Bir Laboratuvar Ölçekli Sentetik Örümcek İpek Üretimi

Bu prosedürün genel amacı, laboratuvarda ipek eğirme işlemini kopyalamak için doğal örümcek ipeği eğirme sürecini taklit ederek sentetik örümcek ipeği üretmektir. Kromatografi ile saflaştırma ve liyofilizasyon ile konsantrasyonun ardından, bakterilerde büyük miktarlarda rekombinant ipek proteini üretilir. Protein çözünür hale getirilir ve eğirme sıvısı, küçük çaplı bir iğneye sahip bir şırınga aracılığıyla dehidre alkol banyosuna itilir.

Son olarak, sentezlenen ve eğrilmiş haldeki lifler, protein zincirlerinin moleküler yönelimini artırmak için eğirme sonrası çekme işlemine tabi tutulur. Bu tekniğin elektro eğirme veya kuru eğirme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, düşük maliyeti, uygulama kolaylığı ve prosedürün büyük ölçekli bir üretim formatına genişletilme potansiyelidir. Bu tekniğin etkileri, yeni bir biyomalzeme sınıfının geliştirilmesine yönelik uzanmaktadır.

Bu materyaller; süturlar, vücut zırhları ve müzik enstrümanı telleri gibi geniş bir uygulama yelpazesinde kullanılabilir. Bu yöntem, örümcek ipeğinin materyal özellikleri hakkında bilgi sağlayabildiği gibi, rekombinant proteinlerden eğrilmiş diğer biyopolimer türlerinin incelenmesinde de uygulanabilir. Genel olarak, bu tekniğe yeni başlayan kişiler; biyomühendislik, biyofizik, hücresel ve moleküler biyoloji ile biyokimya dahil olmak üzere birçok disiplinde uzmanlık gerektirdiği için zorluk yaşayabilirler.

Sentetik fiberler üretme girişimi kapsamında, örümceğin gerçekleştirdiği doğal eğirme sürecini taklit etme ihtiyacı duyduğumuzda bu yöntem fikri ilk kez ortaya çıktı. Örümcek ipeği üretimi için kullanılacak plazmidi oluşturmak amacıyla, istenen örümcek ipeği CDNA'sı spesifik primer setleri kullanılarak amplifiye edilir ve pBAD topo thio fusion gibi bir prokaryotik ekspresyon vektörüne ligge edilir. Bu vektör, ipek proteininin çözünürlüğünü kolaylaştirmek için bir N-terminal thio redoxin etiketi ve protein saflaştırması için bir C-terminal altı x his etiketi içerir.

Ligasyon işlemi tamamlandıktan sonra, ligasyon ürünleri kompetan e coli hücrelerine transforme edilir ve plazmit içeren bir koloni kültüre edilir. Ardından, aose eklenmesiyle örümcek ipeği proteini ekspresyonu indüklenir; hücreler pelletlenir ve bakteriyel hücreleri liz etmek için kullanılana kadar -80 °C'de saklanır. Hücre pelletine 20 mL 1x lizis tamponu ekleyerek hücreleri tamamen yeniden süspande edin; ardından hücre lizisini daha da artırmak için lizozim ekleyin. Kromozomal DNA'yı sindirmek ve böylece çözeltinin viskozitesini azaltmak için lizozimi 1 mg/mL konsantrasyona getirin, 100 µg DNA.

Ardından numuneyi bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca hafifçe sallayın. Çözeltiyi berraklaştırmak için 19 ayarında bir dakika boyunca sonikasyona tabi tutun, ardından dört °C'de 10 dakika boyunca 16,000 Gs hızında santrifüjleyin. Santrifüjleme sonrası süpernatantın vizkozite taşımadığını ve berrak olduğunu kontrol edin; eğer çözelti vizkoz ve bulanıksa, daha fazla DNA ekleyin, tekrar sonikasyon uygulayın ve süpernatantı yeniden toplayın.

