Name: Su bazlı Algılamak için Teğet Akış Hollow-fiber Ultrafiltrasyon ve Isı Disosiyasyon Adımlar kullanır A Modifiye EPA Method 1623 Cryptosporidium Ve Giardia spp. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Öğrenin, su kaynaklı Cryptosporidium ve Giardia tespiti için teğet akış hollow-fiber ultrafiltrasyon, immüno manyetik ayırma ve immünofloresan mikroskopi yöntemlerini. Bu protokol, çevre mikrobiyolojisi ve halk sağlığı araştırmalarında maliyet etkin ve güvenilir bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz onun teknik destek için bu yazının ve Doug Hamilton eleştiri için Ann Grimm ve Michael Zimmerman teşekkür etmek istiyorum.

1. Teğet Akış Hollow-fiber Ultrafiltrasyon Prosedürü <ol><li> Tamponlar ve çözeltilerinin hazırlanması: Elüsyon çözeltisi (1 L): Distile su 1 L 0,1 g sodyum polifosfat, 0.1 ml Tween-80 ve 0.01 ml Y-30 köpük eklemek için. </li><li> Bir biyolojik güvenlik kabini filtre montajı (Şekil 1) hazırlayın: <ol><li> Bir Masterflex I / P hassas fırçasız Sürücüye bağlı bir Masterflex I / P Kolay Yük pompa kafası ile Masterflex I / P 73 laboratuvar tüp takın. </li><li> Bir vidalı kelepçe ile pompa kafası upstream bir NPT şube T-konnektör takılmış 0-60 psi, gliserin dolu basıncı göstergesi tüp sabitleyin ve pompa kafası bir HDPE T-konnektör aşağı için. </li><li> Bir Nalgene Masterflex L / S 15 laboratuvar boru ile 53-B dolum / havalandırma kapağı ve bir T-bağlayıcısı uyan ve 1 L Nalgene ağır polipropilen şişe sağlamca tarafından retentat şişe takılacak. </li><li> Masterflex L / S 24 tüp w FitITH bir tutam kelepçe (tutam kelepçe 2) ve HDPE T-konnektörüne retentat şişe bağlayın. </li><li> Manometre gelen Asahi Kasei için Masterflex L / S 24 laboratuar boru bağlayın vidalı kelepçe ile 25S yüksek akılı diyalizer Rexeed ve diyalizer gelen retentat şişeye. Boş elyaf Ultrafiltreler için boru bağlamak için ¼ &quot;ID boruları karşılamak için tasarlanmış ısmarlama DIN bağdaştırıcılarını kullanın. </li><li> Bir tutam kelepçe (tutam kelepçe 1) Masterflex L / S 24 laboratuvar tüp Fit ve numune alımı hattı olarak hareket etmek kaldırıldı ucu ve pamuk yumağı ile 10 ml plastik pipet bağlayın ve sonra HDPE için tüp takmak T- konektörü. </li><li> Bir rampa filtrenin çıkış ucu yakınında bulunan atık noktasına hortum ve kelepçe ile bağlanmak Masterflex L/S-36 laboratuar hortumun bir ucunu takın. Atık kap içinde diğer ucu yerleştirin. </li></ol></li><li> % 0.01 (a / h) 10 L su örneği sodyum polifosfat ve 3 dakika boyunca karıştırılır. </li><li> Tutam kelepçe 2 kapatınve retentat şişeden havalandırma kapağı çıkarın. Diğer tüm kelepçeler açık olması gerekir. </li><li> Manometre (sol aşağıdaki Şekil 1 hakkı) için T-konnektör gelen sıvı taşımak için pompa yönünü ayarlayın. Maksimum hız% 25 pompa hızını ayarlayın ve pompa açın. </li><li> Retentat şişenin 2/3 tam, açık tutam kelepçe 2 ve hızlı bir şekilde retentat şişe havalandırma kapağını değiştirdiğinizde. Hatları ve sızıntıların olmadığından emin olmak için bağlantı parçaları, her kontrol edin. </li><li> Yavaş yavaş sızıntı kontrol, istenilen filtrasyon hızı (yaklaşık 1.5 L / dk) pompa hızını artırmak. Bir mezun silindir ve bir zaman sayacı veya akış ölçer kullanarak, atık su hattı (Şekil 1&#39;de mavi L / S 36 tüp) ve çıkışlarında suyun süzüntü hızını kontrol edin. Hava kabarcıkları tipik olarak zor stabil bir basınç ve filtrasyon oranı elde etmek için filtre yapım çıkış ucunda oluşturabilirler. Bu, bir an için elle atık su hattı sıkıştırarak düzeltilir. Bu, eylemgenellikle süzüntü noktasına hava kabarcığı coax ve atık su hattı üzerinden çıkmak için. Bezelye büyüklüğünde hava kabarcıkları genellikle kaçınılmaz olduğunu akılda tutarak, gerektiği gibi tekrarlayın. </li><li> Filtrasyon işlemi izleyin. Gerektiği gibi basınç ve filtrasyon hızını ölçün ve kaydedin. Basıncı 20 psi aşmamalıdır. Bu filtrasyon hızı 2.0 L / dk geçmemelidir önerilir. Bu retentat şişe içinde su hacmi boşaltmaktadır hiç sağlamak için izlenir olması önemlidir. Bu artırmak veya biraz azaltmak için ses seviyesi normaldir. Retentat şişede su hacmine göre 1/3 dolu düşerse, havalandırma kapağını ve yakın tutam retentat şişe hattı 2 kelepçe. Yaklaşık 2/3 geri ses getir, kelepçe açmak ve hızlı bir sızdırmazlık sağlanması, havalandırma kapağı değiştirin. Retentat şişe hacmi hızla ve sürekli düşerse, retentat şişe kapağı sıkı ve havalandırma kapağı sıkıca yerinde olduğundan emin olun ve bu tubing su numunesi ile temas halen devam etmektedir. Bu sorunları meydana değilseniz, o zaman retentat şişe kapağı içinde mühür kötü olduğunu ve değiştirilmesi gerektiğini muhtemeldir. </li><li> Numune kabı boş olduğunda, hemen yakın tutam kelepçe 1, maksimum% 20 pompa hızını azaltmak, retentat şişeden havalandırma kapağını ve rampa kelepçe kapatın. </li><li> Rampa kelepçe sıkma veya gevşeterek yaklaşık 200 ml retentat şişede örnek ses seviyesini ayarlayın. Hacminin yaklaşık 200 ml sonra, elüsyon adım (1,11-1,12) için rampa kelepçe sıkmak. </li><li> Örnek kabına elüsyon çözeltisi 500 ml ilave edilir ve kabın içine durulanır. Elüsyon çözeltisi içeren bir kaba Örnek uptake hattına bağlı 10 ml pipetle yerleştirin. Rampa kelepçe kapalı olduğundan emin olun. Açık tutam 1 kelepçe ve yakın tutam elüsyon çözüm çizmek için bir an 2 kelepçe. </li><li> Elüsyon çözeltisi 500 ml kadar çekilir sonraYakın, 1 kelepçe ve açık bir tutam kelepçe 2 çimdik. Elüsyon çözüm maksimum% 20 bir pompa hızı ile 5 dakika dolaşmasına izin verin. </li><li> Atık su hattı üzerinde rampa kelepçe sıkma veya gevşeterek yaklaşık 100 ml retentat şişede örnek ses seviyesini ayarlayın. Rampa kelepçesini sıkın ve örnek 1 dakika dolaşmasına izin verin. Retentat şişe numune hacmi sağlayarak tüp içine hava çekerek kaçının retentat şişe giren L / S 15 tüp karşılamak için yeteri kadar yüksektir. </li><li> Retentat şişeye örnek zorlar pompa yönünü tersine çevirmek. Pompa retentat şişede ~ 225 ml ve sonuç olarak toplam 20 saniye boyunca ters çalışmasına izin ver. Pompa kapatın. </li><li> Pompa kafasından Masterflex I / P 73 tüp çıkarın ve manometre kesin. Boş elyaf Ultrafiltreler çıkmadan Masterflex L / S 24 tüp ayırın. Içine kalan örnek zorlamak için retentat şişe üstünde boru tutunşişe retentat. </li><li> Şişeden tüm boru kesin olmayan bir havalandırma kapağı ile havalandırma kapağı değiştirin. </li><li> ~ 225 ml retentat ile IMS / IFA prosedürü devam edin. </li></ol> 2. İmmunomanyetik Ayırma İşlemi <ol><li> Tamponlar ve çözeltilerinin hazırlanması: <ol><li> Cryptosporidium / Giardia kombo kiti oda sıcaklığına ulaşmasını: Dynabeads dahil tamponlar izin verin. </li><li> 1X SL-tampon A: 10X SL-tampon A 9 ml distile su 1 ml ekleyin. </li></ol></li><li> Etiketli 250 ml konik santrifüj tüpüne retentat şişe sıvı ~ 225 ml aktarın. Reaktif 10 ml su ile iki kez retentat şişede, durulama ve konik bir santrifüj tüpüne durulama ekleyin. 4. 15 dakika ° hiçbir fren C için 1500 xg&#39;de süspansiyon santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle pelet hacmi her 0.5 ml (yani aspirat 1 için hava-su arayüzünden dolu pelet yukarıdaki 5 ml supernatant aspire5 1.3 ml&#39;lik bir hacim pelet yukarıda ml ve aspirasyon 0.5 ml veya daha az) bir pelet için 5 ml kadar. </li><li> Iyice vorteks ve / veya karıştırma pipet ile süpernatan içine pelletini. 