Bir Laboratuvar Ölçekli Sentetik Örümcek İpek Üretimi

Bu prosedürün genel amacı, laboratuvarda ipek eğirme işlemini tekrarlamak için doğal örümcek ipeği eğirme işlemini taklit ederek sentetik örümcek ipeği üretmektir. Kromatografi ile saflaştırma ve liyofilizasyon ile konsantrasyon sonrasında bakterilerde büyük miktarlarda rekombinant ipek proteini üretilir. Protein çözündürülür ve eğirme uyuşturucusu, küçük çaplı bir iğne ile bir şırıngadan dehidre edici bir alkol banyosuna itilir.

Son olarak, bükülmüş lifler olarak sentetik, protein zincirlerinin moleküler oryantasyonunu geliştirmek için bir sıkma sonrası çekime tabi tutulur. Bu tekniğin elektro eğirme veya kuru eğirme gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, daha düşük maliyetli manipülasyon kolaylığı ve prosedürü büyük ölçekli bir üretim formatına genişletme potansiyelidir. Bu tekniğin sonuçları, yeni bir biyomalzeme sınıfı geliştirmeye doğru uzanır.

Bu malzemeler, dikişler, vücut zırhları ve müzik aletleri için teller gibi çok çeşitli farklı uygulamalar için kullanılabilir. Bu yöntem, örümcek ipeklerinin malzeme özellikleri hakkında fikir verebilse de, rekombinant proteinlerden döndürülen diğer biyopolimer türlerini incelemek için de uygulanabilir. Genel olarak, bu tekniğe yeni olan kişiler, biyomühendislik, biyofizik, hücresel ve moleküler biyoloji ve biyokimya dahil olmak üzere birçok disiplinde uzmanlık gerektirdiği için mücadele edeceklerdir.

Bu yöntem için ilk olarak, örümcek ipeği üretimi için kullanılacak plazmidi üretmek için sentetik lifler üretmek amacıyla örümcek tarafından gerçekleştirilen doğal eğirme işlemini taklit etmemiz gerektiğinde aklımıza geldi. İstenen örümcek ipeği CDNA, spesifik primer setleri kullanılarak amplifiye edilir ve PBA topothio füzyonu gibi prokaryotik bir ekspresyon vektörüne bağlanır. Bu vektör, ipek proteini çözünmesini kolaylaştırmak için bir uç terminal tiyo redoksin etiketine ve protein saflaştırması için bir C terminali altı x onun etiketine sahiptir.

Bağlandıktan sonra, ligasyon ürünleri yetkin e coli hücrelerine dönüştürülür ve plazmit içeren bir koloni kültürlenir. Örümcek ipeği protein ekspresyonu daha sonra aose ilavesiyle indüklenir ve hücreler peletlenir ve eksi 80 santigrat derecede saklanır, ta ki bakteri hücrelerini 20 mililitre bir x lizis tamponunda hücre peletine geri döndürmek için kullanılana kadar, daha fazla hücre lizizini teşvik etmek için hücreleri tamamen askıya alır. Kromozomal DNA'yı sindirmek için mililitre başına bir miligram konsantrasyona lizozim ekleyin, bu da çözeltinin viskozitesini 100 mikrogram DNA'da azaltır.

Ardından numuneyi bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca hafifçe sallayın. Çözelti santrifüjünü 16.000 Gs'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca netleştirmek için çözeltiyi 19 ayarında bir dakika boyunca sonikleştirin. Süpernatantın viskoz olmayan ve berrak olduğunu görmek için sıkma kontrolünün ardından, çözelti viskoz ve bulanık ise, sonikattan daha fazla DNA ekleyin ve süpernatantta rezülasyon yapın.

Süpernatan berraklaştığında, nikel NTA afinite kolon kromatografisi için temiz bir 25 mililitrelik BioRad poli hazırlık kolonuna aktarın. Füzyon proteinini saflaştırmak için, kolona 0,5 mililitre boncuk içeren bir mililitre nikel NTA bulamacı ekleyin, kapağı sıkıca sabitleyin ve musluğu durdurun ve ardından altı X etiketinin nikel NTA boncuklarına bağlanmasını dengelemek ve izin vermek için sütunu bir saat boyunca bir külbütöre yerleştirin. Sütunu bir stand üzerinde dik olarak ayarlayın ve nikel NTA boncuklarının yaklaşık iki dakika oturmasına izin verin.

