Name: Buz Bağlayıcı Protein İncelemelerde LabVIEW çalıştırılan Roman nanolitre Ozmometre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-04T09:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Öğrenin buz bağlayıcı proteinlerin termal histerezisini nanolitre ozmometre ile nasıl ölçülür. LabVIEW kontrollü bu yöntem, buz kristali oluşumunu ve erime davranışlarını hassas sıcaklık kontrolüyle analiz eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma ISF, NSF ve ERC tarafından desteklenmiştir. Biz Randy Milford, Michael Koren, Doug Shafer, ve Jeremy Dennison sıcaklık kademesi ile teknik yardım kabul etmek istiyorum. Yazılım geliştirme ile Yardımlaşma Veya Chen, Di Xu, Rajesh Sannareddy ve Sumit Bhattachary tarafından sağlanmıştır. Biz Mp IBP protein ve yararlı tartışmalar için ortak Prof Peter L. Davies ve Dr Laurie A. Graham teşekkür etmek istiyorum. Biz de teşekkür laboratuar üyeleri Dr Maya Bar-Dolev, Yangzhong Qin, Dr Yeliz Çelik, Dr Natalya Pertaya, Ortal Mizrahy ve kendi kullanıcı geri bildirimleri için Shlomit Guy.

0. Ön Prosedürler <ol><li> Cam çözüm enjeksiyon için kısımdır. Kılcal çektirmesi (Narishige, Tokyo, Japonya) kullanarak, bir cam kapiller mikro tüp (Marka GMBH, Wertheim, Almanya) ince bir açılış ile keskin bir pipet hazırlayın. Açıklık boyutu temiz su içinde ince köpürme sağlamak için kılcal içinden hava geçirerek doğrulanması gerekir. Kılcal kapalı ise, o zaman bir kenarından kırarak açabilirsiniz. Bu tüp duvarları içeren suya karşı bastırarak ya da hafifçe kazınarak gerçekleştirilebilir. Açılış neredeyse bloke edilir ama yeterince milimetrenin altındaki kabarcık oluşumuna izin açık olduğunu kapiller gibi hazırlayın. </li><li> Bakır disk temizleme. Çift distile su ile yıkayın, daha sonra% 0.1 Mikro-90 sabun (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, ABD) 10 dk bakır diskler sonikasyon. Bir izopropanol (teknik) çözeltisi içine diskler tanıtın ve 10 dakika için tekrar sonikasyon. Yüzgeçmüttefiki, filtrelenmiş hava kullanarak diskleri kurutun. Bu temizlik aşamasında deneyler arasındaki IBP kontaminasyonu önlemek için çok önemlidir. </li><li> Çift katmanlı coverglass montaj. A coverglass montaj kapağı cam yüzeyindeki nem yoğuşma olmadan örnek gözlem için izin vermek için hazırlanmıştır. Bu daha sonra bir sıcak tutkal tabancası ile yapıştırılmıştır iki lamelleri arasında Drierite (WA Hammond Drierite, Xenia, Ohio, ABD) parçacık (çapı 2 mm) koyarak elde edildi. Bu konfigürasyon örnek düşük sıcaklıklara soğutulur ve gözlem penceresi üzerinde kuru hava üflemek için ihtiyaç kaldırıldı görünümünü blok olabilir yoğunlaşma engellemiştir. </li></ol> 1. Soğutma Sahne Kurulumu <ol><li> 4 mm iç çaplı Tygon tüp (Saint-Gobain, Paris, Fransa) ile soğutma aşamasında su akışı giriş ve çıkış bağlan, ve bir su pompası, su akışının giriş tüpü bağlanır. </li><li> Soğutma aşaması t girişine 4 mm&#39;lik bir iç çap Tygon tüp bağlankuru hava teslim o. Hava bir in-line Drierite kolon kullanılarak kurutulmuştur. </li><li> Hava ve su pompaları çalıştırın. Soğutma elemanları bir soğutucu olmadan çalıştırmak gerektiğini unutmayın. </li><li> Sıcaklık kontrol, kamera ve LabVIEW rutin açın. </li></ol> 2. Örnek Hazırlanması <ol><li> Disk ile delinen 500 mikron delikleri olan bir 7 mm çapında bakır diskin arka tarafında immersiyon yağı B (Cargille laboratuarlar, Cedar Grove, New Jersey, ABD) bir 3-4 ul damlacığı yerleştirin. </li><li> Aşağı bakacak immersiyon yağı tarafı ile soğutma sahnede bakır diski yerleştirin. </li><li> 2 ml&#39;lik bir cam şırıngaya (Poulten-Graf, Wertheim, Almanya) için diğer uçta bağlanmış bir 0.7 mm iç çaplı Tygon tüp ile bağlantı borusu (küt kenar) bağlanır. </li><li> Önceki kapiler