1 ml içeren düz kenarlı Dynal L10 tüpüne sıvı her 5 ml hacimde transfer A ve SL-tampon B. 10X reaktif su 2.5 ml ile iki kez konik santrifüj tüpüne yıkayın ve durulama eklemek SL-tampon 10X her tamponlar dahil olmak üzere, L10 tüpe 12 ml toplam hacme getirmek L10 tüp. </li><li> L10 tüpüne 100 ul iyi karıştırılmış tekrar süspanse edilir, anti-Cryptosporidium ve anti-Giardia Dynabeads her bir ekleme. Bir rotator karıştırıcı oda sıcaklığında 1 saat 18 rpm&#39;de L10 tüp döndürün. </li><li> MPC-6 mıknatıs ve hafifçe elini kaya 2 dakika tüp uçtan uca, 180 ° karşı L10 tüpün düz tarafı yerleştirin. </li><li> Mıknatıs yüzü MPC-6 mıknatıs L10 tüp tutmak kadar, boncuk / (oo) kist kompleksleri bou uzak süpernatantı boşaltacaktırmıknatısa nd. Mıknatıs gelen L10 tüpünü çıkarın ve A tüpüne 1X SL-tamponu 0.5 ml ekleyin. Dikey konumda mıknatıslı MPC-S düzenlenen bir 1,5 ml mikrosantrifüj tüpe A SL-tampon 1X 0.5 ml iki ek durulama kullanarak süspansiyonu aktarın. </li><li> Yavaşça 1 dakika MPC-S mıknatıs 180 ° tüp sallayın. Yerde mıknatıs, mikrosantrifüj borusunun alt yönelik bir Pasteur pipet kullanılarak süpernatan aspire. </li><li> Mikrosantrifüj tüpünün ön tarafına 1X PBS 1 ml ekleyin, mıknatıs kaldırmak ve boncuklar süspanse kadar sadece hafifçe tüpü sallayın. Dikey konumda mıknatıs değiştirin ve yavaşça 1 dakika tüp 180 ° sallayın. PBS mümkün olduğunca fazla enkaz olarak kaldırmak için bir Pasteur pipeti kullanarak, boncuk pelet bozmadan, durulama aspire. </li><li> Mıknatıs kaldırmak ve mikrosantrifüj tüpün arka yüzüne su reaktif 50 ul ilave edin. Vorteks 50 saniye boyunca tam hızda tüp,daha sonra, bir 30 ikinci bir vorteks takiben 10 dakika boyunca 80 ° C&#39;de inkübe edilir tüpü. Mıknatısa boncuklar bağlayıcı ve sıvı içinde (oo) kistler bırakarak, eğimli bir konumda MPC-S içine mıknatıs yerini alır. Bir SingleSpot iyi slayt için (oo) kist süspansiyon uygulayın. </li><li> İlk ayrışma içeren, aynı zamanda, sıvı uygulanması, adım 2.10 tekrarlanır. 37 ° C slayt iyi slayt için süspansiyon kuruması için 1 saat boyunca sıcak koyun slayt. </li></ol> 3. Boyama ve Sınav <ol><li> Tamponlar ve çözeltilerinin hazırlanması: DAPI çözeltisi çalışmaktadır: 1X PBS ile 25 ml&#39;ye DAPI stok solüsyonu (metanol içinde 2 mg / ml) 25 ul ekleyin. Mağaza stok ve 1 ° C ve karanlıkta 10 ° C arasında çalışma çözümleri. </li><li> Ayrıca sürgüye metanol 50 ul uygulamak ve oda sıcaklığında kurumaya bırakılır. </li><li> Ayrıca sürgüye çalışma DAPI solüsyonu 50 ul ekleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Bir Kimwi kullanınpe kuyudan DAPI fitil için. EasyStain 50 ul uygulayın. 30 dakika boyunca 35 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Bir Kimwipe ile iyi kapalı leke ve sonra yavaş yavaş iyi kenar üzerinde akmasını, soğuk EasyStain sabitleme tampon 300 ul ekleyin Wick. Oda sıcaklığında 2 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Iyi olan tampon fitil ve EasyStain Montaj Orta 10 ul uygulamak için bir Kimwipe kullanın. </li><li> Dikkatle oluşabilecek kabarcıkları çıkarırken, bir kapak kayma geçerlidir. Net oje ile kapak kayma sürün. </li><li> Bir ookist veya kist andıran oval veya yuvarlak elma-yeşil flüoresan nesneler için, toplam 200X büyütmede, FITC filtresi kullanarak tüm slayt tarayın. Ayrıca 1000X toplam büyütmede, 1000X toplam büyütmede DAPI filtresi ile ve daha sonra DIC ile tüm bu nesneleri inceleyin. Kalibre edilmiş bir oküler mikrometre ve morfolojik özellikleri kullanarak boyutu kaydedin. </li><li> Belge sonuçları. </li></ol> Not: Ek buluOrijinal prosedürü hakkında bilgi ver-EPA Method 1623 12 Aralık 2005 sürümü bulunabilir. Açıklanan teğet akış boş elyaf ultrafiltrasyon prosedürü EPA Method 1623 Bölüm 12.0 yerine kullanılır. Isı ayrışma EPA Method 1623 Bölüm 13.3.3 değiştirir. Bu prosedür, aynı zamanda ilave PBS bölümü 13.3.2.16 sonra Metot 1623 Aralık 2005 versiyonu içine sokulabilmektedir IMS durulama işlemi sırasında açıklanmaktadır. Bu değişiklikler dahil olmak üzere EPA Method 1623 için kullanılan sarf malzemeleri, reaktifler ve ekipmanların tam listesi ekipman listesi yer almaktadır. 4. Temsilcisi Sonuçlar Filtrasyon ve immunomanyetik ayırma işlemleri ile telafi ookistleri Cryptosporidium ve Giardia kistleri mikroskobik inceleme ile tespit edilir. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi toplam 200X büyütmede, her organizmanın tipik bir boyama desen, boyut ve şekle sergileyen </strong&gt; daha 1000X toplam büyütmede immersiyon yağı ile gözlem altında tutulmalıdır. Bu. Tipik tanımlayıcı özellikler veya olumlu kimlik ekarte olur atipik özellikler ya ölçülmesi ve tanımlanması için izin verecektir Cryptosporidium küresel nesnesine bir oval olan parlak vurgulanan kenarları (Şekil 3A parlak elma yeşili FITC floresanı sergileyen çapı 4 ila 6 mikron ). Yeşil bir jant ve belirgin bir çekirdek (DAPI negatif), yoğun mavi iç boyama, veya en fazla dört ayrı, gök mavisi çekirdeklerin (DAPI ile açık mavi iç boyaması: DAPI UV ile bir ookist aşağıdaki tipik özelliği kategorilerden birini sergileyecek pozitif - Şekil 3B). Atipik özellikler renk, yapı, ya DAPI floresans (örneğin, çok lekeli çekirdekleri, kırmızı iç yapıları floresanlama) sapmalar vardır. Flüoresan nesnenin tipik FITC ve DAPI boyaması için kriterleri karşıladığı takdirde, diferansiyel girişim con kullanılarak incelenirkontrast (DIC). Nesnesi, hücre duvarı süsleme veya hücre doldurma bir veya iki büyük çekirdek gibi atipik harici veya dahili morfolojik özellikleri incelenmiştir. Atipik yapılar tespit değilseniz, nesnenin toplam IFA sayısı kaydedildi ve boş bir amorf yapı olarak veya mevcut 03:59 sporozoitlerine (Şekil 3C) ile kategorize edilir. Benzer şekilde, Giardia benzeri nesneleri FITC ve DAPI boyama gibi axonemes, medyan organları ve çekirdekleri gibi DIC özellikleri yönünden incelenir Giardia kistleri ovoid elma-yeşil parlak nesneler, 8 yuvarlak -. 5 tarafından uzun 18 um - 15 mikron parlak vurgulanan kenarları (Şekil 3B) ile geniş. DAPI UV ile, Giardia kist DAPI negatif boyama veya DAPI pozitif özellikleri (Şekil 3E) sergileyecek. Cryptosporidium için tarif edildiği gibi floresan nesne ile aynı şekilde, tipik ve atipik özellikler için DIC tarafından incelenmiştir.Atipik gözlenen değilse, nesnenin toplam IFA sayısı kaydedilir ve boş içeren amorf yapısında olarak, ya da bu iç yapı (Şekil 3F) bir veya daha fazla türü ile sınıflandırılmaktadır. Atipik özelliklere sahip görülmektedir herhangi bir organizmanın (oo) kist olarak sayılmamalıdır. Çevre örneklerinin mikroskobik analizi otomatik floresan veya FITC-konjuge anti-Cryptosporidium ve / veya anti-Giardia antikorları 1 ile çapraz reaksiyona girebilir organizmalar olduğu gibi zor olabilir. Bir analist su mikrop ve Cryptosporidium ve Giardia belirlenmesi deneyim kazanmak için slaytlar gözden onlarca aşina olması önerilir. En az üç (oo) pozitif boyanma kontrolü slaytta kistler önce mikroskop her oturumuna karakterize edilmelidir. Kalite kontrol örneklerinde yüzde rec belirlemek için (oo) kistleri ile çivili olabilirHesaplama kullanarak her protozoon için over: (Oo) kist Yüzde Kurtarma = ((QC Örnek Sayısı - Unspiked Örnek gelen sayın) / Spike) x 100. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig1.jpg" /> Şekil 1. Teğet akış boş elyaf ultrafiltrasyon sisteminin grafik gösterimi. Tüp yardım için renk kodlu olan sistem montaj olduğunu. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig2.jpg" /> Şekil 2. Cryptosporidium ve Giardia (oo) kistler Temsilcisi floresan görüntü. Ookistleri Cryptosporidium ve Giardia kistleri FITC etiketli anti-Cryptosporidium / Giardia antikor ile boyandı. Oklar, Giardia kistleri, ok uçları, Cryptosporidium ookistleri. Dört Cryptosporidium ookistleri ve altı Giardia kistleri toplam odak düzlemi bulundu. Örnekleri gözlemler200X büyütme altında ed. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig3.jpg" /> . Karakterizasyonu için kullanılan Cryptosporidium ookistleri ve Giaridia kistlerin Şekil 3 Temsilcisi mikroskobik görüntüleri Cryptosporidium ookistleri (A - C).. Dört farklı gök mavisi DAPI çekirdekleri (B) ve oosit başına 1-4 sporozoitlerine (S) (C) kadar içeren parlak vurgulanan kenarları (A) çapında küresel nesneleri 4 ila 6 mikron parlak elma yeşili FITC floresans. Giardia kistleri (D - F). Ovoid nesnelere yuvarlak 8 Brilliant elma-yeşil floresans FITC - 5 tarafından uzun 18 um - dört gök mavisi DAPI çekirdek (E) kadar içeren parlak vurgulanan kenarları (D) ve bu tür bir veya daha fazla belirgin bir iç yapısı ile geniş 15 mikron çekirdek olarak (N), medyan gövdesi (M) ve ya axonemes (A) (F). Beyaz oklar, parlak elma yeşili floresans boyama ookistleri Cryptosporidium ve Giardia kistleri woturumlarda; beyaz ok uçları, DAPI pozitif çekirdek. Örnekler 1000X büyütme altında görülmektedir.