Boncuklar tamamen oturduğunda, alt kısımda açık mavi bir tabaka görülebilir. Kapağı çıkarın ve çözeltinin durdurma musluğundan akmasına izin verin. Çözeltiyi 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın.

Daha fazla analiz için 20 mililitre bir x yıkama tamponu ekleyin ve pancarların çökmesine izin verin. Vanayı açın ve akışı dört beş mililitrelik alikotta toplayın. Daha fazla analiz için, alikotları kısa veya uzun süreli depolama için sırasıyla dört santigrat derece veya eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Kirletici proteini azaltmak için ek yıkama hacimlerinin kullanılabileceğini, ancak bunun genel protein verimini azaltabileceğini unutmayın. Daha sonra, 20 mililitre bir x elüsyon tamponu ekleyin ve reçinenin çökelmesine, durdurma musluğunu açmasına ve çözeltinin akmasına izin verin. Daha fazla analiz için dört beş mililitrelik alikotta 20 mililitre içeren bu çözeltiyi toplayın.

Kısa veya uzun süreli depolama için sırasıyla dört santigrat derece veya eksi 80 santigrat derecede saklayın. Gerekirse nikel NTA reçinesinden ek elüsyon hacimlerinin toplanabileceğini unutmayın. Daha sonra, proteinleri moleküler kütlelerine göre ayırın.

SDS sayfa analizini kullanarak, proteinleri gümüş veya kumasi parlak mavi R iki 50 ile görselleştirin, aşağıdaki adımlar için sadece saf fraksiyonlar kullanılmalıdır. Tuzları uzaklaştırmak ve proteini konsantre etmek, diyaliz yapmak ve numuneyi ekteki belgedeki talimatlara göre liyofilize etmek ve dondurularak kurutulmuş numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklamak için Western blot analizi ile saflaştırılmış proteinin kimliğini onaylayın. Sonraki adımların amacı, bir güvenlik başlığı altında çalışarak eğirme işlemi için uyuşturucu ve şırıngayı hazırlamaktır.

Mililitre başına 200 miligram ila mililitre başına 500 miligram veya hacim başına haftada %20 ila %50 elde etmek için her bir kurutulmuş protein tozu tüpüne uygun miktarda HEXA floro, ISOPROPANOL veya HFIP ekleyin. HFIP para ekledikten sonra tüpü mümkün olan en kısa sürede kapatın, tüpleri filme alın ve çözündürmeyi kolaylaştırmak için protein girdabını çözündürmek için bir külbütör üzerine yerleştirin. Bu işlem iki gün kadar sürebilir.

Çözündürüldükten sonra, numuneyi iki ila üç dakika boyunca 16.000 Gs'de santrifüjleyin. Protein çözelti içinde olduğunda, eğirme uyuşturucusu olarak adlandırılır. Çözelti inanılmaz derecede viskoz olacaktır.

Şırıngayı tıkayabileceğinden agrega olmadığından emin olun. Bir sonraki adımda, en az 25 mikrolitre eğirme uyuşturucusunu, çapı 127 mikron olan bir iğne ile donatılmış bir Hamilton Gast sıkı şırıngaya dikkatlice yükleyin ve şırıngayı pistona bastırmak için iğne ile birlikte tutun. Herhangi bir hava kabarcığını gidermek için, elyafta tutarsızlıklar yaratacağı için hava kabarcıklarını çıkarmak çok önemlidir.

Ardından, şırıngayı bir Harvard cihazına, 11 artı şırınga pompasına kilitleyin. % 95 izopropanol ile doldurulmuş 400 mililitrelik bir beheri, şırınganın ucu alkolün yüzeyini kıracak şekilde hareketli bir stand üzerine yerleştirin. Şırınga pompasını dakikada 15 mikrolitreye ayarlayın ve başlat düğmesine basın.

