Lipoaspirate itibaren hasat Yağ kaynaklı stromal hücreler kullanarak Kritik ölçekli Kalvaryum Defekt Model tamiri

Bu prosedürün genel amacı, bir farede in vivo kalvarial defekt modeli kullanarak osteojenik farklılaşma sağlamak amacıyla adipoz dokudan multipotent stromal hücreler toplamaktır. Bu işlem, öncelikle liposuction prosedürünü takiben elde edilebilen adipoz dokunun stromal vasküler tabakasından progenitör hücrelerin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, üç boyutlu bir iskelet hazırlamak ve ardından hücreleri bu iskale ekmektir.

Son adım, iskelenin ve hücrelerin yerleştirildiği bir sıçan modelinde kritik boyutlu bir kalvaryum defektinin oluşturulmasıdır. Nihayetinde sonuçlar, adipöz dokudan izole edilen multipotent stromal hücrelerin in vivo iskelet rejenerasyonu potansiyeline sahip olduğunu göstermektedir. İskelet rejenerasyonu için mevcut doku yetersizliği nedeniyle, bu tekniğin uygulama alanı geniş bir klinik uygulama spektrumuna sahiptir.

Otolog kemik greftleri altın standart olsa da, donör bölge eksikliği ve donör bölge morbiditesi bu seçeneği sınırlamaktadır. Alogreftler ve yabancı materyaller kullanılabilir ancak bunlar maliyet, zayıf entegrasyon ve potansiyel enfeksiyon nedeniyle kısıtlıdır.

İskelet doku mühendisliği için progenitör hücrelerin izolasyonunda adipoz veya yağ dokusunun olası kullanımı heyecan vericidir. Prosedürü, long anchor laboratuvarından Michael Chung ve ben göstereceğiz. Öncelikle, elektif lipoaspirasyon işlemlerinden insan subkütan adipoz dokusu temin edin.

Lipospiratla oluşan iki tabakaya dikkat edin. Süpernatan, işlemden kaynaklanan hücresel materyalin büyük çoğunluğunu içerir. Alt tabaka ise çoğunlukla enjekte edilen salindir.

Adipoz kaynaklı stromal hücreler her iki tabakadan da toplanabilir, ancak üst fazdan elde edilen verim çok daha yüksektir. Stromal vasküler fraksiyonu veya SVF'yi izole etmek için, lipoaspiratı eşit hacimlerde %2,5 Betadine içeren 1x fosfat tamponlu salin veya PBS ile kapsamlı bir şekilde yıkayın, ardından Betadine içermeyen 1x PBS ile eşit hacimde aspire edin. Yıkama işleminin çökelmesini bekleyin.

İşlenmiş insan dokusu ile kontaminasyonu önlemek için tüm süreç boyunca steril tekniğin uygulandığından emin olun. Ardından, her yıkamadan sonra alt tabakayı aspire ederek atın, daha sonra 15 mililitre yağ dokusunu 50 mililitrelik Falcon konik tüplere aktarın. Son olarak, yağ dokusunu 15 mililitre filtrelenmiş %0,075 filtrelenmiş çözelti ile sindirin.

Tip iki kollagenazı, Hank dengeli tuz çözeltisi veya HBSS içinde, 37 °C sıcaklıktaki bir su banyosunda sabit ajitasyon altında 60 dakika boyunca inkübe edin; tüpleri her 15 dakikada bir havalandırmayı unutmayın. Ardından, enzim aktivitesini %10 fetal bovine serum veya FBS içeren 15 mL PBS ile nötralize edin ve santrifüjleyin. Yüksek yoğunluklu bir SVF peleti elde edin; pelet, adipoz kaynaklı kök hücreler ve eritrositlerin bir karışımı olacaktır.

Önce üstteki yağ tabakasını, ardından pellet'e zarar vermeden üstteki sıvı tabakasını uzaklaştırın. Pellet'i 10 milliliters geleneksel büyüme ortamında yeniden süspande edin. Daha sonra üç tübü 100 mikronluk bir filtreden geçirerek tek bir temiz 50 milliliters konik tüpte birleştirin ve santrifüjleyin.