<ol><li>DiGiorgio, C. L., Gonzalez, D. A., Huitt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptosporidium+and+Giardia+recoveries+in+natural+waters+by+using+Environmental+Protection+Agency+Method+1623%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cryptosporidium and Giardia recoveries in natural waters by using Environmental Protection Agency Method 1623.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5952(2002).</li>
<li>Hill, V. R., Kahler, A. M., Jothikumar, N., Johnson, T. B., Hahn, D., Cromeans, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistate+evaluation+of+an+ultrafiltration-based+procedure+for+simultaneous+recovery+of+enteric+microbes+in+100-liter+tap+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multistate evaluation of an ultrafiltration-based procedure for simultaneous recovery of enteric microbes in 100-liter tap water samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 4218-4225 (2007).</li>
<li>Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Hahn, D., Narayanan, J., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Amburgey, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid+method+for+simultaneous+recovery+of+diverse+microbes+in+drinking+water+by+ultrafiltration+with+sodium+polyphosphate+and+surfactants%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 6878-6884 (2005).</li>
<li>Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Hahn, D., Amburgey, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+hollow-fiber+ultrafiltration+to+the+USEPA+VIRADEL+technique+and+USEPA+method+1623%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Environ.+Qual%22%5BJournal%5D)">Comparison of hollow-fiber ultrafiltration to the USEPA VIRADEL technique and USEPA method 1623.</a> J. Environ. Qual. 38, 822-825 (2009).</li>
<li>Holowecky, P. M., James, R. R., Lorch, D. P., Straka, S. E., Lindquist, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+ultrafiltration+cartridges+for+a+water+sampling+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of ultrafiltration cartridges for a water sampling apparatus.</a> J. Appl. Microbiol. 106, 738-7347 (2009).</li>
<li>Lindquist, H. D., Harris, S., Lucas, S., Hartzel, M., Riner, D., Rochele, P., Deleon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+ultrafiltration+to+concentrate+and+detect+Bacillus+anthracis%2C+Bacillus+atrophaeus+subspecies+globigii%2C+and+Cryptosporidium+parvum+in+100-liter+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Using ultrafiltration to concentrate and detect Bacillus anthracis, Bacillus atrophaeus subspecies globigii, and Cryptosporidium parvum in 100-liter water samples.</a> J. Microbiol. Methods. 70, 484-492 (2007).</li>
<li>Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+1MDS+electropositive+microfilters+for+simultaneous+recovery+of+multiple+microbe+classes+from+tap+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water.</a> J. Microbiol. Methods. 68, 260-266 (2007).</li>
<li>Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hollow-fiber+ultrafiltration+primary+concentration+of+pathogens+and+secondary+concentration+of+viruses+from%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from.</a> 176, 38-45 (2011).</li>
<li>Shaw, N. J., Villegas, L. F., Eldred, B. J., Gaynor, D. H., Warden, P. S., Pepich, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+to+EPA+Method+1623+to+address+a+unique+seasonal+matrix+effect+encountered+in+some+U.S.+source+waters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Modification to EPA Method 1623 to address a unique seasonal matrix effect encountered in some U.S. source waters.</a> J. Microbiol. Methods. 75, 445-448 (2008).</li>
<li>Simmons, O. D. 3rd, Sobsey, M. D., Heaney, C. D., Schaefer, F. W. 3rd, Francy, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+detection+of+Cryptosporidium+oocysts+in+surface+water+samples+by+method+1622+using+ultrafiltration+and+capsule+filtration%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Concentration and detection of Cryptosporidium oocysts in surface water samples by method 1622 using ultrafiltration and capsule filtration.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 1123-1127 (2001).</li>
<li>Sobsey, M. D., Glass, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+water+quality+on+enteric+virus+concentration+by+microporous+filter+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influence of water quality on enteric virus concentration by microporous filter methods.</a> Appl. Environ. Microbiol. 47, 956-9560 (1984).</li>
<li>USEPA. Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Office+of+Water%22">Office of Water</a>. 815-R-05-002, EPA. (2005).</li>
<li>Ware, M. W., Wymer, L., Lindquist, H. D., Schaefer, F. W. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+alternative+IMS+dissociation+procedure+for+use+with+Method+1622%3A+detection+of+Cryptosporidium+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an alternative IMS dissociation procedure for use with Method 1622: detection of Cryptosporidium in water.</a> J. Microbiol. Methods. 55, 575-583 (2003).</li>
<li>Zuckerman, U., Tzipori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portable+continuous+flow+centrifugation+and+method+1623+for+monitoring+of+waterborne+protozoa+from+large+volumes+of+various+water+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Portable continuous flow centrifugation and method 1623 for monitoring of waterborne protozoa from large volumes of various water matrices.</a> J. Appl. Microbiol. 100, 1220-1227 (2006).</li>
</ol>