tüp kullanarak, açılış (Ön prosedürler bakın) uygun bir büyüklükte olduğundan emin olmak için kılcal küçük deliğini kontrol edin. </li><li> Yavaşça gla takınss hazırlanan IBP protein örnek tüpü (pH 8 20 mM içinde 2.4 uM Mp IBP-GFP CaCl2 ve 25 mM Tris-HCl, hazırlama ayrıntılar için referans 10) içine kılcal ve kılcal cam 0.1 içerene kadar cam şırıngaya çekme Protein çözeltisi, ul. </li><li> LabVIEW yazılımı ile video kayıt başlayın. </li><li> Soğutma aşamasında bakır disk içinde deliklerin biri içine kılcal cam (protein çözeltisi içeren) keskin kenar yerleştirin. </li><li> (Olympus, Tokyo, Japonya, 10x objektif) mikroskop ile dikkat ederken, dikkatle cam kapiller ucu daldırma yağ tabakası nüfuz ve protein az miktarda (~ 10 nl) sunmak için cam şırınga (çok ince) tuşuna basın 200 mikron damlacık oluşturmak için bir çözüm. </li><li> Çift katmanlı coverglass montaj (Ön Prosedürler bakınız) ile soğutma aşamasında deliği kapatın. </li></ol> 3. TH Etkinlik Ölçümü <ol><li> Önss soğutma düğmesi ve -40 sıcaklığını ayarlamak ° C </li><li> Başlangıçta, çözüm damlacık açık olacaktır. Düşük sıcaklıklarda, tipik aralık içinde -30 ° C ile -35 çözelti dondurulmuştur belirten ° C, damlacık renk değiştirir. Toplu buz erimeye başlayana kadar örnek donduktan hemen sonra, yavaş yavaş sıcaklığını arttırın. Sıcaklığın bir kademeli artış numune tamamen erimesi neden olabilir sıcaklık aşılmaz önlemek için gereklidir. </li><li> Bir 50x objektif geçin ve sıcaklığını ayarlayarak buz erimeye başlar. Bu ayarlama, interaktif, ve son aşamalar, genellikle 0,002 ° C arasında küçük sıcaklık aşamalarını kullanarak gerçekleştirilir Tek bir kristal kalmayana kadar erimeye devam edin. Kristalin nihai boyutu 10 mikron civarında olmalıdır. Erime durdurulmuştur olan en yüksek ısı erime noktası olarak tespit edilir ve daha sonra video analiz aşamada doğru şekilde belirlenir. </li> &lt;li&gt; kristalin erime noktasının altındaki bir santigrat derece arasında birkaç yüzde için sıcaklığına getirin ve 10 dakika gecikme ile bir sıcaklık rampası başlar. Istediğiniz gibi rampalanma oranını ayarlayın. Bu süre zarfında, kristal IBPs maruz kalacağı. </li><li> 10 dakika maruz kalma süresi tamamlandıktan sonra, sıcaklık LabVIEW rutin otomatik olarak kontrol altında azalacaktır. </li><li> Sıcaklık azaldıkça olarak kristal şekli dikkate alınmalıdır. Bir noktada, buz kristali ani patlama görülebilir. Bu gerçekleştiği sıcaklık kristal patlama sıcaklığı olarak not edilir. </li><li> Doğru erime noktası ve patlama sıcaklığı belirlemek için video analiz kullanın. İlk olarak, görüntü analizleri kullanılarak, kesin erime noktası bulabilirsiniz. Erime bittikten hangi yüksek sıcaklık erime noktası olmaya kararlı olduğunu hatırlayın. Bir elektronik tablo programı bu erime noktası belgeleyin. Sonra, hassas kristal patlama sıcaklığı belirlemek ve bu değeri belgelemekgibi. Erime noktası ve donma noktası, veya kristal patlama sıcaklık arasındaki fark IBP çözeltisinin termal histerezis faaliyettir. </li></ol> 4. Zamana bağlı TH Aktivitenin Ölçümü <ol><li> Buzun tek bir kristali hazırlamak için Bölüm 3.1-3.3 de tarif edilen protokol takip edin. </li><li> Kristal oluşumunu sonra, istediğiniz gibi rampa gecikme süresini ayarlamak ve rampa açın. </li><li> Sıcaklığı otomatik kez rampa gecikme süresi dolduktan (operatörlerinin ihtiyaçlarına göre) sabit bir oranda azalacaktır. </li><li> Kristal çoğuşma oluştuğu sıcaklık belge. Pozlama süresi (kristal oluşumu ve kristal patlama arasındaki zaman) hesaplayın. </li><li> Çeşitli gecikme zamanları için deney tekrarlayın ve TH aktivitesi zaman bağımlılığı değerlendirmek için maruz kalma süresinin bir fonksiyonu olarak TH aktivitesi çizmek. </li></ol>

