Substantia nigra ve ventral Tegmental Bölgesi Dopamin Yönetmelik Kapsamlı Profilleme

Bu prosedürün genel amacı, orta beyin (midbrain) bölgelerinin somatodendritik kısımlarından alınan tek bir doku diseksiyonundan, dopamin regülasyonu ile ilişkili moleküler okumaların bilgisini maksimize etmektir. Bu, öncelikle substantia nigra'yı ventral segmental alandan ayırmak için hassas bir diseksiyon yapılarak gerçekleştirilir. İkinci adım, dokuların HPLC ile dopamin analizi için işlenmesi ve çöktürülmüş endojen proteinin analiz için daha ileri düzeyde işlenmesidir.

Ardından, çöktürülmüş proteinin toplam protein içeriği için işlenmesi, örnekteki dopamin doku içeriği okumasıyla birlikte hangi dopamin düzenleyici proteinlerin veya protein fosforilasyonunun ölçülebileceğinin belirlenmesini sağlar. Nihayetinde, ayrık orta beyin somatodendritik bölgelerindeki dopamin ve düzenleyici proteinlerinin analizleri, dopamin düzenlemesiyle ilişkili moleküler mekanizmalara dair sonuçlar çıkarılmasına olanak tanır.

Monoaminler birçok davranışsal sonucu etkiler; nitekim bağımlılık, biyoloji ve özellikle Parkinson hastalığında olduğu gibi lokomotor disfonksiyon alanındaki araştırmacılar, laboratuvarımda çalıştığımız dopamin gibi monoaminlerin davranışsal sonuçları nasıl etkilediğiyle yakından ilgilenmektedir. Ancak, monoaminlerin moleküler düzeyde nasıl düzenlendiğini anlarsak, onları çalışmanın önemi daha da belirginleşecektir. Tekniğimizin sağladığı avantaj, MSS dokusundan elde edilen tek bir örnekten birden fazla veri okuması alabilmemizdir; böylece moleküler olayların monoaminlerin disregülasyonunu nasıl etkilediğine dair eksiksiz bir veri seti elde edebiliriz.

Bu verileri alıp davranışın nasıl etkileneceği bağlamına yerleştirebiliriz. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan bireyler zorluk çekecektir çünkü protein ve fosforilasyon tayini, araştırmacı tarafından seçilen antikorlara bağlı olarak doğru bir okuma için ne kadar toplam proteine ihtiyaç duyulacağına dair bilgi gerektirir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir.

Diseksiyon teknikleri ve düzenleyici proteinlerle mono ortalamaların belirlenmesi, in vivo düzenlemenin analizinde nispeten yeni bir yaklaşımdır. Bu prosedüre başlamak için; kemirgen beyin matrisini, beş adet jilet ve 11 numara bistüri içeren bir Petri kabını ıslak buz üzerinde soğutun. Ayrıca, diseksiyon için gereken tüpleri kuru buz üzerinde önceden soğutun.

Ardından, bir sıçan sakrifiye edildikten sonra beynini çıkarın ve beyin, lateral cerebellum buz soğukluğundaki matristeki yuvalara oturacak şekilde terslemesine yerleştirin. Bir dakika sonra, striatum ve nucleus accumbens analizleri için optik kiyazmanın yaklaşık iki milimetre rostralinden başlayarak soğuk jiletleri soğuk beyne yerleştirin. Daha sonra, ponsun orta noktasına kadar her bir milimetrelik kesite soğuk jiletleri yerleştirmeye devam edin; matristen daha kolay çıkarılmasını sağlamak için her bir jiletin yerleşimini kademeli olarak ayarlayın.

Jiletleri çekerken, hipokampusun orta beyni tamamen çevrelediği noktada SN ve VTA'nın varlığından emin olmak için en iyi kılavuz olan hipokampusun başlangıcını arayın. Öncelikle SN'yi VTA'dan ayırmak için 11 numara bistüri ucu ile kesitler alın. Üstte kalan korteksi ve hipokampusu uzaklaştırın.

Ardından, diseksiyon sırasında jiletin ıslak buzla sürekli temas ettiğinden emin olarak, SN'nin pigmente olan alanını VTA'dan ayıran dikey bir kesi yapın. Daha sonra, SN'nin dorsal ve en lateral kısmının hemen üzerinden, orta hatta veya orta hattın yakınında yatay bir kesi yapın. Son olarak, SN'yi beyin sapının geri kalanından dikkatlice ayırın.

SN çıkarıldıktan sonra, VTA'yı orta beynin geri kalanından ayırın. Diseke edilen dokuları derhal önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin. Ardından, dokuları işlem aşamasına gelene kadar -80 °C'de saklayın.