Amerika Birleşik Devletleri Çevre Koruma Ajansı Yeraltı Suyu ve İçme Suyu Teknik Destek Merkezi&#39;nin Ofisi işbirliği ile Araştırma ve Geliştirme kendi Ofisi aracılığıyla burada açıklanan araştırma finanse. Tüm çalışmalar US EPA, Cincinnati, Ohio yerinde desteklenmiştir. Bu makalede açıklanan bilgiler Shaw Çevre ve Altyapı, Inc sözleşme kapsamında Amerika Birleşik Devletleri Çevre Koruma Ajansı (Sözleşme EP-C-06-031) tarafından kısmen veya tamamen finanse edilmiş olsa da, mutlaka görüşünü yansıtmaz Ajansı ve hiçbir resmi ciro sonucuna varılamaz. Bu Ajansı gözden geçirilir ve yayın için onaylanmıştır.

Teğetsel akış boş elyaf ultrafiltrasyon Cryptosporidium ookistleri ve su Giardia kistlerinin başlangıç ​​konsantrasyonu için alternatif ve etkili bir tekniktir. İçi boş elyaf ultrafiltrasyon geleneksel filtreler daha ucuzdur. Farklı su matrisler çeşitli Cryptosporidium ookistleri ve Giardia kistleri konsantre yeteneğine sahiptir yana EPA Method 1623 için kullanılan mevcut filtrasyon teknikleri için yararlı bir alternatiftir. Diğer çoğu filtrasyon yöntemleri olduğu gibi, boş elyaf ultrafiltrasyon son derece bulanık örnekleri ile kirlenme eğilimli. Yüksek basınçlı su filtresi kirlenme sonucu olurdu; bu nedenle filtrasyon çalışması sırasında basıncı izlemek için tavsiye edilir. Cryptosporidium ookistleri ve Giardia kistler ek olarak, oyuk-fiber ultrafiltrasyon bakteri ve virüsler 1-3,5,8 konsantre yeteneğine sahip olduğu gösterilmiştir. İçi boş elyaf ultrafiltrasyon oBu yöntemde utlined tek bir örnek olarak birden organizmalar konsantre etmek için kullanılabilir. Bu, 200 ve 250 ml arasında nihai bir hacim elde etmek (oo) kist kaybına neden olabilir bu ekstra santrifüj adımları böylece konsantrasyon prosedürü kritik son adım, (adım 2.2) kaçınılmalıdır olduğu dikkat çekicidir. Retentat şişe içine tüm ookistleri veya kistler zorlamak için yeterince sıvı hacmi söz konusu olamayacağından Ancak, şişe hacmi çok düşük bırakabilirsiniz verimleri üzerindeki olumsuz etkileri olabilir. Bu nedenle, 200 ve 250 ml arasında bir nihai hacmi sağlamak için tavsiye edilir. Isıl ayrışma Yöntem, 1623 yılında asit ayrışma adıma bir alternatiftir. Bu alternatif adım Cryptosporidium ookist kurtarma geliştirmek ve nehir veya su reaktif 9 ya izole, yöntem farklılıkları azaltmak için gösterilmiştir. Asit ve ısı ayrışma yöntemlerinin yan yana karşılaştırma göstermiştir ki çözülme için ısı kullanımıte immunomanyetik boncuklar organizmalar Cryptosporidium ve Giardia hem de yüksek ortalama kurtarma üretti. Buna ek olarak, Cryptosporidium ve Giardia kurtarma hassasiyeti asit ayrışma 9 ile karşılaştırıldığında ısı ayrışma ile işlenen örneklerin daha iyiydi. Konsantrasyonu adım olarak HFUF ile birleşmesiyle bir çok mikroorganizma konsantre olma yeteneği sunarak daha fazla esneklik sağlar. Buna ek olarak mevcut Yöntem 1623 filtreleme seçenekleri daha az pahalı bir alternatif.