<ol><li>DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteins+as+biological+antifreeze+agents+in+antarctic+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Glycoproteins as biological antifreeze agents in antarctic fishes.</a> Science. 172, 1152-1155 (1971).</li>
<li>Worrall, D., Elias, L., Ashford, D., Smallwood, M., Sidebottom, C., Lillford, P., Telford, J., Holt, C., Bowles, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+carrot+leucine-rich-repeat+protein+that+inhibits+ice+recrystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A carrot leucine-rich-repeat protein that inhibits ice recrystallization.</a> Science. 282, 115-117 (1998).</li>
<li>Raymond, J. A., Knight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice+binding%2C+recrystallization+inhibition%2C+and+cryoprotective+properties+of+ice-active+substances+associated+with+Antarctic+sea+ice+diatoms%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Ice binding, recrystallization inhibition, and cryoprotective properties of ice-active substances associated with Antarctic sea ice diatoms.</a> Cryobiology. 46, 174-181 (2003).</li>
<li>Tomchaney, A. P., Morris, J. P., Kang, S. H., Duman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+composition%2C+and+physical+properties+of+a+thermal+hysteresis+%22antifreeze%22+protein+from+larvae+of+the+beetle%2C+Tenebrio+molitor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification, composition, and physical properties of a thermal hysteresis "antifreeze" protein from larvae of the beetle, Tenebrio molitor.</a> Biochemistry. 21, 716-721 (1982).</li>
<li>Kiko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+freeze+protection+in+a+sea-ice+crustacean+through+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Polar+Biology%22%5BJournal%5D)">Acquisition of freeze protection in a sea-ice crustacean through horizontal gene transfer.</a> Polar Biology. 33, 543-556 (2010).</li>
<li>Robinson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+adaptation+in+Arctic+and+Antarctic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Cold adaptation in Arctic and Antarctic fungi.</a> New Phytol. 151, 341-353 (2001).</li>
<li>Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+antifreeze+protein+activity+in+Antarctic+lake+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria.</a> Microbiology. 150, 171-180 (2004).</li>
<li>Raymond, J. A., DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+inhibition+as+a+mechanism+of+freezing+resistance+in+polar+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 2589-2593 (1977).</li>
<li>Pertaya, N., Marshall, C. B., DiPrinzio, C. L., Wilen, L., Thomson, E. S., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+evidence+for+quasi-permanent+attachment+of+antifreeze+proteins+to+ice+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces.</a> Biophys. J. 92, 3663-3673 (2007).</li>
<li>Celik, Y., Graham, L. A., Mok, Y. F., Bar, M., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superheating+of+ice+crystals+in+antifreeze+protein+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Superheating of ice crystals in antifreeze protein solutions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5423-5428 (2010).</li>
<li>Gilbard, J. P., Farris, R. L., Santamaria, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmolarity+of+tear+microvolumes+in+keratoconjunctivitis+sicca%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Osmolarity of tear microvolumes in keratoconjunctivitis sicca.</a> Arch. Ophthalmol. 96, 677-681 (1978).</li>
<li>Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperactive%2C+Ca2%2B-dependent+antifreeze+protein+in+an+Antarctic+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">A hyperactive, Ca2+-dependent antifreeze protein in an Antarctic bacterium.</a> FEMS Microbiol. Lett. 245, 67-72 (2005).</li>
<li>Soriano, J., Braslavsky, I., Xu, D., Krichevsky, O., Stavans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universality+of+persistence+exponents+in+two-dimensional+ostwald+ripening%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Universality of persistence exponents in two-dimensional ostwald ripening.</a> Phys. Rev. Lett. 103, (2009).</li>
<li>Tomczak, M. M., Marshall, C. B., Gilbert, J. A., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+facile+method+for+determining+ice+recrystallization+inhibition+by+antifreeze+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Bioph.+Res.+Co%22%5BJournal%5D)">A facile method for determining ice recrystallization inhibition by antifreeze proteins.</a> Biochem. Bioph. Res. Co. 311, 1041-1046 (2003).</li>
<li>Knight, C. A., Hallett, J., Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solute+Effects+on+Ice+Recrystallization+-+an+Assessment+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Solute Effects on Ice Recrystallization - an Assessment Technique.</a> Cryobiology. 25, 55-60 (1988).</li>