Süpernatan berraklaştığında, nikel NTA afinite kolon kromatografisi için temiz bir 25 milliliter BioRad poly prep kolonuna aktarın. Füzyon proteinini saflaştırmak için, kolona 0,5 milliliter boncuk içeren bir milliliter nikel NTA süspansiyonu ekleyin, kapağı ve musluğu sıkıca kapatın ve ardından altı X his etiketinin nikel NTA boncuklarına bağlanmasını sağlamak ve dengelemek için kolonu bir saat boyunca bir sallayıcıya (rocker) yerleştirin. Kolonu bir stand üzerinde dik konuma getirin ve nikel NTA boncuklarının yaklaşık iki dakika boyunca çökmesine izin verin.

Boncuklar tamamen çöktüğünde, dipte açık mavi bir tabaka görülebilir. Kapağı çıkarın ve çözeltinin musluktan akmasına izin verin. Çözeltiyi 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın.

Daha ileri analizler için, 20 mililitre bir x yıkama tamponu ekleyin ve pancarların çökmesini bekleyin. Musluğu açın ve süzüntüyü beş mililitrelik dört alikota ayırarak toplayın. Daha ileri analizler için, alikotları sırasıyla kısa veya uzun süreli saklama amacıyla dört derece santigrat veya eksi 80 derece santigratta saklayın.

Kirletici proteinleri azaltmak için ek yıkama hacimleri kullanılabileceği, ancak bunun toplam protein verimini düşürebileceği unutulmamalıdır. Ardından, 20 mililitre bir x elüsyon tamponu ekleyin ve reçinenin çökmesini bekleyin, ardından stop musluğunu açarak çözeltinin akmasına izin verin. 20 mililitre içeren bu çözeltiyi, ileri analizler için dört adet beş mililitrelik alikot şeklinde toplayın.

Kısa veya uzun süreli saklama için sırasıyla dört derece Celsius veya eksi 80 derece Celsius'ta saklayın. Gerekirse nikel NTA reçinesinden ek elüsyon hacimlerinin toplanabileceğini unutmayın. Ardından, proteinleri moleküler kütlelerine göre ayırın.

SDS-PAGE analizi kullanarak, proteinleri gümüş veya Coomassie Brilliant Blue R-250 ile görselleştirin; sonraki adımlar için yalnızca saf fraksiyonlar kullanılmalıdır. Purifiye edilen proteinin kimliğini Western blot analizi ile doğrulayın; tuzları uzaklaştırmak ve proteini konsantre etmek için, ekteki belgedeki talimatlara göre diyaliz yapın ve örneği liyofilize edin, ardından dondurularak kurutulmuş örnekleri -80 °C'de saklayın. Sonraki adımların amacı, bir güvenlik davlumbazı altında çalışarak eğirme işlemi için dopu ve şırıngayı hazırlamaktır.

Kurutulmuş protein tozunun bulunduğu her tüpe, mililitre başına 200 miligram ile 500 miligram veya hacimce %20 ile %50 arasında bir konsantrasyon elde etmek için uygun miktarda HEKZA florür, İZOPROPANOL veya HFIP dikkatlice ekleyin. HFIP ekledikten hemen sonra tüpü kapatın, tüpleri parafilm ile sarın ve proteini çözmek için bir sarsıcıya yerleştirin; çözünmeyi kolaylaştırmak için vorteksleyin. Bu işlem iki güne kadar sürebilir.

Çözüldükten sonra örneği 16,000 Gs'de iki ila üç dakika santrifüjleyin. Protein çözeltide olduğunda, buna eğirme sıvısı (spinning dope) denir. Çözelti oldukça viskoz olacaktır.

Şırıngayı tıkayabileceği için agregat bulunmadığından emin olun. Bir sonraki adımda, şırıngayı pistonu bastırmak için iğne yukarı bakacak şekilde tutarak, 127 mikron iç çaplı bir iğne ile donatılmış bir Hamilton Gast sıkı şırıngaya en az 25 microliters eğirme çözeltisi dikkatlice yükleyin. Hava kabarcıklarını gidermek için, fiberde tutarsızlıklara yol açacakları için hava kabarcıklarının çıkarılması çok önemlidir.

Ardından, şırıngayı bir Harvard apparatus, 11 plus şırınga pompasına sabitleyin. 95% isopropanol ile doldurulmuş 400 mililitrelik bir beheri, şırınganın ucunun alkol yüzeyini sadece hafifçe geçeceği şekilde hareketli bir standa yerleştirin. Şırınga pompasını 15 µL/dakika hızına ayarlayın ve başlat düğmesine basın.

