Su bazlı Algılamak için Teğet Akış Hollow-fiber Ultrafiltrasyon ve Isı Disosiyasyon Adımlar kullanır A Modifiye EPA Method 1623

Bu prosedürün genel amacı, suyla bulaşan cryptosporidium ve giardia türlerini tespit etmek ve görselleştirmektir. Bu işlem, ilk olarak su örneğinin teğetsel akışlı, içi boş fiber ultrafiltrasyon kullanılarak konsantre edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, bir santrifüjleme aşamasını takiben organizmaların elüe edilmesi ve filtreden kalıntıların tutulmasıdır.

İmmünomanyetik ayırma, parazitlerin konsantre kalıntılardan seçici olarak ayrılmasını sağlar. Manyetik boncuklar, ısı ile ayrıştırma yoluyla parazitlerden koparılır ve bir mıknatıs kullanılarak uzaklaştırılır. Ardından kistler ve O kistleri bir lam üzerine yerleştirilir ve numune, immünofloresan mikroskobu ile görüntüleme için boyanır.

Hofi filtrasyonunun mevcut tekniklere göre temel avantajı, ultra filtrenin önemli ölçüde daha düşük maliyetli olması ve Cryptosporidium ile Giardia'nın yanı sıra virüsler ve bakteriler gibi çok sayıda mikroorganizmayı yakalayabilmesidir. Genel olarak, immünoseparasyona yeni başlayan kişiler, çok farklı iklim koşullarından gelen farklı numunelerle ilişkili döküntülerin miktarı ve türü nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Ultra filtrasyon düzeneğini bir biyogüvenlik kabini içerisinde kurarak başlayın.

Sistem kurulduktan sonra şu şekilde çalışır: su örneği siyah T konnektörden geçerek sisteme girer; pompa kafası, basınç göstergesi üzerinden geçerek içi boş fiber ultra filtreye ilerler; filtrelenen su, filtrenin yan tarafındun atık kabına akar. Organizmaları içeren tutulan su, retent şişesine zorlanır ve su hacmi azalana kadar sistem üzerinden yeniden dolaşıma sokulur. İşleme başlamak için havalandırma kapağını çıkarın ve retent şişesinin suyla dolmasını sağlamak için kapalı olması gereken ikinci sıkıştırma klempi dışındaki tüm klempleri açın; pompa yönünü su örneğinin filtreye akacağı şekilde ayarlayın.

Ardından pompa hızını %25'e ayarlayın ve renate şişesi üçte ikisinin dolduğunda pompayı çalıştırın. İkinci sıkıştırma klembini kapatın ve havalandırma kapağını kullanarak şişeyi hızla sıkıca mühürleyin. Sızıntı olmadığından emin olmak için tüm hatları ve bağlantı parçalarını kontrol edin.

Ardından, dereceli silindir ve zamanlayıcı veya bir akış ölçer kullanarak pompa hızını yavaşça dakikada yaklaşık 1,5 litreye çıkarın ve filtrat hızının, yani effluent hattından çıkan suyun hızının gerçekten dakikada 1,5 litre olduğunu doğrulayın. Reten şişesinin hacmi hafifçe artsa veya azalsa da, şişenin asla boşalmadığından emin olarak filtrasyon sürecini izleyin. Hacim üçte birin altına düşerse, havalandırma kapağını çıkarın ve ikinci sıkıştırma klembini kapatın.

Şişedeki hacmin tekrar üçte ikisine ulaşmasına izin verin. Ardından havalandırma kapağını sıkıca kapatın ve iki numaralı klempi tekrar açın. Örnek kabı boşaldığında, bir numaralı sıkıştırma klembini hemen kapatın ve pompa hızını %20'ye düşürün. Retentat şişesindeki havalandırma kapağını çıkarın ve filtre kolon çıkış tüpünü atık tankına bağlayan rampa klembini kapatın.

Retentat şişesindeki hacmi yaklaşık 200 mililitreye ayarlamak için rampa klempsini sıkın veya gevşetin. Ardından, örneği elüe etmek için rampa klempsini elüasyon konumunda sıkın. İlk olarak, işlem sırasında kabın içini durulayarak örnek kabına 500 mililitre elüasyon çözeltisi ekleyin.

