonstrüksiyonunda tarafından değiştirilmiş Protein Ekspresyonu Rolü

Bu el yazması, viral vektör aracılı yerel gen iletiminin, merkezi sinir sistemindeki transgenleri ifade etmek için nasıl çekici bir yol sağladığını açıklamaktadır.  Protokol, Parkinson hastalığı için viral vektör tabanlı bir hayvan modeli geliştirmek için sıçanın substantia nigra'sında bir viral vektör enjeksiyonu gerçekleştirmek için tüm önemli adımları özetlemektedir.

Bir rekombinant adeno-ilişkili viral vektörün stereotaktik enjeksiyon yoluyla Parkinson Hastalığı için bir alfa-sinüklein Bazlı Fare Modeli Geliştirme

Recombinase bağımlı rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) kesici enjeksiyon herhangi bir genetik olarak etiketli hücre tipi spinal kord işlemek için kullanılabilir. Burada biz lomber spinal kord dorsal boynuz nöronlarda transduce anlatan. Bu teknik işlenmiş nöron alt türündeki fonksiyonel sorgulama sağlar.

Omurilik genetik olarak tanımlanmış nöronlar Adeno ilişkili virüs-aracılı Transgene ifade

Bu iletişim kuralı, Alfa-synuclein oluşumu çoğaltır hücre tabanlı bir sistem içinde vivoagrega sağlamak için hedeftir. Hücre içi Alfa-synuclein kapanımlar birincil nöronlarda tarafından içselleştirilmesi numaralı seribaşı ve eksojen yayılması hastalıklı Alfa-synuclein transgenik fareler izole yerli microsomes ilişkili Alfa-synuclein toplamları yönetilen.

Microsomes ilişkili Alpha-synuclein toplamları için birincil nöronlar eksojen yönetim olarak güçlü hücre modeli liflerinde oluşumu

Bu teknik amacı birincil motoneurons (MNs) fare omurilik üzerinden zenginleştirilmiş kültürünün hazırlamaktır. Tarif MN hastalıklar neden mutasyonlar sonuçlarını değerlendirmek için biz burada bu yalıtım MNs ve onların transfection magnetofection tarafından izole.

Fare birincil Motoneurons Transfecting tarafından Charcot Marie Tooth hastalığı Vitro modelleme

Bu protokol, insan nöronal kültürlerin mutant insan Tau için lentiviral yapıları ile dönüştürücü olduğu bir prosedür ayrıntıları. Traned kültürler Tau toplamları ve ilişkili patolojileri görüntüler.

Tau Aggregation Lentiviral kullanarak eğitim için bir In vitro modeli-ınsan nöronların aracılı dönüştürücü

Otoimmün ensefalit, merkezi sinir sisteminin antikor aracılı hastalıklarının yeni bir kategorisidir. Hipokampal nöronlar bu antikorları keşfetmek ve karakterize etmek için kullanılabilir. Bu makalede, hastaların serum ve beyin omurilik sıvısındaki otoantikorları belirlemek için primer hücre kültürü ve immün boyama için bir protokol sunulmaktadır.

Otoimmün Ensefalitte Yer Alan Yeni Patojenik Antikorları Tespit Etmek ve İncelemek için Hipokampal Nöronal Kültürler

Burada, aksonal taşıma üzerindeki patolojik protein kaynaklı etkileri analiz etmek ve bu etkilere aracılık eden mekanik yolları belirlemek için primer hipokampal kemirgen nöronlarının transfeksiyonunun canlı hücre konfokal görüntüleme ile nasıl birleştirileceğini gösteriyoruz.

Primer hipokampal nöronlarda patolojik proteinlerin aksonal taşıma üzerindeki etkilerini ölçmek için canlı hücre görüntülemenin kullanılması

Keşfedin, nöronlara antikor transfeksiyonu ile nörolojik hastalık patogenezinde antikor etkileşimlerini hızlıca inceleyin. Bu yöntem, immünofloresan mikroskopi kullanarak nöroimmünoloji araştırmalarında değerli bir araç sunar.

Hastalık Patogenez Eğitim için Bir Araç Olarak Nöronlar içine Antikor Transfeksiyon

Daha fazla video keşfet