Bu prosedürde, dokuyu kuru buzdan çıkardıktan hemen sonra buz soğukluğundaki 0.1 molar perklorik asit EDTA çözeltisi kullanarak nazikçe homojenize edin. Ardından örneği tekrar kuru buz üzerinde tutun. Sonrasında, çöktürme işlemi için örnekleri 12,000 RPM'de santrifüjleyin.

Western blot tayinleri için kullanılacak protein peleti elde etmek amacıyla süpernatantları HPLC vialine aspire edin. HPLC tamponu işlemiyle elde edilen ve hâlâ donmuş durumdaki çöktürülmüş protein peletlerini, çözülmeleri için ıslak buz üzerine yerleştirin ve tüm tamponun uzaklaştırıldığından ve arşivlendiğinden emin olun. SN'nin bilateral işlemesi için pelete beş milimolar triss ve bir milimolar EDTA içeren 300 µL %1 SDS ekleyip sonikasyon uygulayın; VTA'nın bilateral işlemesi için ise 200 µL %1 SDS yeterli olacaktır.

Ardından, protein denatürasyonunu tamamlamak için örnekleri yaklaşık beş dakika boyunca kaynayan suya yerleştirin. Daha sonra oda sıcaklığına soğumalarını bekleyin ve bu aşamada kapakların sıkıca kapalı olduğundan emin olun. Sonrasında, 2 ile 40 µg arası protein standart eğrisi aralığında BCA analizi uygulayın.

Beş mikrolitrelik örneklerdeki protein konsantrasyonunu belirlemek için, standart eğriye karşı protein miktarını saptamak amacıyla üçlü analizden elde edilen medyan değeri kullanın. Protein konsantrasyonunu bulmak için sonucu örnek hacmine bölün. Ardından, örnek tamponu renginin gösterdiği şekilde gerekliyse, %10 akrilamid jelde indirgen SDS elektroforezi için DIO üç etol içeren örnek tamponu ile örnekleri hazırlayın.

Sarıya dönene kadar, mavi renk belirginleşene dek örneğe 10 µL'lik artışlarla pH 8.2'de 1 M tris baz ekleyin. Uygun pH'ı sağlamak için, %10 akrilamid jel üzerinde SDS-PAGE kullanarak uygun miktarda toplam protein yürütün, ardından proteinleri 0,45 micron gözenek boyutuna sahip nitrocellulose membrana aktarın; hoffer tankını en az 27 V'a ayarlayın ve transferin gece boyunca gerçekleşmesine izin verin.

Ertesi gün, blotu en az 30 dakika boyunca kurutun. Ardından, yaklaşık beş dakika boyunca ponceau S çözeltisi ile boyayın. Bundan sonra, tekil protein bantları net bir şekilde belirginleşene ve arka plan boyaması temizlenene kadar %0.2'lik hidroklorik asit çözeltisi ile kuvvetlice yıkayın.

Ardından, her bir şeritteki göreli protein yüklerini daha fazla nicelleştirmek ve tirozin hidroksilaz, dopamin taşıyıcı veya veziküler monoamin taşıyıcı iki sonuçlarını normalize etmek için Image J kullanarak ponço S boyamasının görüntüsünü elde edin. Burada, sıçan substantia nigra örneklerindeki Ser31 fosforile tirozin hidroksilazın western blot görüntüsü yer almaktadır. Kalibre edilmiş Ser31 fosforile tirozin hidroksilaz standart eğrisi 0,3 nanogram ile 2,0 nanogram arasında değişmektedir ve lineer tespit aralığındadır. Burada, sıçan ventral tegmental örneklerdeki Ser40 fosforile tirozin hidroksilazın western blot görüntüsü yer almaktadır.

Kalibre edilmiş SN 40 fosforile tirozin hidroksilaz standart eğrisi 0,2 nanogram ile 1,5 nanogram arasında değişmektedir ve doğrusal saptama aralığı içindedir. Tüplerin etiketlenmesinin yanı sıra uygun sıcaklığın korunması da önemlidir. Ayrıca, sonuçlarınızdaki varyansı azaltmak için proteinlerin normalize edilmesi önemlidir.

Bu protokol, titizlikle takip edildiğinde, lokomotor fonksiyon ve bağımlılık davranışı alanındaki araştırmacılara, özellikle ilgilendiğimiz konu olan beyindeki monoamin düzenlemesini ve dopamini etkileyen kapsamlı moleküler veriler sağlayabilir. Sonuç olarak, bu veriler davranışsal çıktılar açısından ne anlama geldiğine dair oldukça detaylı ve kapsamlı bir analiz sunabilir. Bu videoyu izledikten sonra, tek bir doku diseksiyonundan substantia nigra ve ventral tegmental alandaki monoamin düzenlemesi verilerinin nasıl maksimize edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.