Vahşi Tırtıllar gelen Hemocytes ayıklamak için basit bir protokol

Bu prosedürün genel amacı, yabani tırtıllardan he sitlerini çıkarmak, görselleştirmek ve saymaktır. Bu, önce tırtılı buz üzerine yerleştirerek uyuşturarak, bir antikoagülan içeren bir tampon solüsyon enjekte ederek ve sitlerin ekstraksiyondan önce dolaşıma yeniden girmesine izin vermek için tırtılı buza geri döndürerek gerçekleştirilir. İkinci adım, temiz bir neşter kullanarak tırtılın arka ucunda sığ bir kesi yapmaktır.

Daha sonra, tırtıl yumuşak forseps kullanılarak hafifçe sıkılır. Daha sonra tampon çözelti hemo lenf karışımı bir mikro pipet kullanılarak aspire edilir ve bir mikro santrifüj tüpünde toplanır. Son adım, hemo lenf çözeltisini eşit hacimde bir tampon çözeltisi ile nazikçe karıştırmak ve 10 mikrolitre çözeltiyi bir hemo sitometre üzerine aktarmaktır.

Sonuç olarak, bu hemosit ekstraksiyon yöntemi, çeşitli tırtıl türlerinden sitleri saymak için hızlı ve etkili bir yöntem olarak kullanılabilir ve böceklerin hücresel bağışıklık tepkisinin fizyolojik yönlerini incelemek için bir araç olarak korunabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çok düşük prox'lu tırtıllardan hemo sots çıkarmak için kullanılabilmesidir. Diğer tırtıl modelleri, profesyonellerden biri kesilerek kanasıflanır, çıkan sıvıdan citleri çıkarmadan unex edilir.

Ek olarak, bu teknik diğer böcek türlerinden hemotip çıkarmak için kullanılabilir. Bu yöntem, böcek hücresel bağışıklık tepkisinin diyet kalitesi, gelişim aşaması veya farklı patojenlere maruz kalma ile nasıl değiştiği gibi eko immünoloji alanındaki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu işleme başlamak için, sondan bir önceki instar larvalarını hemosit ekstraksiyonundan önce 20 dakika boyunca buz üzerinde soğutarak uyuşturun.

Bundan sonra, temiz bir 16 gauge kılcal iğnenin kör ucunu 20 mililitrelik bir cam şırıngaya bağlı boruya takın. Toplama solüsyonunu içeren tüpü laboratuvar tezgahında açık bırakın. Kılcal damarı yaklaşık 10 ila 15 mikrolitre tamponla yavaşça doldurun.

Daha sonra iğneyi, diseksiyon mikroskobunun yanına yerleştirilmiş bir kil topunun üzerine koyun. Tırtılı bir Petri kabına yerleştirin. Böcek, küreler açıkça görülebilecek şekilde yan tarafına yerleştirilmelidir.

Diseksiyon mikroskobu altında görüntülerken, tırtılı bir çift forseps ile yerinde tutun ve iğneyi, böcek kütikülünün genellikle daha yumuşak olduğu kürelerden birine yakın yerleştirin. Ardından kılcal iğneyi böceğin gövdesine doğru hafifçe bastırın. İğne kütiküle nüfuz ettikten sonra, toplam çözelti hacmini tırtıl içine enjekte edin.

Tırtılın vücudu enjeksiyondan sonra şişer, ancak patlamamalı veya sızmamalıdır. Tırtılı buzlu Petri kabına geri koyun. Tamponun yaradan dışarı sızmasını önlemek için böceği dorsal olarak konumlandırın.

Hemo limp ekstraksiyonu için kullanılan her tırtıl için enjeksiyonları tekrarlayın. Sonra tüm böceklerin 30 dakika buz üzerinde soğumasına izin verin. Şimdi, tırtılı diseksiyon mikroskobu altında bir Petri kabına yerleştirin.

Bağırsaklara veya diğer iç organlara zarar vermeden steril bir neşter kullanarak, tırtılın arka bölgesinde yaklaşık iki ila üç milimetre uzunluğunda sığ bir kesi yapın. Daha sonra, 10 mikrolitrelik bir pipet ucu ile yaklaşık 10 ila 20 mikrolitre hemo limp karışımı toplarken bir çift esnek plastik forseps kullanarak tırtılı hafifçe sıkın. Yine, iç dokulara zarar vermemeye dikkat edin.

Bundan sonra, tırtılları atın, kalır. Her tırtıldan gelen kanama topallamasını ayrı ayrı etiketli Silikonize, 0.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerinde toplayın. Daha sonra, tek bir tırtıldan toplanan her bir hemo limp örneğine yaklaşık 10 ila 20 mikrolitre inkübasyon solüsyonu ekleyin.

Bu adımda hemolenf örneklerini her zaman buz üzerinde tutun. Saymadan hemen önce hemolenf örneğini ve inkübasyon solüsyonunu karıştırın. O sitikler.

Bu işlem, sitlerin uygun şekilde ayrılmasını sağlar ve topaklanmayı önler. İnkübasyon solüsyonu ile karıştırılmış 10 mikrolitre hemo lenf örneğini bir hemo sitometreye aktarmak için temiz bir pipet ucu kullanın. Daha sonra bir bileşik mikroskop kullanarak, hemo sitometrenin merkezi ızgarasının büyük karelerinin en az 15'inde sit sayısını sayın ve kaydedin.

15 karedeki hemo sit sayısının toplam toplamını elde etmek için bu değerleri ekleyin. Daha sonra, hemo sitometreyi durulayın ve kapağı, damıtılmış ve deiyonize su içeren bir yıkama şişesi kullanarak iyice kaydırın. Ardından Kim mendilleriyle kurulayın.

Hemo limp örneklerinin geri kalanı için prosedürleri tekrarlayın ve her tırtıl için mililitre hemo limp hacmi başına ortalama sit sayısını hesaplayın. Parlak alan mikroskobu görüntüsü, 20 x büyütmede nucle hin ai tırtıllarından ekstrakte edilen he sitlerini gösterir. Bu prosedürü takiben, toplanan hemositler hücresel immün yanıtı incelemek ve fagositoz ve kapak, seçme kapsülleme ve pH oksidaz aktivitesi gibi testler oluşturmak için kullanılabilir.

Ek olarak, R-N-A-D-N-A ve protein, böceklerde bu hücresel bağışıklık tepkisini incelemek için daha ileri tahliller için kullanılmadan toplanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hemolenf çıkarmak amacıyla tırtılların nasıl enjekte edileceğini ve canlı hemo sitleri içeren hemolenflerin nasıl toplanacağını iyi anlamış olmalısınız.