Lifin ekstrüzyonu. Eğirme dopinin başlangıç hacmine bağlı olarak yaklaşık bir ila iki dakika sürmelidir. Çözeltinin tamamı lif haline getirildikten sonra, lifin tamamen dengelenmesi için isopropanol içinde 20 dakika bekletilmesine izin verin.

Ardından, örnek bir sarma düzeneği kullanılarak toplanır. Burada kullanılan sarma düzeneği, metal tarakların bir dijital kumpasa yapıştırılmasıyla oluşturulmuştur. Bu görselde gösterildiği gibi, sarma düzeneğindeki tarağın her iki tarafına çift taraflı bant uygulayın.

Ardından, sarma cihazını bir motora bağlayın. Motoru, iplikleri dakikada iki devir (RPM) hızla saracak şekilde ayarlayın. Sonrasında, bir penset kullanarak fiberin bir ucunu nazikçe tutun ve izopropanolden yavaşça çekerek çıkarın.

Onu, makaranın tarak kollarından birinin kenarına sabitleyin. Çift taraflı bant kullanarak, liflerin kurumasını önlemek için sonraki birkaç adım duraksamadan gerçekleştirilmelidir. Motoru çalıştırın ve lifi sarma düzeneğine nazikçe yönlendirmek için bir cam çubuk kullanın.

Fiberin üst üste binmesine ve katlanmasına izin vermeyin. Çift taraflı bant, fiberin tamamının kaymasını önlemeli ve kumpas kolları içindeki fiberlerin iç segmentlerinin seçici olarak gerilmesine olanak sağlamalıdır.

Tüm fiber sarıldığında, makarayı motordan ayırın ve her bir ipek fiberin kenarına, çift taraflı bandın üzerine yapıştırıcı uygulayın. Bu işlem, örümcek ipeğini aparata sabitler. Eğirme sonrası çekme işlemini gerçekleştirmek için makarayı lineer aktüatöre takın.

Liflerin başlangıç uzunluğunu C kullanarak belirleyin. Bu, lifin iç uzunluğudur. Yapıştırılan ve makaraya sarılan uzunluğu içermez. Makarayı %75 izopropanol banyosuna daldırın.

Liflerin 10 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Doğrusal aktüatör hızını saniyede 1,5 milimetre olarak ayarlayın. Başlangıç uzunluğunu temel alarak, istenen çekim sonrası kutu çekme oranı için final uzunluğunu hesaplayın.

Germe miktarı, kuruluma bağlı olarak hıza veya uzunluğa göre kontrol edilebilir. Örneğin, 15 milimetre başlangıç uzunluğu ve üç katlık istenen bir çekme oranı ile final uzunluğu 45 milimetre olmalıdır. Bu durum, lineer aktüatörün 1,5 milimetre/saniye hızda 20 saniye boyunca çalıştırılması şeklinde de hesaplanabilir.

İkinci olarak, post bin çekme işlemi tamamlandığında, makarayı izopropanolden yavaşça yukarı kaldırın. Örnekleri toplamak için izopropanol damlacıklarının bir dakika boyunca buharlaşmasını bekleyin. İlk olarak, fiberin bir ucunu pensle tutarken diğer ucunu kesin.

O ucu kesin ve test amaçlı olarak fiberi karton veya folyo çerçevelere monte edin. Daha fazla post bin çekme oranları isteniyorsa, makarayı tekrar %75 isopropanol banyosuna daldırın. Fiberlerin 10 dakika boyunca dengelenmesine izin verin ve ardından bir sonraki post bine geçin.

Çekme oranı. Lifleri etkileyebilecek olan nem ve sıcaklığı kaydedin. Mekanik özellikler.

Toplanan örneklerin standart laboratuvar ortamına uyum sağlamasına izin verin. Mekanik testlerden önce en az bir saat boyunca %40 nem ve 25 °C ideal koşullardır. Lifi karton çerçeveye monte ettikten sonra, lifi çerçeveye sabitlemek için kartonun veya folyonun kenarlarına hızlı yapıştırıcı uygulayın.

Çerçevenin açıklık boyutuna dikkat edin. Bu, test edilen fiberin başlangıç uzunluğudur. Burada, 100 x veya daha yüksek büyütmeli bir ışık mikroskobu kullanılarak, longitudinal fiber ekseni boyunca çap ölçümlerinin alındığı bir inçlik açıklığa sahip bir çerçeve gösterilmektedir.