<table border="1"><tbody><tr><td> Ekipman / Reaktif </td><td> Satıcı </td><td> # Kataloğa </td></tr><tr><td> Asahi Kasei 25 S / R ıslak boş elyaf ultrafilters Rexeed </td><td> Tıp Dial </td><td> REXEED25S / R </td></tr><tr><td> I / P 73 (Masterflex R-3603) ya da eşdeğeri </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.408-73 </td></tr><tr><td> L / S 24 (Masterflex Platin-cured) veya eşdeğeri </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96.410-24 </td></tr><tr><td> L / S 15 (Masterflex Platin-cured) veya eşdeğeri </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96.410-15 </td></tr><tr><td> L / S 36 (Masterflex Platin-cured) veya eşdeğeri </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96.410-36 </td></tr><tr><td> I / P Precision Drive Fırçasız </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-77.410-10 </td></tr><tr><td> I / P Kolay Yükleme Pompa Merkez </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-77601-10 </td></tr><tr><td> Siyah HDPE Te, 1/4 &quot;x 3/8&quot; x 3/8 &quot; </td><td> ABD Plastik </td><td> 62064 </td></tr><tr><td> Masterflex T-konnektör L / S 15-25 </td><td> Cole Parmer </td><td> EG-30.613-12 </td></tr><tr><td> Nalgene ağır pp 1 L şişe </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.257-10 </td></tr><tr><td> 10 ml pipet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-11C </td></tr><tr><td> 1/4 &quot;boru için Nalgene doldurma / havalandırma kapağı, 53B </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.258-10 </td></tr><tr><td> Basınç ölçer </td><td> Cole Parmer </td><td> A-680-46-10 </td></tr><tr><td> Düz kaplin, NPT (F), 1/4 &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.469-18 </td></tr><tr><td> NPT şube tee, doğal pp </td><td> Cole Parmer </td><td> A-30610-75 </td></tr><tr><td> Çimdik kelepçeler, 1/2 &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.833-00 </td></tr><tr><td> Custom uygun DIN adaptörleri </td><td> Kalıplı Ürünler Corp </td><td> MPC-855NS.250 </td></tr><tr><td> Zil standı </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-670B </td></tr><tr><td> Zil standı kelepçeler </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-769-6Q </td></tr><tr><td> Keck rampa kelepçe, 14mm </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.835-10 </td></tr><tr><td> Sodyum polifosfat </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 305553 </td></tr><tr><td> Sodyum tiyosülfat pentahidrat </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 72050 </td></tr><tr><td> Köpük önleyici Y-30 emülsiyon </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A5758 </td></tr><tr><td> Tween-80 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> 10 L katlanabilir yüksek yoğunluklu polietilen cubitainer </td><td> VWR </td><td> IR314-0025 </td></tr><tr><td> Şişelik Santrifüj </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-663-103 </td></tr><tr><td> 250 ml konik bir santrifüj tüpünde </td><td> Corning </td><td> 430776 </td></tr><tr><td> Tek huni </td><td> Cole Parmer </td><td> U-6122-10 </td></tr><tr><td> Şişe yıkayın </td><td> Cole Parmer </td><td> U-06252-40 </td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X-15R </td></tr><tr><td> Swinging kova rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> ARIES SX4750 </td></tr><tr><td> 250 ml konik tüpler için kova adaptörleri santrifüjleyin </td><td> Beckman Coulter </td><td> 349849 </td></tr><tr><td> 200 ul çapı büyük pipet uçları </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-707-134 </td></tr><tr><td> VacuShield Filtre </td><td> Gelman </td><td> 629-4402 </td></tr><tr><td> 5 ml pipet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-11D </td></tr><tr><td> Dynabeads: Cryptosporidium / Giardia kombo kiti </td><td> BenDEXX </td><td> 73002 </td></tr><tr><td> 50 ml konik bir santrifüj tüpünde </td><td> Şahin </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Dynal L10 yassı yüzlü tüpler </td><td> Idexx </td><td> 74003 </td></tr><tr><td> Timer </td><td> VWR </td><td> 23609-202 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-6 mıknatıs </td><td> Idexx </td><td> 12002D </td></tr><tr><td> 1 ml pipetler </td><td> VWR </td><td> 53283-700 </td></tr><tr><td> 1.5 ml az yapışma mikrosantrifüj tüpleri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-320 </td></tr><tr><td> 1000 ul pipet ve ilgili bariyer ipuçları </td><td> Gilson </td><td> P1000/DF1000ST </td></tr><tr><td> 100 ul pipet ve ilgili bariyer ipuçları </td><td> Gilson </td><td> P100/DF100ST </td></tr><tr><td> 9 inç Pasteur pipetler </td><td> VWR </td><td> 14672-412 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-S mıknatıs </td><td> Idexx</td><td> 12020D </td></tr><tr><td> Girdap </td><td> VWR </td><td> 14216-188 </td></tr><tr><td> Dynabeads rotator karıştırıcı </td><td> Idexx </td><td> 94701 </td></tr><tr><td> Isı blok </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-718-2 </td></tr><tr><td> Lab Armor Boncuk </td><td> Lab Zırh </td><td> 42370-750 </td></tr><tr><td> Dijital termometre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15-077-60 </td></tr><tr><td> Fosfat tampon tuzlu 1X pH 7.4 (1X PBS) </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td></tr><tr><td> Tek Nokta slaytlar </td><td> Idexx </td><td> 30201 </td></tr><tr><td> Cam Kapak </td><td> Corning </td><td> 287018 </td></tr><tr><td> Doğrudan kiti EasyStain </td><td> BTF </td><td> - </td></tr><tr><td> 10 ul pipet ve ilgili bariyer ipuçları </td><td> Gilson </td><td> P10 &amp; DF10ST </td></tr><tr><td> 4 &#39;, 6&#39;-Diamidino-2-fenil indol dihidroklorid (DAPI) </td><td> Sigma </td><td> D9542 </td></tr><tr><td> Tırnak cilası Temizle </td><td> Fisher Scientific </td><td> S30697 </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> L6815 </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly Clark </td><td> 34155 </td></tr><tr><td> Kuluçka makinesi </td><td> Boekel Bilimsel </td><td> 133000 </td></tr><tr><td> sıcak kaydırın </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-474-521 </td></tr><tr><td> Daldırma yağ, A ND = 1.515 yazın </td><td> Nikon </td><td> MXA20234 </td></tr><tr><td> DIC yetenekleri ile Nikon 90i mikroskop </td><td> Nikon </td><td> MBA 77000 </td></tr><tr><td> Planı APO 100X yağlı objektif </td><td> Nikon </td><td> MRD01901 </td></tr><tr><td> Akroma 20X planlayın </td><td> Nikon </td><td> MRL00202 </td></tr><tr><td> FITC filtresi </td><td> Nikon </td><td> 96302 </td></tr><tr><td> DAPI filtresi </td><td> Nikon </td><td> 96301 </td></tr><tr><td> Floresan aydınlatma X-cite </td><td> Nikon </td><td> 87540 </td></tr><tr><td> Lens kağıt </td><td> Nikon </td><td> 76997 </td></tr><tr><td> Biohazard tek torba </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01-829D </td></tr><tr><td> Biohazard tasfiye edin </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-827-117 </td></tr><tr><td> % 3 hidrojen peroksit </td><td> VWR </td><td> BDH3540-2 </td></tr><tr><td> Ağartıcı </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1952030 </td></tr><tr><td> Wypall </td><td> Kimberly Clark </td><td> 34790 </td></tr></tbody></table>

su bazlı algılamak için teğet akış hollow-fiber ultrafiltrasyon ve isı disosiyasyon adımlar kullanır a modifiye epa method 1623<em&gt; cryptosporidium</em&gt; ve<em&gt; giardia spp.</em