<li>Celik, Y., Drori, R., Pertaya-Braun, N., Altan, A., Barton, T., Bar-Dolev, M., Groisman, A., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+experiments+reveal+that+antifreeze+proteins+bound+to+ice+crystals+suffice+to+prevent+their+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1309-1314 (2013).</li>
<li>Middleton, A. J., Marshall, C. B., Faucher, F., Bar-Dolev, M., Braslavsky, I., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifreeze+protein+from+freeze-tolerant+grass+has+a+beta-roll+fold+with+an+irregularly+structured+ice-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site.</a> J. Mol. Biol. 416, 713-724 (2012).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu çalışma olağanüstü ısı kontrolü ile TH aktivitesinin doğru ölçümleri mümkün kılar bir bilgisayar kontrollü nanolitre Ozmometre çalışmasını gösterir. Herhangi bir sıcaklık duyarlı sisteminde, istenmeyen sıcaklık değişimleri kaçınılmalıdır. Burada sunulan cihaz içinde sıcaklık gradyanları önlemek için, test çözeltisi damla bakır disk soğuma evresi (adım 2.7) içinde bir deliğin merkezi olarak konumlandırılmış olmalıdır. Ayrıca, tek bir kristal damlacık merkezinde ziyade kenarlarına yakın olmalıdır (çoğu durumda, bu kendiliğinden gerçekleşir). Açıklandığı zaman bağımlılığı soğutma hızı TH okumalarını etkiler olabileceğini gösterir. Böylece, kristal soğutma önce çözelti maruz kaldığı süreyi bir rapor, hem de soğutma hızı dahil olmak üzere göstermektedir. Biz genellikle 0.01 sıcaklık aşağı Ramping önce 10 dakika bekledi ° C her 4 sn adımlar. LabVIEW kontrollü işbirliğioling aşama microfluidic cihazlar termal olarak manipüle edilebilir, üzerinde bir ters mikroskop ile kullanım için adapte edilmiştir. Bu sistem eGFP, 9, 10, 16 ile etiketlendi buz kristalleri ve IBPs içeren çözelti değiş tokuş deneylerin yapılması kolaylaştırır. LabVIEW kontrollü sistem belirli bir uyum elektrik devresi yoluyla 3.040 sıcaklık kontrol bağlayarak bir Clifton aşama için adapte edilebilir. Böyle bir sistem, Davies laboratuvar 17 işletilmektedir. LabVIEW yazılım ve Clifton aşaması için belirlenen adapte elektrik devresi tasarımı istek üzerine mevcuttur. Sonuç olarak, hassas kontrol ve manipülasyon sıcaklık ve gerçek zamanlı analiz için LabVIEW rutin yoluyla bir video arayüzü ile koordineli sıcaklık artış ve azalış oranı (0.002 ° C hassasiyet ile), kolaylaştıran bir nanolitre Osmometer açıklar. Bu sistem importan vardır tekrarlanabilir hızı kontrollü deneyler gerçekleştirebilirsinizbuz ile IBP etkileşimlerinin kinetik araştırmak için t. Bu tür deneyler IBPs etki mekanizması çevreleyen birkaç uzun zamandır tartışılan sorunları ele alabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası / model </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Daldırma yağı Tip B </td><td> Cargille Laboratuvarlar </td><td> 16484 </td><td></td></tr><tr><td> Drierite </td><td> WA Hammond Drierite </td><td> 043.063 2270g </td><td></td></tr><tr><td> Mikro 90 temizleme solüsyonu </td><td> Cole-Parmer </td><td> <a href="http://www.coleparmer.com/Product/Cole_Parmer_small_sup_reg_sup_small_Micro_90_small_sup_reg_sup_small_cleaning_solution_case_of_four_4_Liter_bottles/EW-18100-11" target="_blank">EW-18100-11</a> </td><td></td></tr><tr><td> Çektirme Kapiller </td><td> Narishige </td><td> PB-7 </td><td></td></tr><tr><td> Cam kılcal tüpler </td><td> Marka GNBH </td><td> 7493 21 </td><td> Uzun 75 mm, 1.15 çapında </td></tr><tr><td> Sıcaklıkkontrolör </td><td> Newport, Irvine, California, Amerika Birleşik Devletleri </td><td> Model 3040 </td><td> Model 3040 </td></tr><tr><td> Işık mikroskobu </td><td> Olimpos </td><td> Model BH2 </td><td></td></tr><tr><td> 10x objektif </td><td> Olimpos </td><td></td><td> S Planı 10, 0.3, 160/0.17 </td></tr><tr><td> 50x objektif </td><td> Nikon </td><td></td><td> CF planı, 50X/0.55 EPI ELWD </td></tr><tr><td> CCD Kamera </td><td> Provideo </td><td> CVC-140 </td><td></td></tr><tr><td> Tygon tüpü </td><td> Saint-Gobain, Paris, Fransa </td><td></td><td> Tygon Formülasyon S-50-HL Boru </td></tr><tr><td> Cam şırınga (2 mi) </td><td> Poulten-Graf, Wertheim, Almanya </td><td> 7 10227 </td><td></td></tr><tr><td> GPIB-PCI kart </td><td> Ulusal aletleri, Austin, Texas, ABD </td><td> 778032-01 </td><td></td></tr><tr><td> Video frame gragrafik çubuklarıyla bBER IMAQ-PCI-1407 </td><td> Ulusal aletleri, Austin, Texas, ABD </td><td> 322156B-01 </td><td></td></tr><tr><td> LabVIEW Sistem Tasarım Yazılımı </td><td> Ulusal aletleri, Austin, Texas, ABD </td><td> Sürüm 8 </td><td></td></tr><tr><td> DivX Author programı </td><td> Divx LLC, San Diego, CA, USA </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

