Substantia nigra ve ventral Tegmental Bölgesi Dopamin Yönetmelik Kapsamlı Profilleme

Bu prosedürün genel amacı, orta beyin bölgesinin somatodendritik bölgelerinden alınan tek bir doku diseksiyonu ile dopamin düzenlemesiyle ilişkili moleküler okumaların bilgisini maksimize etmektir. Bu, öncelikle substantia nigra'yı ventral segmental alandan ayırmak için hassas bir diseksiyon yapılarak gerçekleştirilir. İkinci adım, dokuların HPLC ile dopamin analizi için işlenmesi ve çökeltilmiş endojen proteinin analiz için daha ileri düzeyde işlenmesidir.

Ardından, çöktürülmüş proteinin toplam protein içeriği için işlenmesi, örnekteki dopamin doku içeriği okumasıyla birlikte hangi dopamin düzenleyici proteinlerin veya protein fosforilasyonunun ölçülebileceğinin belirlenmesine olanak tanır. Nihayetinde, orta beynin ayrı somatodendritik bölgelerindeki dopamin ve onu düzenleyen proteinlerin analizleri, dopamin düzenlemesi ile ilişkili moleküler mekanizmalara dair sonuçlar çıkarılmasına imkan sağlar.

Monoaminler birçok davranışsal sonucu etkiler ve nitekim bağımlılık, biyoloji ve özellikle Parkinson hastalığı gibi lokomotor disfonksiyon alanlarında çalışan araştırmacılar, laboratuvarımda incelediğimiz dopamin gibi monoaminlerin davranışsal sonuçları nasıl etkilediğiyle yakından ilgilenmektedirler. Ancak, monoaminlerin moleküler düzeyde nasıl düzenlendiğini anlarsak, onları çalışmanın önemi daha da belirginleşecektir. Tekniğimizin sağladığı avantaj, MSS dokusundan elde edilen tek bir örnekten birden fazla veri okuması alabilmemizdir; böylece moleküler olayların monoaminlerin düzensizliğini nasıl etkilediğine dair kapsamlı bir veri seti elde edebiliriz.

Bu verileri alarak davranışın nasıl etkileneceği bağlamına yerleştirebiliriz. Genellikle, bu yöntemde yeni olan bireyler zorluk çekecektir; çünkü protein ve fosforilasyon tayini, araştırmacı tarafından seçilen antikorlara bağlı olarak doğru bir okuma için ne kadar toplam proteine ihtiyaç duyulacağına dair bilgi gerektirir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir.

Diseksiyon teknikleri ve düzenleyici proteinlerle beraber mono ortalamaların belirlenmesi, in vivo düzenlemenin analizine yönelik nispeten yeni bir yaklaşımdır. Bu prosedüre başlamak için, kemirgen beyin matrisini, beş adet jilet ve 11 numara bir skalpel içeren bir Petri kabını ıslak buz üzerinde soğutun. Ayrıca, diseksiyon için ihtiyaç duyulan miktarda tüpü kuru buz üzerinde önceden soğutun.

Ardından, bir sıçanı sakrifiye ettikten sonra beynini çıkarın ve beyni, lateral serebellum buz gibi matristeki çentiklere oturacak şekilde ters yerleştirin. Bir dakika sonra, striatum ve nucleus accumbens analizleri için optik kiazmanın yaklaşık iki milimetre rostralinden başlayarak soğuk ustura bıçaklarını soğuk beyne yerleştirin. Daha sonra, ponsların orta noktasına kadar her bir milimetrelik kesite soğuk ustura bıçaklarını yerleştirmeye devam edin; matristen daha kolay çıkarılmasını sağlamak için her bir ustura bıçağının yerleşimini kademeli olarak ayarlayın.

Usturaları çıkarırken, hippocampus'un orta beyni tamamen sardığı konumda SN ve VTA'nın varlığını doğrulamak için en iyi kılavuz olduğu için hippocampus'ün başlangıcına bakın. SN'yi VTA'dan önce ayırmak için 11 numara bistüri ucu ile kesitler alın. Üstteki korteksi ve hippocampus'ü kaldırın.

Ardından, diseksiyon sırasında jiletin ıslak buzla sürekli temas ettiğinden emin olarak, SN'nin pigmente bölgesini VTA'dan ayıran dikey bir kesi yapın. Sonra, SN'nin dorsal ve lateral en uç kısmının hemen üzerinden, orta hatta veya orta hatta yakın bir yerden yatay bir kesi yapın. Son olarak, SN'yi beyinsapının geri kalanından ayıklayın.

SN çıkarıldıktan sonra, VTA'yı orta beynin geri kalanından ayırın. Diseke edilen dokuları derhal önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin. Ardından dokuları, işleme hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.