Elyafın ekstrüzyonu. Eğirme uyuşturucusunun başlangıç hacmine bağlı olarak yaklaşık bir ila iki dakika sürmelidir. Çözeltinin tamamı elyaf haline getirildikten sonra, elyafın tamamen dengelenmesi için 20 dakika boyunca izopropanol içinde oturmasına izin verin.

Daha sonra, numune bir biriktirme cihazı kullanılarak toplanır. Burada kullanılan makara cihazı, metal tarakların dijital bir kumpasa yapıştırılmasıyla oluşturulmuştur. Bu resimde gösterildiği gibi, biriktirme cihazındaki tarağın her iki tarafına çift taraflı bant uygulayın.

Ardından biriktirme cihazını bir motora takın. Motoru, dişleri iki RPM'de makaraya alacak şekilde ayarlayın. Daha sonra, forseps kullanarak, lifin bir ucunu yavaşça tutun ve yavaşça izopropanolden dışarı çekin.

Makaradaki tarak kollarından birinin kenarına takın. Çift taraflı bant kullanılarak, liflerin kurumasını önlemek için sonraki birkaç adım durmadan yapılmalıdır. Motoru açın ve elyafı biriktirme cihazına nazikçe yönlendirmek için bir cam çubuk kullanın.

Elyafın ikiye katlanmasına ve istiflenmesine izin vermeyin. Çift taraflı bant. Tüm elyafın kaymasını önlemeli ve kaliper kolları içindeki elyafların iç segmentlerinin seçici olarak gerilmesine izin vermelidir.

Elyafın tamamı sarıldıktan sonra, makarayı motordan ayırın ve çift taraflı bant üzerindeki her bir ipek elyafın kenarına yapıştırıcı sürün. Bu, örümcek ipeğini aparata sabitler. Sıkma sonrası çizimi gerçekleştirmek için makarayı doğrusal aktüatöre takın.

C'yi kullanarak liflerin ilk uzunluğunu belirleyin.Bu, lifin iç uzunluğudur. Makaranın etrafına yapıştırılan ve sarılan uzunluğu içermez. Makarayı %75 izopropanol banyosuna indirin.

Liflerin 10 dakika dengelenmesine izin verin. Doğrusal aktüatör hızını saniyede 1,5 milimetreye ayarlayın. İlk uzunluğa bağlı olarak, istenen son kutu çekme oranı için son uzunluğu hesaplayın.

Gerilen miktar, kuruluma bağlı olarak hıza veya uzunluğa göre kontrol edilebilir. Örneğin, 15 milimetrelik bir başlangıç uzunluğu ve üç x olan istenen bir kutu çekme oranı ile, nihai uzunluk 45 milimetre olmalıdır. Bu aynı zamanda doğrusal aktüatöre saniyede 1,5 milimetre hızında 20 saniye güç verilmesi olarak da hesaplanabilir.

İkinci olarak, çöp kutusu çekme işlemi tamamlandıktan sonra, makarayı izopropanolden yavaşça kaldırın. Numuneleri toplamak için izopropanol damlacıklarının bir dakika buharlaşmasına izin verin. İlk olarak, lifin bir ucunu keserken diğer ucunu forseps ile tutun.

Bu ucu kesin ve fiberi test amacıyla kart stoğu veya folyo çerçevelere monte edin. Daha fazla kutu sonrası çekme oranı isteniyorsa, makarayı %75 izopropanol banyosuna geri indirin. Liflerin 10 dakika dengelenmesine izin verin ve ardından bir sonraki posta kutusuna geçin.

Çekme oranı. Lifleri etkileyebilecek nem ve sıcaklığı kaydedin. Mekanik özellikler.

Toplanan numunelerin standart laboratuvar ortamına dengelenmesini sağlayın. %40 nem ve 25 santigrat derece, mekanik testten en az bir saat önce idealdir. Elyaf kart stoğu çerçevesine monte edilmişken, elyafı çerçeveye sabitlemek için kart stoğunun veya folyonun kenarlarına süper yapıştırıcı sürün.