buz bağlayıcı protein İncelemelerde labview çalıştırılan roman nanolitre ozmometre

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

Antifriz proteinleri, buz yapılandırma proteinleri, termal histerez proteinleri ve buz rekristalizasyon inhibisyon proteinleri dahil olmak üzere buz bağlayan proteinler (IBP'ler), soğuğa adapte olmuş organizmalarda bulunur ve buz kristalleriyle etkileşime girerek onları donma hasarlarından korurlar. IBP'ler; balıklar1, bitkiler2, 3, eklem bacaklılar4, 5, mantarlar6 ve bakteriler7 dahil olmak üzere çeşitli organizmalarda bulunur. IBP'ler buz kristallerinin yüzeylerine adsorbe olur ve su moleküllerinin IBP adsorpsiyon noktasında buz örgüsüne katılmasını engeller. Adsorbe edilen IBP'ler arasında kristal yüzeyinde büyüyen buz, buz kristallerinin büyüdüğü sıcaklığı düşüren yüksek bir eğrilik oluşturur; bu fenomene Gibbs-Thomson etkisi denir. Bu düşüş, erime noktası ile dengedışı donma noktası arasında, buz büyümesinin durdurulduğu bir boşluk (termal histerez, TH) oluşturur8-10, bkz. Şekil 1. IBP araştırmalarında kullanılan ana araçlardan biri, IBP çözeltilerinin TH aktivitelerinin ölçümünü kolaylaştıran nanolitre osmotredir. Clifton cihazı (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) ve Otago cihazı (Otago Osmometers, Dunedin, Yeni Zelanda) gibi nanolitre osmotreler, nanolitre hacmindeki damlacıkların erime noktası düşüşünü ölçerek bir çözeltinin osmolaritesini ölçmek için tasarlanmıştır. Bu cihazlar, gözyaşı11 gibi biyolojik örneklerin osmolaritelerini ölçmek için kullanılmış ve IBP araştırmalarında faydalı oldukları görülmüştür. Bu nanolitre osmotreler üzerindeki manuel kontrol, deneysel olanakları sınırlamıştır. Sıcaklık değişim oranları güvenilir şekilde kontrol edilememiş, Clifton cihazının sıcaklık aralığı 4.000 mOsmol (yaklaşık -7.5 °C) ile sınırlı kalmış ve zamanın bir fonksiyonu olarak sıcaklık kayıtları bu cihazlar için mevcut bir seçenek olmamıştır.
Bir LabVIEW platformu (National Instruments) kullanarak özel yapım, bilgisayar kontrollü bir nanolitre osmometre sistemi tasarladık. Daha önce açıklanan9, 10 soğutma tablası, içinden suyun dolaştığı ve böylece bir ısı emici görevi gören metal bir blok içerir, bkz. Şekil 2. Bu bloğa, LabVIEW modülleri aracılığıyla kontrol edilebilen ticari bir sıcaklık kontrol cihazı kullanılarak sürülebilen termoelektrik soğutucular eklenmiştir, bkz. Şekil 3. Daha fazla ayrıntı aşağıda verilmiştir. Bu sistemin temel avantajı, hassas sıcaklık kontrolüdür, bkz. Şekil 4. Otomatik sıcaklık kontrolü, sabit bir sıcaklık rampasının ek deneysel detaylar içeren bir video mikroskopi çıktısıyla koordinasyonuna olanak tanır.
TH aktivitesinin zamana bağımlılığını incelemek için, Antarktika bakterisi Marinomonas primoryensis'ten (MpIBP) 58 kDa'lık hiperaktif bir IBP'yi test ettik12. Bu protein, Peter Davies grubu (Queens University) tarafından geliştirilen bir konstrüksiyonda gelişmiş yeşil floresan proteinleri (eGFP) ile işaretlendi10. Sıcaklık değişim profilinin TH aktivitesini etkilediğini gösterdik. Bu deneylerde sıcaklık profili üzerindeki mükemmel kontrol, TH ölçümlerini önemli ölçüde iyileştirdi. Nanolitre osmotre, ek olarak IBPs'lerin yeniden kristalleşme inhibisyonunu test etmemize olanak sağladı5, 13. Genel olarak yeniden kristalleşme, büyük kristallerin küçük kristaller pahasına daha da büyüdüğü bir fenomendir. IBPs'ler, düşük konsantrasyonlarda bile yeniden kristalleşmeyi etkin bir şekilde inhibe eder14, 15. Buzun yeniden kristalleşmesini kantitatif olarak takip etmek ve görüntülerin eş zamanlı gerçek zamanlı video analizi ile numune odasından gelen sıcaklık geri bildirimi kullanarak sabit bir buz fraksiyonunu zorlamak için LabVIEW kontrollü osmotremizi kullandık13. Gerçek zamanlı hesaplamalar, bir deneysel prosedür sırasında ek kontrol seçenekleri sunar. Başka bir yerde açıklanacak olan, sıcaklık kontrollü mikroakışkan cihazlara uygun bir ters mikroskop tablası geliştirilmiştir16.
Soğuk Sahne Sistemi
Soğuk sahne düzeneği (Şekil 2), bir bakır plakayı soğutan bir dizi termoelektrik soğutucudan oluşur. Isı, termoelektrik soğutucuların altındaki kapalı bir bölmeden soğuk su akıtılarak sahneden uzaklaştırılır. Bakır plakanın ortasındaki 4 mm çapındaki bir delik, görüntüleme penceresi görevi görür. Termistörün yerleştirilmesi için düzlem içi 1 mm çapında bir delik açılmıştır. Birkaç deliğe (500 μm çapında) sahip özel yapım bir bakır disk (7 mm çapında) bakır plaka üzerine yerleştirilmiş ve görüntüleme penceresiyle hizalanmıştır. Hava, 35 ml/sec akış hızında pompalanmış ve Drierite (W.A. Hammond) kullanılarak kurutulmuştur. Kuru hava, soğutma aşamasında kuru bir ortam sağlamak için kullanılmıştır. Sahne, 9 pinli bir bağlantı çıkışı aracılığıyla bir sıcaklık kontrolörüne (Model 3040 veya 3150, Newport Corporation, Irvine, California, ABD) bağlanmıştır. Sıcaklık kontrolörü, bir kablo aracılığıyla bilgisayar GPIB-PCI kartına (National instruments, Austin, Texas, ABD) bağlanmıştır.

TH zaman bağımlılık ölçümü LabVIEW çalışan nanolitre Osmometer doğru TH aktivitesi ölçümleri performansı kolaylaştırır. Sabit sıcaklık azalma oranı TH zaman bağımlılık ölçümü izin. Nanolitre Osmometer tarafından etkinleştirilmiş hassas sıcaklık kontrolü bu deneyler için çok önemliydi. Çözelti içinde IBPs, bir buz kristalinin maruz kalma süresi kristali (kristal burst) etrafında buz ani büyüme kadar kristal oluşumu gelen zaman aralığı (erime işleminin sonunda) olarak tanımlanır. Biz IBPs için buz kristallerinin pozlama süresi önemlisi TH aktivitesini etkilediği belirlenmiştir. IBP pozlama (birkaç saniye) kısa dönemler Mp IBP-GFP çözeltisi (2.4 uM) (Şekil 5), düşük TH aktivitesi üretti. Bu 4 dk IBP pozlama bir platoya ulaştı kadar TH aktivitesi IBP pozlama süresi artmıştır. Yüksek IBP konsantrasyonlarda, plakaau kısa zamanlarda ulaşılmıştır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4189/4189fig1.jpg" /> Şekil 1. Şematik gösteren IBPs buz adsorbe. 10 izni ile benimsendi. <img alt="Şekil 2," fo:src="/files/ftp_upload/4189/4189fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4189/4189fig2.jpg" /> Şekil 2. Soğuma evresi. A) mikroskop tüpler bağlandı. B) Üst kurşun olmadan. C) şematik diyagramı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4189/4189fig2large.jpg" target="_blank"> </a><img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4189/4189fig3.jpg" /> Şekil 3. LabVIEW arayüzü ekran görüntüsü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4189/4189fig3large.jpg" target="_blank">Cl</a>büyük bir rakam görmek için buraya Ick. <img alt="Şekil 4," fo:src="/files/ftp_upload/4189/4189fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4189/4189fig4.jpg" /> Şekil 4. Sıcaklık stabilitesi grafiği. Sıcaklık kontrol sıcaklığı 0.01 ° C, 15 sn düşürmek için kurulmuştur. <img alt="Şekil 5," fo:src="/files/ftp_upload/4189/4189fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4189/4189fig5.jpg" /> Şekil 5. IBPs buz kristali kalma süresinin bir fonksiyonu olarak Mp IBP TH aktivitesi. Her zaman noktasında 3-6 deneylerin ortalamasıdır.