Ardından, numune alma hattına bağlı olan 10 mililitrelik pipeti elüasyon çözeltisi kabına yerleştirin. Elüasyon çözeltisini çekmek için birinci sıkıştırma kelepçesini açın ve ikinci sıkıştırma kelepçesini anlık olarak kapatın. Çözeltinin tamamı yüklendiğinde, birinci sıkıştırma kelepçesini kapatın, ikinci sıkıştırma kelepçesini açın ve çözeltinin %20 pompa hızıyla beş dakika boyunca dolaşmasını sağlayın; renat şişesindeki numune hacmini yaklaşık 100 mililitreye ayarlamak için rampa kelepçesini sıkın veya gevşetin.

Ardından rampa kelepçesini tamamen sıkın ve numunenin bir dakika boyunca yeniden dolaşmasına izin verin. Bu noktada, pompanın yönünü 20 saniye boyunca tersine çevirin. Bu işlem, tate şişesinde yaklaşık 225 mililitre numunenin birikmesini sağlayacaktır.

Ardından pompayı kapatın. Boruları pompa başlığından ve filtreden çıkan boruyu çıkarın; kalan tüm örneği şişeye aktarmak için boruları tate şişesinin üzerinde tutun. Daha sonra tüm boruları şişeden ayırın ve havalandırma kapağını havalandırmasız bir kapakla değiştirin.

Konsantre örneği 250 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın. Renat şişesini iki kez 10 mililitre reaktif su ile durulayıp durulama sıvısını santrifüj tüpüne aktarın. Örneği minimum 1500 ×g'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin.

Santrifüjü durdurmak için fren kullanmayın. Santrifüj işleminin ardından, süpernatantı peletin beş mililitre üzerinde kalacak şekilde dikkatlice aspire edin. Sıvı seviyesinin üst kısmında kalmaya ve pelet içindeki O kistlerini ve kistleri aspire etmekten kaçınmaya özen gösterilmelidir.

Peleti tamamen yeniden süspande etmek için tüpü vorteksleyin. Ardından örneği, her biri bir mililitre 10 X SL tampon A ve tampon B içeren düz kenarlı bir dyal L 10 tüpüne aktarın. Santrifüj tüpünü 2,5 mililitre reaktif su ile iki kez durulayın ve durulama solüsyonunu dyal L 10 tüpüne ekleyin. Son hacmi 12 mililitreye tamamlayacak şekilde, tüpe manyetik boncuk konjuge, anti cryptosporidium ve anti giardia antikorlarından her birinden 100 mikrolitre ekleyin.

Ardından tüpü, rotasyon sonrası oda sıcaklığında bir saat boyunca döner karıştırıcıda 18 RPM hızında döndürün. Tüpün düz tarafını MP altı mıknatısına yaslayın ve tüpü mıknatıstan ayırmadan iki dakika boyunca hafifçe sallayın. Düz tarafı yukarıda tutarak süpernatanı boşaltın.

Mıknatıs yakınındaki tüpün düz tarafında tutulan boncukları rahatsız etmemeye dikkat edin. Örnek tüpünü mıknatıstan çıkarın ve tüpün yuvarlak tarafındaki kalıntılara değmeden, düz tarafı üç kez 500 µL tampon A ile yıkayın. Her bir yıkama hacmini, bir MPCS mıknatıs içinde tutulan 1,5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Mıknatıs dikey konumdayken tüpü kapatın ve bir dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Ardından mıknatıs yerindeyken, tüpün altına yerleştirilmiş bir pastör pipeti kullanarak süpernatanı aspire edin ve tüpe nazikçe bir mililitre PBS ekleyin.

Boncuk peletinin bozulmamasına dikkat edin. Mıknatısa komşu tüp duvarına tutturun. Manyetik şeridi çıkarın ve boncuklar yeniden süspande olana kadar tüpü nazikçe sallayın.

Manyetik şeridi tekrar dikey konuma getirin. Tüpü bir dakika boyunca hafifçe sallayın ve boncukları yerinden oynatmadan mümkün olduğunca fazla kalıntıyı uzaklaştırarak süpernatanı aspire edin. Bu yıkama işleminden sonra mıknatısı kaldırın ve doğrudan boncuk paletinin üzerine 50 µL reaktif su ekleyin.