Çerçevenin açıklığının boyutuna dikkat edin. Bu, test edilen elyafın ilk uzunluğudur. Burada, 100 x veya daha fazla büyütme oranına sahip bir ışık mikroskobu kullanılarak bir inçlik bir açılış çerçevesi gösterilmektedir, uzunlamasına fiber ekseni boyunca çap ölçümleri yapın.

En az üç ölçüm kaydedilmelidir. Kullanılan büyütme ne kadar yüksek ve ne kadar çok ölçüm yapılırsa, doğruluk o kadar iyi olur. Kart stoğu çerçevesini gergin bir mekanik yükleme çerçevesine sabitleyin.

Ardından çerçeveyi her iki taraftan kesin, böylece gerginlik sadece elyaftan geçer. Kirişi yırtın ve verileri toplayın. Saniyede %2'lik standart bir gerinim oranı önerilir.

Mekanik veri toplama prosedürü, etütler için kullanılan gergi markasına bağlı olarak değişebilir. Ortalama çapta toplanan verileri kullanarak, Microsoft Excel'de bir gerilme gerinim eğrisi çizilebilir. Kopan fiber artık morfolojik analiz ve kırılma noktası çapı ölçümleri için bir taramalı elektron mikroskobu olan Stu'ya monte edilebilir.

Kırılma noktasından uzaktaki fiber segmenti, ışık mikroskobu tarafından ölçülen ilk çapı tahmin etmek ve kontrol etmek için kullanılabilir. Örümcek ipek proteini MASP bir, lifi eğirmeden önce proteinin saflığını belirlemek için bakterilerden eksprese edildi ve saflaştırıldı, proteinler boyut fraksiyonlamasına tabi tutuldu. SDS sayfa analizini ve ardından burada gösterildiği gibi gümüş boyama ile görselleştirmeyi kullanarak, altı çözüm, ilk dört fraksiyon içindeki numune salımlarının çoğunu ortaya çıkarır.

Örümcek ipeği proteini TUSP one da burada sunulan protokole göre üretildi ve sentetik boru şeklindeki formmun mekanik özelliklerini belirlemek için elyaf haline getirildi İpekler elyaflar eğrilmiş ve artan postin çekme oranları gerçekleştirilmiştir. Bu görüntüdeki renkler, 2,5 x ile altı x arasında değişen farklı postin çekme oranlarına tabi olan lifleri göstermektedir. Lifler kendi oran grupları içinde düşük varyasyon gösterirler.

Postacı çekme oranları arttıkça elyafın mukavemeti artarken uzayabilirlik azalır. Bununla birlikte, liflerin ultra yapısını değerlendirmek için eşdeğer tokluk seviyeleri gösterdi, elektron mikroskobu tarayarak, burada görülebileceği gibi rekombinant tsp bir proteinden eğrilmiş liflerin görüntüleri elde edildi. Pürüzsüz dış yüzey, 5.000 güvertede 500 x büyütmede görülebilir.

Yoğun iç çekirdek, doğal bir lif kırılmasından gözlemlenebilir. Bu, rekombinant proteinlerin ekstrüzyon işlemi sırasında iyi bir şekilde bir araya geldiğini ve paketlendiğini göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 10 gün içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, dondurarak kurutma adımından önce saflaştırılmış rekombinant proteinden tüm tuzu çıkarmak ve ayrıca ekstrüzyon işlemi sırasında iğnenin tıkanmasını önlemek için doğru eğirme uyuşturucu konsantrasyonunun kullanıldığından emin olmak önemlidir. Mes, P bir TUSB bir ve P ysb bir gibi diğer fibroinler, geliştirildikten sonra çok çeşitli biyomalzemeler üretmek için tek tek liflere veya kompozitler halinde bükülebilir. Bu teknik, biyomühendislik ve malzeme bilimi alanındaki araştırmacıların, askeri tıp alanı, sanat, atletizm ve otomotiv endüstrisinde etkileri olan uygulamalar için sentetik örümcek ipeklerinin kullanımını keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, bakterilerden saflaştırılmış proteinler kullanılarak sentetik ipek liflerinin veya kompozit malzemelerin nasıl eğirileceğini daha iyi anlamış olmalısınız. Atriyal fibrilasyon ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman çeker ocak altında çalışmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.