En az üç ölçüm kaydedilmelidir. Kullanılan büyütme oranı ne kadar yüksek olursa ve ne kadar çok ölçüm alınırsa, doğruluk o kadar artar. Karton çerçeveyi bir tenter mekanik yükleme çerçevesine sabitleyin.

Ardından, gerilimin yalnızca fiber üzerinden geçmesi için çerçeveyi her iki yanından kesin. Gerdirme işlemini gerçekleştirin ve verileri toplayın. Saniyede 2% oranında standart bir gerilme hızı önerilir.

Mekanik veri toplama prosedürü, çalışmalarda kullanılan tenter markasına bağlı olarak değişiklik gösterebilir. Ortalama çapta toplanan veriler kullanılarak, Microsoft Excel'de bir gerilme-birim şekil değiştirme eğrisi çizilebilir. Kopan lif, morfolojik analiz ve kopma noktası çap ölçümleri için bir taramalı elektron mikroskobuna, Stu, yerleştirilebilir.

Kırılma noktasından uzak olan fiber segmenti, ışık mikroskobu ile ölçülen başlangıç çapını tahmin etmek ve kontrol etmek için kullanılabilir. Fiber eğirme işlemi öncesinde proteinin saflığını belirlemek amacıyla, bakterilerden ifade edilen ve saflaştırılan örümcek ipeği proteini MASP 1'e boyut fraksiyonalizasyonu uygulanmıştır. Burada gösterildiği gibi, SDS-PAGE analizi ve ardından gümüş boyama ile görselleştirme sonucunda, altı çözeltide örneğin büyük bir kısmının ilk dört fraksiyonda salındığı görülmektedir.

Örümcek ipeği proteini TUSP one, burada sunulan protokole göre üretilmiş ve sentetik tübüler formun mekanik özelliklerini belirlemek amacıyla lifler halinde eğrilmiştir. İpek lifleri eğrilmiş ve artan post-drawing oranları uygulanmıştır. Bu görüntüdeki renkler, 2,5x ile 6x arasında değişen farklı post-drawing oranlarına tabi tutulmuş lifleri göstermektedir. Lifler, kendi oran grupları içerisinde düşük varyasyon göstermektedir.

Çekme oranları arttıkça lifin mukavemeti artarken uzayabilirlik azalır. Bununla birlikte, lifler eşdeğer tokluk seviyeleri sergilemiştir; liflerin ultra yapısını değerlendirmek amacıyla, rekombinant tsp one proteinlerinden eğrilen liflerin taramalı elektron mikroskobu görüntüleri elde edilmiştir ve burada görülebilir. Pürüzsüz dış yüzey, 500 x büyütmede ve 5.000 kat büyütmede görülebilmektedir.

Yoğun iç çekirdek, fiberin doğal bir kırılma noktasından gözlemlenebilir. Bu durum, rekombinant proteinlerin ekstrüzyon işlemi sırasında iyi bir şekilde birleştiğini ve paketlendiğini göstermektedir. Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde yürütülürse 10 günde tamamlanabilir.

Bu prosedür uygulanırken, dondurarak kurutma adımından önce saflaştırılmış rekombinant proteindeki tüm tuzların uzaklaştırılması ve ekstrüzyon işlemi sırasında iğnenin tıkanmasını önlemek için doğru eğirme dop konsantrasyonunun kullanıldığından emin olunması önemlidir. Bu prosedürün ardından; mes, P one TUSB one ve P ysb one gibi diğer fibroinler, geniş bir biyomalzeme yelpazesi üretmek amacıyla tekil lifler veya kompozitler halinde eğrilebilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, biyomühendislik ve malzeme bilimi alanındaki araştırmacıların, askeri tıp alanı, sanat, atletizm ve otomotiv endüstrisinde etkileri olan uygulamalar için sentetik örümcek ipeği kullanımını keşfetmelerine olanak sağlamıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, bakterilerden saflaştırılan proteinleri kullanarak sentetik ipek liflerini veya kompozit malzemeleri nasıl eğirebileceğiniz konusunda daha iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. AFib ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken çeker ocak altında çalışmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.