Boncukları yeniden süspande etmek için tüpü tam hızda 50 saniye boyunca vorteksleyin. Ardından, Giardia kistlerinin ve Cryptosporidium o-kistlerinin boncuklardan ayrışmasını sağlamak için örneği 80 °C'de 10 dakika inkübe edin. İnkübasyon sonrası örneği 30 saniye boyunca vorteksleyin. Daha sonra, süspansiyondaki kistleri ve O-kistlerini boncuklardan ayırmak için manyetik şeridi eğimli konumda kullanarak MPCS'ye yerleştirin.

Kistler ve O kistleri içeren süpernatantı bir kuyucuk lamına aktarın. Süpernatantı aynı lama ekleyerek, su ilavesi, vorteksleme ve ısı ile ayrıştırma adımlarını ikinci kez tekrarlayın. Ardından, süspansiyonu kurutmak için lamı 37 °C'lik bir lam ısıtıcıya yerleştirin.

Örneği sabitlemek için slayta 50 µL metanol uygulayarak başlayın ve oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Ardından, 50 µL DPI çözeltisi ekleyin ve slaydı oda sıcaklığında iki dakika boyunca inkübe edin. Çekirdekleri boyamak için, kuyuya temas etmemeye dikkat ederek bir Kim wipe yardımıyla kuyudaki sıvıyı emdirin.

Ardından, Giardia kistlerinin ve Cryptosporidium o kistlerinin hücre duvarını boyamak için 50 µL easy stain ekleyin. Numuneyi 35 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Boyayı daha önce olduğu gibi Kim wipe ile temizleyin.

Ardından, pipet ucunu kuyucuğun dışına dikkatlice yerleştirip sıvının kuyucuğun içine akmasını sağlayarak 300 µL soğuk easy stain tespit tamponu yavaşça ekleyin. Lamı oda sıcaklığında iki dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra tamponu bir KimWipe ile temizleyin ve 10 µL mountlama medyumu uygulayın; örneğin üzerine bir lamel yerleştirerek hava kabarcıklarını giderin ve lameli şeffaf oje ile mühürleyin. Floresan mikroskop kullanarak lamı 200x ile 1000x büyütme arasında ve 200x büyütmede bir fse ardından DPI filtresi ile inceleyin; kistler ve O kistleri, parlak vurgulanmış kenarlara sahip, parlak elma yeşili floresan oval yapılar olarak görünür.

Cryptosporidium O kistleri yuvarlaktır ve boyutları dört ila altı mikron arasında değişir. Giardia kistleri ise 1000 x büyütmede yuvarlak veya oval olabilir ve beş ila 15 mikron genişliğe, sekiz ila 18 mikron uzunluğa sahip olup daha büyüktür. DPI filtresi kullanıldığında, kistlerin ve CYS'lerin iç yapısı daha iyi gözlemlenebilir.

Genellikle, gökyüzü mavisi DPI boyalı çekirdekler şeklinde görünen dört adete kadar sporozoit, Cryptosporidium O kistleri ve Giardia Cys.DIC içerisinde görülebilir. Mikroskopi, ek morfolojik özelliklerin değerlendirilebilmesi sayesinde parazitlerin doğru tanımlanmasına da yardımcı olabilir. Cryptosporidium sporozoitleri DIC ile görülebilir; Giardia kistleri ise genellikle görünür çekirdekler, median cisimler adı verilen hilal şeklinde organeller ve aksonlar adı verilen dahili kamçılı yapılar gibi bir veya daha fazla belirgin iç yapı sergiler.

Holo fiber ultrafiltrasyon prosedürünün birden fazla mikroorganizmayı yakalama kapasitesine sahip olduğunu belirtmek önemlidir. Ayrıca, konsantre edilmiş örneklere qPCR ve genotipleme gibi diğer tespit analizleri uygulanabilir; bu da yöntemi daha esnek ve uygulamalarınıza daha uygun hale getirir. İzlediğiniz için teşekkür ederiz, herhangi bir sorunuz olursa lütfen bize bildirin.