Ayrıca antifriz proteinleri olarak bilinen buz bağlayıcı protein (IBPs), buz büyümesini engelleyen ve doku dondurma kullanım için umut verici bir katkı maddesi vardır. IBPs araştırmak için kullanılan başlıca araç nanolitre Osmometer olduğunu. Biz bir optik mikroskop üzerine monte edilmiş bir ev tasarlanmış soğutma aşamasında geliştirilen ve özel olarak geliştirilmiş bir LabVIEW rutin kullanılarak kontrol. Nanolitre Osmometer ultra-hassas bir şekilde numune sıcaklık manipüle burada açıklanan.

Buz Bağlayıcı Protein İncelemelerde LabVIEW çalıştırılan Roman nanolitre Ozmometre

Antifriz proteinleri, buz yapılandırma proteinleri, termal histerez proteinleri ve buz rekristalizasyonu inhibisyon proteinleri dahil olmak üzere buz bağlayan proteinler (IBPs)...

Bu prosedürün amacı, buz bağlayıcı proteinlerin ve buz büyümesini etkileyen diğer maddelerin termal histerezini ölçmektir. Bu işlem, öncelikle dar açıklıklı bir kapiler tüp oluşturup protein içeren bir çözelti damlasının aspire edilmesiyle gerçekleştirilir. Örnek içeren kapiler tüp daha sonra sıcaklık kontrollü bir sahneye yerleştirilir.İkinci adım, damlaya buz dahil etmek için çözeltiyi düşük sıcaklıklarda soğutarak dondurmaktır. Ardından, damladaki buzun çoğunu eritmek için damla ısıtılır. Bu işlem, damlada tek bir kristal sürdürmek amacıyla yapılır.Son adım, buz hızla büyümeye başlayana kadar tekrar soğutulmasıdır. Nihayetinde, termal histerez tayini için erime sıcaklığı ile donma sıcaklığı arasındaki farkı hesaplamak, ayrıca buz kristali şekillenmesini belirlemek ve buz büyüme hızını ölçmek için video mikroskopi analizi kullanılır. Geliştirdiğimiz laboratuvar kontrollü Nanoliter SM'nin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çok uzun veya çok hızlı ölçümlerin doğru ve tekrarlanabilir şekilde yapılabilmesidir.Bu yöntem, buz bağlayıcı proteinler alanındaki termodependans gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Başlamak için, solüsyon enjeksiyonu amacıyla bir cam kılcal boru hazırlayın. Bir cam kılcal mikro tüpten ince bir açıklığa sahip keskin bir pipet hazırlamak için kılcal boru çekici kullanın.Açıklığın boyutu, kapilerden hava geçirilerek suyun içinde ince kabarcıklar oluştuğu gözlemlenerek doğrulanmalıdır. Kapiler, açıklık neredeyse kapalı olacak ancak alt milimetrelik kabarcıkların oluşumuna izin verecek kadar açık kalacak şekilde hazırlanmalıdır. Kapiler tamamen kapalıysa, su içeren tüp duvarlarına karşı hafifçe bastırılarak veya çizilerek kenarı kırılarak açılmalıdır.İki lamel arasına kurutucu desikant parçacığı yerleştirerek çift katmanlı lamet düzeneği hazırlayın. Lamelleri sıcak silikon tabancası ile birbirine yapıştırın. Çift katmanlı lamel, lamel yüzeyinde nem yoğunlaşması olmadan numunenin gözlemlenmesine olanak tanır.Soğutma aşamasını hazırlamak için, soğutma aşamasının su giriş ve çıkışlarını dört milimetre çapındaki Tygon tüplerle bağlayın. Su giriş tüpünü bir su pompasına bağlayın. Kurutulmuş kuru havayı iletmek için soğutma aşamasının girişine dört milimetre çapında bir Tygon tüp bağlayın.Sıralı bir kuru buz kolonu kullanarak hava ve su pompalarını çalıştırın. Soğutma elemanlarının bir ısı emici olmadan çalıştırılmaması gerektiğini unutmayın. Sıcaklık kontrol cihazını, kamerayı ve lab view rutinini açın.Numune hazırlığına başlamak için, diske delinmiş 500 mikronluk delikleri bulunan 7 milimetre çapındaki bir bakır diskin arka yüzüne üç ila dört mikrolitre immersiyon yağı B damlatın. Bakır diski, immersiyon yağlı tarafı aşağı bakacak şekilde soğutma tablası üzerine yerleştirin. Kapiler tüpün küt ucunu, 0,7 milimetre çapında bir tigon tüpe bağlayın.Diğer ucu iki mililitrelik cam bir şırıngaya bağlanmıştır. Cam kapil러yi hazırlanmış buz bağlayıcı protein veya IBP örnek tüpüne yavaşça yerleştirin ve cam kapiler 0,1 µL protein çözeltisi içerene kadar cam şırıngayı çekin. LabVIEW yazılımı üzerinden video kaydına başlayın.Dolu cam kapiler tüpün keskin ucunu, soğutma tablasındaki bakır disk üzerindeki deliklerden birine yerleştirin. Mikroskop altında gözlemlerken, cam kapiler ucuyla imersiyon yağı tabakasını çok hassas bir şekilde delin. 