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Cryptosporidium ve Giardia türlerin neden olan su kaynaklı ishal salgınları dünyada protozoa en yaygın ikisidir. Daha iyi bu patojenlerin prevalans karakterize etmek için, EPA Method 1623 geliştirilen ve ABD içme sularında bu organizmaların düzeylerini izlemek için kullanılan 12 sağlamaktadır. Metodu, üç ana bölümden oluşur; birinci ham yüzeyi su en az 10 L süzüldü edildiği Örnek konsantrasyonudur. Organizmalar ve tuzağa enkaz sonra filtreden yıkandı ve daha örnek konsantre santrifüje edilir. Yöntemin ikinci bölümü konsantre su numunesi özellikle konsantre enkaz gelen parazitler belirli çıkarılması için izin ookistleri Cryptosporidium ve Giardia kistleri bağlamak immunomanyetik boncuk için uygulanan bir immunomanyetik ayırma işlemi kullanır. Bunlar (oo) kistler sonra bir asit ayrışma Proce tarafından manyetik boncuk ayrıdırDure. Yöntemin son bölümü (oo) kistler bir slayt, lekeli uygulanır ve mikroskop ile numaralandırılan immünofloresan boyama ve numaralandırmasıdır. Envirochek filtreleri (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), Envirochek HV filtreler (Pall Corporation), Filta-Max filtreler (Idexx, Westbrook, MA): Yöntem 1623 suda ookistleri Cryptosporidium ve Giardia kistleri yakalamak için dört halka örnek konsantrasyonu sistemleri vardır veya Sürekli Akış Santrifüj (Haemonetics, Braintree, MA). Ancak, Cryptosporidium ve Giardia (oo) kist kurtarma 1,14 kullanılan su kaynağı matrisi ve filtreleri bağlı olarak büyük farklılıklar var. Yeni teğet akış boş elyaf ultrafiltrasyon (HFUF) sistemi kısa bir süre Cryptosporidium ookistleri geri at daha verimli ve daha sağlam olması gösterilmiştir ve çeşitli su matrislerinden Giardia kistleri, dahası, diğer kapsül filtre seçeneği daha ucuzdurs ve aynı anda birden fazla patojen 1-3,5-8,10,11 konsantre olabilirsiniz. Ayrıca, Hill ve arkadaşları tarafından daha önceki çalışmalarda doğrudan Envirochek HV filtreleri 4 ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde HFUF Cryptosporidium ookistleri kurtarma geliştirilmiş olduğunu göstermiştir. Mevcut yöntem ek olarak modifiye metodu performansını iyileştirmek için rapor edilmiştir. Isı ile ayrışma asidin ayrılması prosedüre değiştirilmesi bazı matrisler 9,13 içinde manyetik boncuklar Cryptosporidium ayırma daha etkili olduğu gösterilmiştir. Bu protokol, ısı ile ayrışma adım yeni HFUF filtrasyon sistemini kullanan bir modifiye Yöntem 1623 açıklanmaktadır. Bu modifiye Yöntemi ile HFUF kullanımı mevcut EPA Method 1623 filtreleme seçenekleri için daha ucuz bir alternatif olduğunu ve bir çok mikroorganizma konsantrasyonunu izin vererek daha fazla esneklik sağlar.

Bu protokol, su bazlı tespiti için alternatif adımlar olarak teğet akış boş elyaf ultrafiltrasyon numune konsantrasyonu sisteminin kullanımı ve ısı ayrışma açıklar<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Ve<em&gt; Giardia</emEPA Method 1623 kullanarak&gt; türler.

Su bazlı Algılamak için Teğet Akış Hollow-fiber Ultrafiltrasyon ve Isı Disosiyasyon Adımlar kullanır A Modifiye EPA Method 1623<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Ve<em&gt; Giardia spp.</em

Cryptosporidium ve Giardia türleri, dünya çapında suyla bulaşan diyareik hastalık salgınlarına neden olan en yaygın iki protozoondur. Daha iyi...