Bu prosedürde, dokuyu kuru buzdan çıkardıktan hemen sonra, buz soğukluğundaki 0,1 molar perklorik asit EDTA çözeltisi kullanarak nazikçe homojenize edin. Ardından, numuneyi tekrar kuru buz üzerinde bekletin. Son olarak, çökeltme sağlamak için numuneleri 12.000 RPM'de santrifüjleyin.

Western blot belirlemeleri için kullanılacak protein pelletlerini elde etmek amacıyla süpernatantları HPLC vialine aspire edin. HPLC tampon işlemiyle elde edilen ve hâlâ donmuş durumdaki çöktürülmüş protein pelletlerini, çözülmeleri için ıslak buz üzerine yerleştirin ve tüm tamponun uzaklaştırıldığından ve arşivlendiğinden emin olun. SN'nin bilateral işlemesi için pelletle 300 µL %1 SDS içeren beş mM Tris ve bir mM EDTA ekleyip sonikasyon uygulayın; VTA'nın bilateral işlemesi için ise 200 µL %1 SDS yeterli olacaktır.

Ardından, protein denatürasyonunu tamamlamak için numuneleri yaklaşık beş dakika boyunca kaynayan suya yerleştirin. Daha sonra oda sıcaklığına soğumalarını bekleyin; bu aşamada kapakların sıkıca kapatıldığından emin olun. Sonrasında, iki ile 40 µg protein arasındaki bir protein standart eğrisi aralığı ile BCA analizini uygulayın.

Beş mikrolitrelik örneklerdeki protein konsantrasyonunu belirlemek için, standart eğriye karşı protein miktarını saptamak amacıyla üç tekrarlı analizden elde edilen medyan değeri kullanın. Protein konsantrasyonu için sonucu örnek hacmine bölün. Ardından, örnek tamponu renginin belirttiği şekilde, gerekliyse %10 akrilamid jel üzerinde indirgeyici SDS elektroforezi için DIO three etol içeren örnek tamponu ile örnekleri hazırlayın.

Sarıya dönene kadar, mavi renk belirginleşene dek numuneye 10 µL'lik artışlarla bir molar tris baz pH 8.2 ekleyin. Doğru pH'ı sağlamak için %10 akrilamid jel üzerinde SDS-PAGE ile uygun miktarda toplam protein yürütme işlemi yapın, ardından proteinleri 0,45 mikron gözenek boyutundaki nitrocellulose membrana aktarın; hoffer tankını en az 27 volt değerine ayarlayın ve aktarımın gece boyunca gerçekleşmesine izin verin.

Ertesi gün, blotu en az 30 dakika boyunca kurutun. Ardından, yaklaşık beş dakika boyunca poncho S çözeltisi ile boyayın. Sonrasında, tekil protein bantları net bir şekilde seçilene ve arka plan boyaması giderilene kadar %0,2 hidroklorik asit çözeltisi ile kuvvetlice yıkayın.

Ardından, her şeritteki bağıl protein yüklerini daha ayrıntılı nicelendirmek ve tirozin hidroksilaz, dopamin taşıyıcı veya veziküler monoamin taşıyıcı iki sonuçlarını normalize etmek amacıyla Image J kullanarak ponceau S boyamasının görüntüsünü elde edin. Burada, sıçan substantia nigra örneklerindeki Ser31 fosforile tirozin hidroksilazın western blotu gösterilmektedir. Kalibre edilmiş Ser31 fosforile tirozin hidroksilaz standart eğrisi 0,3 nanogram ile 2,0 nanogram arasında değişmekte olup deteksiyonun lineer aralığı içindedir. Burada, sıçan ventral tegmental örneklerindeki Ser40 fosforile tirozin hidroksilazın western blotu yer almaktadır.

Kalibre edilmiş SN 40 fosforile tirozin hidroksilaz standart eğrisi 0.2 nanogram ile 1.5 nanogram arasındadır ve doğrusal saptama aralığı içerisindedir. Tüplerin etiketlenmesinin yanı sıra uygun sıcaklığın korunması da önemlidir. Ayrıca, sonuçlarınızdaki varyansı azaltmak için proteini normalize etmek önemlidir.

Bu protokol, titizlikle takip edildiğinde, lokomotor fonksiyonlar ve bağımlılık davranışı alanındaki araştırmacılara, beyinde ve özellikle ilgilendiğimiz dopamin üzerinde etkili olan monoamin regülasyonuna dair kapsamlı moleküler veriler sağlayabilir. Sonuç olarak bu veriler, davranışsal çıktılar açısından ne anlama geldiğine dair çok detaylı ve kapsamlı bir analiz sunabilir. Bu videoyu izledikten sonra, tek bir doku diseksiyonundan substantia nigra ve ventral tegmental alandaki monoamin regülasyonu okumalarını nasıl maksimize edebileceğiniz konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.