200 mikronluk bir damlacık oluşturmak için cam şırıngaya bastırarak az miktarda protein çözeltisi iletin.Soğutma tablasındaki deliği çift katmanlı lamel düzeneği ile kapatın. Soğutma düğmesine basın ve sıcaklığı eksi 40 derece Celsius'a ayarlayın. Başlangıçta, düşük sıcaklıklarda, tipik olarak eksi 30 derece Celsius ile eksi 35 derece Celsius arasındaki bir sıcaklık aralığında solüsyon damlacığı berrak olacaktır.Örnek donduktan hemen sonra, damlacığın renk değiştirmesi çözeltinin donduğunu gösterir. Ana buz kütlesi erimeye başlayana kadar sıcaklığı yavaşça artırın. Sıcaklığın kademeli olarak artırılması, örneğin tamamen erimesine yol açabilecek sıcaklık aşımını önlemek için gereklidir; 50x objektife geçin ve sıcaklığı ayarlayarak buzu eritmeye başlayın.Bu ayar etkileşimlidir ve son adımlar tipik olarak 0,002 derece Celsius'luk küçük sıcaklık adımları kullanılarak gerçekleştirilir; tek bir kristal kalana kadar eritmeye devam edilir. Kristalin nihai boyutu yaklaşık 10 mikron olmalıdır. Erimenin durduğu en yüksek sıcaklık erime noktası olarak belirlenir ve sonraki video analiz aşamasında hassas bir şekilde tespit edilir.Ardından, sıcaklığı kristalin erime noktasının birkaç yüzde bir santigrat derece altına ayarlayın ve 10 dakikalık bir gecikmeyle sıcaklık artırımını başlatın; artırım hızını isteğinize göre ayarlayın. Bu süre zarfında kristal ips'e maruz kalacaktır; 10 dakikalık maruziyet süresi tamamlandığında, sıcaklık lab view rutini kontrolü altında otomatik olarak azalacaktır. Sıcaklık azaldıkça kristal şeklini gözlemleyin.Bir noktada, ani bir buz kristal patlaması gözlemlenebilir. Bunun gerçekleştiği sıcaklık, kristal patlama sıcaklığı olarak kaydedilir. Doğru erime noktasını ve patlama sıcaklığını belirlemek için video analizi kullanın.Öncelikle, video analizini kullanarak doğru erime noktasını belirleyin. Erimenin durduğu en yüksek sıcaklığın erime noktası olarak kabul edildiğini unutmayın. Bu erime noktasını bir hesap tablosu programına kaydedin.Ardından, kesin kristal kırılma sıcaklığını belirleyin ve bunu da belgeleyin. Erime noktası ile donma noktası veya kristal kırılma sıcaklığı arasındaki fark, IBP çözeltisinin termal histerez aktivitesidir. Zamana bağlı TH aktivitesi ölçümüne başlamak için, kristal oluştuktan sonra daha önce yapıldığı gibi, tek bir kristal kalana kadar buzu eritin.Rampanın gecikme süresini istediğiniz şekilde ayarlayın ve rampayı çalıştırın. Burada, örneğin gecikme süresi bir dakika olarak ayarlanmıştır. Sıcaklık, otomatik olarak sabit bir oranda düşecektir. Rampa gecikme süresi dolduğunda, kristal patlamasının meydana geldiği sıcaklığı kaydedin.Kristal oluşumu ile kristal patlaması arasındaki süre olan maruz kalma süresini hesaplayın. Deneyi çeşitli gecikme süreleri için tekrarlayın ve TH aktivitesini maruz kalma süresinin bir fonksiyonu olarak grafiğe dökün. TH aktivitesinin zamana bağımlılığını değerlendirmek için süreyi belirleyin.Nanolitre OSM monitörünün sağladığı hassas sıcaklık kontrolü, TH aktivitesinin ve zamana bağlılığının doğru ölçümünün sağlanması açısından kritik öneme sahipti. Bir buz kristalinin çözelti içindeki IPS'e maruz kalma süresi, kristalin oluşumundan kristal çevresindeki buzun ani büyümesine kadar geçen süre olarak tanımlanır. ICE kristallerinin IPS'e maruz kalma süresi, TH aktivitesini belirgin şekilde etkilemiştir.Kısa süreli IBP maruziyeti, MP I-B-P-G-F-P çözeltisinde düşük bir TH aktivitesine yol açmıştır. TH aktivitesi, yüksek IBP konsantrasyonlarında dört dakikalık IBP maruziyetinde bir platoya ulaşana kadar IBP maruziyet süresiyle birlikte artmıştır. Plato daha kısa sürelerde gerçekleşmiştir. Benzer bir love view kontrol aşaması kullanan mikroakışkan cihazlarla birleştirilmiş floresan mikroskopi, buz bağlayıcı proteinlerin buz kristallerinin yüzeyinde birikmesi gibi ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir.Bu videoyu izledikten sonra, buz bağlayıcı proteinlerin aktivitesini değerlendiren termal STERIS ölçümünün nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalıyız.

labview-operated-novel-nanoliter-osmometer-for-ice-binding-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Laboratuarda üretilen Floresan nanopartiküller fizyolojik homeostazı sırasında sinyalizasyon ve interstisyel sıvı sırasında hücre gibi biyolojik sistemler görüntüleme iyon konsantrasyonları ve iyon akıları için kullanılır.