Bu prosedürün genel amacı, suyla bulaşan cryptosporidium ve giardia türlerini tespit etmek ve görselleştirmektir. Bu işlem, ilk olarak su örneğinin teğetsel akışlı, içi boş fiber ultrafiltrasyon kullanılarak konsantre edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, bir santrifüjleme aşamasını takiben organizmaların elüe edilmesi ve filtreden kalıntıların tutulmasıdır.İmmünomanyetik ayırma, parazitlerin konsantre kalıntılardan seçici olarak ayrılmasını sağlar. Manyetik boncuklar, ısı ile ayrıştırma yoluyla parazitlerden koparılır ve bir mıknatıs kullanılarak uzaklaştırılır. Ardından kistler ve O kistleri bir lam üzerine yerleştirilir ve numune, immünofloresan mikroskobu ile görüntüleme için boyanır.Hofi filtrasyonunun mevcut tekniklere göre temel avantajı, ultra filtrenin önemli ölçüde daha düşük maliyetli olması ve Cryptosporidium ile Giardia'nın yanı sıra virüsler ve bakteriler gibi çok sayıda mikroorganizmayı yakalayabilmesidir. Genel olarak, immünoseparasyona yeni başlayan kişiler, çok farklı iklim koşullarından gelen farklı numunelerle ilişkili döküntülerin miktarı ve türü nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Ultra filtrasyon düzeneğini bir biyogüvenlik kabini içerisinde kurarak başlayın.Sistem kurulduktan sonra şu şekilde çalışır: su örneği siyah T konnektörden geçerek sisteme girer; pompa kafası, basınç göstergesi üzerinden geçerek içi boş fiber ultra filtreye ilerler; filtrelenen su, filtrenin yan tarafındun atık kabına akar. Organizmaları içeren tutulan su, retent şişesine zorlanır ve su hacmi azalana kadar sistem üzerinden yeniden dolaşıma sokulur. İşleme başlamak için havalandırma kapağını çıkarın ve retent şişesinin suyla dolmasını sağlamak için kapalı olması gereken ikinci sıkıştırma klempi dışındaki tüm klempleri açın; pompa yönünü su örneğinin filtreye akacağı şekilde ayarlayın.Ardından pompa hızını %25'e ayarlayın ve renate şişesi üçte ikisinin dolduğunda pompayı çalıştırın. İkinci sıkıştırma klembini kapatın ve havalandırma kapağını kullanarak şişeyi hızla sıkıca mühürleyin. Sızıntı olmadığından emin olmak için tüm hatları ve bağlantı parçalarını kontrol edin.Ardından, dereceli silindir ve zamanlayıcı veya bir akış ölçer kullanarak pompa hızını yavaşça dakikada yaklaşık 1,5 litreye çıkarın ve filtrat hızının, yani effluent hattından çıkan suyun hızının gerçekten dakikada 1,5 litre olduğunu doğrulayın. Reten şişesinin hacmi hafifçe artsa veya azalsa da, şişenin asla boşalmadığından emin olarak filtrasyon sürecini izleyin. Hacim üçte birin altına düşerse, havalandırma kapağını çıkarın ve ikinci sıkıştırma klembini kapatın.Şişedeki hacmin tekrar üçte ikisine ulaşmasına izin verin. Ardından havalandırma kapağını sıkıca kapatın ve iki numaralı klempi tekrar açın. Örnek kabı boşaldığında, bir numaralı sıkıştırma klembini hemen kapatın ve pompa hızını %20'ye düşürün. Retentat şişesindeki havalandırma kapağını çıkarın ve filtre kolon çıkış tüpünü atık tankına bağlayan rampa klembini kapatın.Retentat şişesindeki hacmi yaklaşık 200 mililitreye ayarlamak için rampa klempsini sıkın veya gevşetin. Ardından, örneği elüe etmek için rampa klempsini elüasyon konumunda sıkın. İlk olarak, işlem sırasında kabın içini durulayarak örnek kabına 500 mililitre elüasyon çözeltisi ekleyin.Ardından, numune alma hattına bağlı olan 10 mililitrelik pipeti elüasyon çözeltisi kabına yerleştirin. Elüasyon çözeltisini çekmek için birinci sıkıştırma kelepçesini açın ve ikinci sıkıştırma kelepçesini anlık olarak kapatın. Çözeltinin tamamı yüklendiğinde, birinci sıkıştırma kelepçesini kapatın, ikinci sıkıştırma kelepçesini açın ve çözeltinin %20 pompa hızıyla beş dakika boyunca dolaşmasını sağlayın; renat şişesindeki numune hacmini yaklaşık 100 mililitreye ayarlamak için rampa kelepçesini sıkın veya gevşetin.Ardından rampa kelepçesini tamamen sıkın ve numunenin bir dakika boyunca yeniden dolaşmasına izin verin. Bu noktada, pompanın yönünü 20 saniye boyunca tersine çevirin. Bu işlem, tate şişesinde yaklaşık 225 mililitre numunenin birikmesini sağlayacaktır.Ardından pompayı kapatın. Boruları pompa başlığından ve filtreden çıkan boruyu çıkarın; kalan tüm örneği şişeye aktarmak için boruları tate şişesinin üzerinde tutun. Daha sonra tüm boruları şişeden ayırın ve havalandırma kapağını havalandırmasız bir kapakla değiştirin.Konsantre örneği 250 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın. Renat şişesini iki kez 10 mililitre reaktif su ile durulayıp durulama sıvısını santrifüj tüpüne aktarın. Örneği minimum 1500 ×g'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin.Santrifüjü durdurmak için fren kullanmayın. Santrifüj işleminin ardından, süpernatantı peletin beş mililitre üzerinde kalacak şekilde dikkatlice aspire edin. Sıvı seviyesinin üst kısmında kalmaya ve pelet içindeki O kistlerini ve kistleri aspire etmekten kaçınmaya özen gösterilmelidir.Peleti tamamen yeniden süspande etmek için tüpü vorteksleyin. Ardından örneği, her biri bir mililitre 10 X SL tampon A ve tampon B içeren düz kenarlı bir dyal L 10 tüpüne aktarın. Santrifüj tüpünü 2,5 mililitre reaktif su ile iki kez durulayın ve durulama solüsyonunu dyal L 10 tüpüne ekleyin. Son hacmi 12 mililitreye tamamlayacak şekilde, tüpe manyetik boncuk konjuge, anti cryptosporidium ve anti giardia antikorlarından her birinden 100 mikrolitre ekleyin.Ardından tüpü, rotasyon sonrası oda sıcaklığında bir saat boyunca döner karıştırıcıda 18 RPM hızında döndürün. Tüpün düz tarafını MP altı mıknatısına yaslayın ve tüpü mıknatıstan ayırmadan iki dakika boyunca hafifçe sallayın. Düz tarafı yukarıda tutarak süpernatanı boşaltın.Mıknatıs yakınındaki tüpün düz tarafında tutulan boncukları rahatsız etmemeye dikkat edin. Örnek tüpünü mıknatıstan çıkarın ve tüpün yuvarlak tarafındaki kalıntılara değmeden, düz tarafı üç kez 500 µL tampon A ile yıkayın. Her bir yıkama hacmini, bir MPCS mıknatıs içinde tutulan 1,5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.Mıknatıs dikey konumdayken tüpü kapatın ve bir dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Ardından mıknatıs yerindeyken, tüpün altına yerleştirilmiş bir pastör pipeti kullanarak süpernatanı aspire edin ve tüpe nazikçe bir mililitre PBS ekleyin.Boncuk peletinin bozulmamasına dikkat edin. Mıknatısa komşu tüp duvarına tutturun. Manyetik şeridi çıkarın ve boncuklar yeniden süspande olana kadar tüpü nazikçe sallayın.Manyetik şeridi tekrar dikey konuma getirin. Tüpü bir dakika boyunca hafifçe sallayın ve boncukları yerinden oynatmadan mümkün olduğunca fazla kalıntıyı uzaklaştırarak süpernatanı aspire edin. Bu yıkama işleminden sonra mıknatısı kaldırın ve doğrudan boncuk paletinin üzerine 50 µL reaktif su ekleyin.Boncukları yeniden süspande etmek için tüpü tam hızda 50 saniye boyunca vorteksleyin. Ardından, Giardia kistlerinin ve Cryptosporidium o-kistlerinin boncuklardan ayrışmasını sağlamak için örneği 80 °C'de 10 dakika inkübe edin. İnkübasyon sonrası örneği 30 saniye boyunca vorteksleyin. Daha sonra, süspansiyondaki kistleri ve O-kistlerini boncuklardan ayırmak için manyetik şeridi eğimli konumda kullanarak MPCS'ye yerleştirin.Kistler ve O kistleri içeren süpernatantı bir kuyucuk lamına aktarın. Süpernatantı aynı lama ekleyerek, su ilavesi, vorteksleme ve ısı ile ayrıştırma adımlarını ikinci kez tekrarlayın. Ardından, süspansiyonu kurutmak için lamı 37 °C'lik bir lam ısıtıcıya yerleştirin.Örneği sabitlemek için slayta 50 µL metanol uygulayarak başlayın ve oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Ardından, 50 µL DPI çözeltisi ekleyin ve slaydı oda sıcaklığında iki dakika boyunca inkübe edin. Çekirdekleri boyamak için, kuyuya temas etmemeye dikkat ederek bir Kim wipe yardımıyla kuyudaki sıvıyı emdirin.Ardından, Giardia kistlerinin ve Cryptosporidium o kistlerinin hücre duvarını boyamak için 50 µL easy stain ekleyin. Numuneyi 35 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Boyayı daha önce olduğu gibi Kim wipe ile temizleyin.Ardından, pipet ucunu kuyucuğun dışına dikkatlice yerleştirip sıvının kuyucuğun içine akmasını sağlayarak 300 µL soğuk easy stain tespit tamponu yavaşça ekleyin. Lamı oda sıcaklığında iki dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra tamponu bir KimWipe ile temizleyin ve 10 µL mountlama medyumu uygulayın; örneğin üzerine bir lamel yerleştirerek hava kabarcıklarını giderin ve lameli şeffaf oje ile mühürleyin. Floresan mikroskop kullanarak lamı 200x ile 1000x büyütme arasında ve 200x büyütmede bir fse ardından DPI filtresi ile inceleyin; kistler ve O kistleri, parlak vurgulanmış kenarlara sahip, parlak elma yeşili floresan oval yapılar olarak görünür.Cryptosporidium O kistleri yuvarlaktır ve boyutları dört ila altı mikron arasında değişir. Giardia kistleri ise 1000 x büyütmede yuvarlak veya oval olabilir ve beş ila 15 mikron genişliğe, sekiz ila 18 mikron uzunluğa sahip olup daha büyüktür. DPI filtresi kullanıldığında, kistlerin ve CYS'lerin iç yapısı daha iyi gözlemlenebilir.Genellikle, gökyüzü mavisi DPI boyalı çekirdekler şeklinde görünen dört adete kadar sporozoit, Cryptosporidium O kistleri ve Giardia Cys.DIC içerisinde görülebilir. Mikroskopi, ek morfolojik özelliklerin değerlendirilebilmesi sayesinde parazitlerin doğru tanımlanmasına da yardımcı olabilir. Cryptosporidium sporozoitleri DIC ile görülebilir; Giardia kistleri ise genellikle görünür çekirdekler, median cisimler adı verilen hilal şeklinde organeller ve aksonlar adı verilen dahili kamçılı yapılar gibi bir veya daha fazla belirgin iç yapı sergiler.Holo fiber ultrafiltrasyon prosedürünün birden fazla mikroorganizmayı yakalama kapasitesine sahip olduğunu belirtmek önemlidir. Ayrıca, konsantre edilmiş örneklere qPCR ve genotipleme gibi diğer tespit analizleri uygulanabilir; bu da yöntemi daha esnek ve uygulamalarınıza daha uygun hale getirir. İzlediğiniz için teşekkür ederiz, herhangi bir sorunuz olursa lütfen bize bildirin.