Biyolojik Sistemleri İyon Konsantrasyon Ölçümü için Floresan Nanopartiküller

Bu videoda, ligandlar ve hedef analitler arasındaki moleküller arası etkileşimleri gerçek zamanlı olarak tespit etmek için biyokatman interferometrisi (BLI) teknolojisini gösteriyoruz. BLI, çözelti içindeki analitlerle etkileşime girerken bir biyosensör yüzeyi üzerindeki hareketsizleştirilmiş ligandlardan oluşan bir tabakadan yansıyan beyaz ışığın girişim modelindeki değişiklikleri ölçer.

Ligand ve Analit Arasındaki Etkileşimleri Tespit Etmek için Biyokatman İnterferometri Teknolojisi

Bu video, T7 faj ile görüntülenen peptit kütüphanesinin QCM biyosensör tabanlı biyopanlamasını kullanarak protein-ilaç etkileşimlerini incelemek için bir yöntemi göstermektedir. QCM biyosensöründe spesifik bir peptit gösteren fajların biyopanlanması, yüksek afiniteli peptitlerin spesifik izolasyonuna ve ardından hedef protein üzerindeki spesifik etkileşim bölgelerinin belirlenmesine yardımcı olan amino asit dizilimine izin verir.

Protein-İlaç Etkileşimlerini İncelemek için Kuvars-Kristal Mikro Terazi Biyosensör Tabanlı Biyopanlama

Burada protokolleri Bio-tabaka interferometrisi ile protein-protein etkileşimleri kinetik analizleri tarif eder. Hücresel enerji metabolizmasında yer alır F tipi ATP sintaz, bakteriler kendi ε alt birimi ile inhibe edilebilir. Biz, ε inhibitör C-terminal alanı ile katalitik kompleksinin etkileşimleri incelemek için Bio-tabaka interferometre adapte edilmiştir.

Protein-protein etkileşimleri ve Allosterik Ligand Etkileri Kinetiği Ölçüm Bio-katman Interferometri

Bu çalışma, buz yeniden kristalleşme engelleme etkinliği ve buzlu afinite saflaştırmasını kullanarak yerel öğren daha sonra tecrit değerlendirme yoluyla dondurularak dayanıklı bitkiler buz bağlayıcı proteinin tanımlanmasını açıklar.

Bitki Buz yakınlık Arıtma kullanma Buz yeniden kristalleşme İnhibisyon ve İzolasyonu Değerlendirilmesi sayesinde Proteinler Buz bağlayıcı tanımlanması

Kriyojenik sıcaklıklarda sulu karışımların mikro-piko-litre büyüklüğündeki damlacıklarının camsı faz yoğunluklarını belirlemek için bir protokol tarif edilmiştir.

Kriyojenik Sıcaklıklarda Sulu Camların Yoğunluğunun Ölçülmesi

Bu iletişim kuralı için ticari ışık mikroskobu tarama kullanarak floresans dalgalanma spektroskopisi üzerinde temel protein homo-Oligomerizasyonda vitro miktarının kalibrasyon-Alerjik bir yaklaşım açıklar. Doğru satın alma ayarları ve analiz yöntemleri gösterilir.

Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Burada, ubikitin ligazları Von Hippel-Lindau E3 ligaz (VHL) ve Cereblon (CRBN) içeren kimeraları (PROTACS) hedefleyen proteoliz tarafından indüklenen üçlü kompleks oluşumunun biyofiziksel karakterizasyonu için protokolleri açıklıyoruz.  Burada gösterilen biyofiziksel yöntemler arasında yüzey plazmon rezonansı (SPR), biyokatman interferometrisi (BLI) ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) bulunur.

Kimeraları Hedefleyen Proteoliz Tarafından İndüklenen Üçlü Kompleks Oluşumunun Değerlendirilmesi için Biyofiziksel Testlerin Geliştirilmesi ve Uygulanması (PROTACS)

Bu makale, streptavidin bazlı bir biyokatman interferometrisi (BLI) sistemi kullanarak DNA-protein etkileşimlerini incelemek için bir protokolü açıklamaktadır. Etkileşimin denge bağlanma afinitesini(KD) belirlemek için temel veya ileri bağlanma kinetiğini kullanmak için temel adımları ve hususları ana hatlarıyla belirtir.

DNA-Protein Etkileşimlerinin Streptavidin Tabanlı Biyotabaka İnterferometrisi ile İncelenmesi

Biz, polietilen glikol (PEG) kullanılarak bir cam yüzey pasifleştirilmesi için bir yöntem tarif eder. Bu protokol yüzey temizleme, yüzey işlevselleştirilmesini ve PEG kaplama kapsar. Biz, mevcut yöntemlere kıyasla, pasivasyon üstün kalite sağlar ki, iki tur boyunca PEG molekülleri ile yüzeyin muamele edilmesi için yeni bir strateji tanıtmak.

Tek molekül Protein Araştırmaları Yüzey Pasifleme

Öğrenin buz bağlayıcı proteinlerin termal histerezisini nanolitre ozmometre ile nasıl ölçülür. LabVIEW kontrollü bu yöntem, buz kristali oluşumunu ve erime davranışlarını hassas sıcaklık kontrolüyle analiz eder.

Buz Bağlayıcı Protein İncelemelerde LabVIEW çalıştırılan Roman nanolitre Ozmometre

Daha fazla video keşfet