a-modified-epa-method-1623-that-uses-tangential-flow-hollow-fiber

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Cam yünü filtreler dünyada araştırma gruplarının bir dizi su bazlı virüsler kullanılır konsantre edilmiştir. Burada cam yünü filtreleri oluşturmak için basit bir yaklaşım göstermek ve filtreleri de su kaynaklı viral, bakteriyel ve parazitik patojenlerde konsantre etkilidir göstermektedir.

Konsantre Su Bazlı Virüsler ve Tarım Zoonotik Patojenler için Cam Yünü Filtreler

Büyük hacimli tarımsal sularda gıda kaynaklı patojenlerin entegre konsantrasyon, zenginleştirme ve son nokta kolorimetrik tespitini içeren bir protokol burada sunulmaktadır.  Su, seçici veya seçici olmayan ortamlarla zenginleştirilmiş Modifiye Moore Swablarından (MMS) süzülür ve algılama, bakteriyel-gösterge kolorimetrik substratlarla gömülü kağıt bazlı analitik cihazlar (μPAD) kullanılarak gerçekleştirilir.

Kolorimetrik Algılama Paper-based<em&gt; Escherichia coli</em&gt;<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. Ve<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Tarım Su geniş hacimli

EPA Metod 1615, çevre ve içme sularındaki enterovirüsleri ve norovirüsleri konsantre etmek için elektropozitif bir filtre kullanır. Bu el yazması, Yöntem 1615 analizleri için numune toplama prosedürünü açıklamaktadır.

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirüs Oluşum EPA Metot 1615 Ölçüm. Virüs Örneklerinin I. Koleksiyonu

Burada, Buffalo Green Monkey böbrek hücresi hattını kullanarak toplam kültürlenebilir virüsleri ölçmek için bir prosedür sunuyoruz. Prosedür, çevresel ve içme sularında bulaşıcı virüslerin oluşumunu ölçmek için standartlaştırılmış bir araç sağlar.

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Metot 1615 ölçülmesi. II. Toplam kültürlenebilir virüs Deneyi

Burada, ters transkripsiyon-kantitatif PCR kullanarak çevresel ve içme sularında enterovirüs ve norovirüsü ölçmek için bir prosedür sunuyoruz. EPA Metodu 1615'ten alınan bu standardize prosedürle yeraltı sularından ortalama virüs geri kazanımı, poliovirüs için %20 ve murin norovirüsü için %30 idi.

Enterovirüs Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Method 1615 Ölçümü. Bölüm III. RT-qPCR Virüs Algılama

Otomatik ve minyatür bir sistem kullanılarak su örneklerinden östradiolün ekstraksiyonu ve ön konsantrasyonu için bir protokol sunulmuştur.

Küçük Kirleticilerin İmmünolojik Analizi Su Örneklerinin Otomatik Katı Faz Ekstraksiyon Basit Bir Yöntem

Bu yazıda, aynı anda Enterococcus spp ölçmek için kullanılabilecek bir çift yönlü dijital PCR deneyi. Ve eğlence sularda genel olarak insan ilişkili dışkı kirlenme göstergeleri olarak HF183 genetik işaretleyiciler açıklanmaktadır.

Eşzamanlı Niceleme için Dubleks Dijital PCR Testi<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Ve Waters İnsan Fekal ilişkili HF183 Marker

Burada, dev virüslerin asfarvirüs ile ilgili yeni bir soyu olan Faustovirus'un yeni genotiplerinin karakterizasyonu için viral izolasyondaki en son gelişmeleri açıklıyoruz. Bu protokol, virüslerin, özellikle amipleri enfekte eden dev virüslerin yüksek verimli izolasyonuna uygulanabilir.

Kullanımı Çevre Örneklerinde Yeni Faustoviruses İzolasyonunda bir Hızlı Stratejisi<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

Elektrowetting tabanlı dijital mikroakışkan, manipülasyonunu kolaylaştırmak için mikrolitre hacimli damlacıkların görünür temas açısında voltaj güdümlü bir değişiklik kullanan bir tekniktir. Bunu fonksiyonel manyetik boncuklarla birleştirmek, enzime bağlı İmmünosorbent Test (ELISA) kullanılarak numune hazırlama ve patojenlerin tanımlanması için birden fazla laboratuvar ünitesi operasyonunun entegrasyonunu sağlar.

Otomatik Enzimbağlantılı İmmünosorbent Assay için Elektrowetting tabanlı Dijital Mikroakışkanplatformu

Zebra balığı embriyolarında 16 PAH'ın iç seviyelerini değerlendirmek için modifiye edilmiş bir QuEChERS-HPLC yöntemi geliştirdik.

İnce Partikül Maddeye Maruz Kalan Zebra Balığı Embriyolarında Polisiklik Aromatik Hidrokarbonların Tespiti için Modifiye Edilmiş Bir QuEChERS-HPLC Yöntemi

Öğrenin, su kaynaklı Cryptosporidium ve Giardia tespiti için teğet akış hollow-fiber ultrafiltrasyon, immüno manyetik ayırma ve immünofloresan mikroskopi yöntemlerini. Bu protokol, çevre mikrobiyolojisi ve halk sağlığı araştırmalarında maliyet etkin ve güvenilir bir alternatif sunar.

Su bazlı Algılamak için Teğet Akış Hollow-fiber Ultrafiltrasyon ve Isı Disosiyasyon Adımlar kullanır A Modifiye EPA Method 1623 Cryptosporidium Ve Giardia spp. (Video) | JoVE Journal

Su bazlı Algılamak için Teğet Akış Hollow-fiber Ultrafiltrasyon ve Isı Disosiyasyon Adımlar kullanır A Modifiye EPA Method 1623

Daha fazla video keşfet