Pellete zarar vermeden süpernatanla uzaklaştırın ve ardından pellet'i yeniden süspande edin. Bir adet 10 cm'lik plaka için iki adet 50 mL'lik konik tüp veya bir adet 15 cm'lik plaka için beş adet 5 mL'lik konik tüp şeklinde, beş mL geleneksel büyüme besiyerinde birleştirin. Birincil kültürleri 37 °C'de, %21 oksijen ve %5 karbondioksit ile gece boyunca inkübe edin.

Gece boyunca inkübe ettikten sonra, yapışmamış kalan eritrositleri uzaklaştırmak için plakaları PBS ile yıkayın. Elde edilen hücre popülasyonları adipoz kaynaklı stromal hücrelerdir. Kendiliğinden diferansiyasyonu önlemek için hücreleri sub-konfluen seviyelerde tutun.

37 °C, %21 oksijen ve %5 karbondioksit koşullarında. Büyüme ortamında, hücrelerin genellikle her üç ila dört günde bir standart büyüme ortamında pasajlanması gerekir. %50 konfluens düzeyinde plakalandığında, iskeleyi eşlik eden makalede açıklandığı şekilde hazırlayın.

Hücreler alt konfluens seviyelerine ulaştığında, hücreleri iki kez PBS ile yıkayın ve tripsinizasyon işlemini gerçekleştirin. Hücreleri sayarak miktarlarını belirleyin. Ekim için, 4 mm çapındaki önceden kesilmiş iskelelere 1,5 × 10⁵ hücre ekmeye hazırlanın.

Bir adet iskeleyi 96 kuyucuklu plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin, ardından hücreleri 20 µL besiyerine yaklaşık 1,5 × 10⁵ hücre konsantrasyonunda olacak şekilde standart büyüme besiyerinde yeniden süspande edin. 20 µL çözeltiyi doğrudan iskelenin içine pipetleyerek ekim yapın ve bunu 30 dakika boyunca hücre kültürü inkübatöründe bekletin.

30 dakika sonra, 200 µL besiyeri ekleyin ve hücrelerin iskale üzerinde gece boyunca inkübe edilmesine izin verin. Cerrahi işlem öncesinde, ekim aşamasında olduğu gibi hücrelerin iskeleye yapışmasını doğrulamaya gerek yoktur. Yeterli miktardaki hücre sayısı, hücrelerin çoğunluğunun iskeleye tutunmasını sağlayacaktır.

60 günlük yetişkin bir CD1 nude fare anestezi altına alındıktan sonra, cerrahi bölge Betadine ve alkol ile üç kez sterilize edilir ve farelerin gözleri üzerine lubrikant uygulanır. Ardından, sağ paryetal kemiği açığa çıkarmak için farenin kafa derisinde orta hat sagittal insizyon yapılır. Sağ paryetal kemik üzerindeki periost, künt kazıma yöntemiyle uzaklaştırılır.

Ardından, sağ tarafta sutürlerle ilişkili olmayan paryetal kemikte, tek taraflı dört milimetrelik tam kat bir defekt oluşturun. Elmas kaplı dişli matkap ucu kullanırken, implantasyon öncesinde fare kalvaryum kalınlığı 0,3 mm'den az olduğu için alttaki dura mater'e zarar vermemeye aşırı özen gösterin. Besiyeri kaynaklı büyüme faktörlerinin transferini önlemek için iskeleleri steril PBS ile durulayın.

İskele yapıyı defekt bölgesine yerleştirin. Son olarak, cildi sütürle kapatın ve hayvanı belirlenmiş postoperatif protokollere göre takip edin. Fareye mikro CT uygulayın ve microview yazılımını kullanarak 3D rekonstrüksiyon görüntüsü elde edin.

Görüntüleri standart bir yüksekliğe getirmek için Adobe Photoshop kullanın. Genellikle, kalvaryal rejenerasyon ölçümleri her iki haftada bir yapılır. Uzun süreli takip için tarama sırasında fareler anestezi altına alınır ve nihayetinde ötanize edilirler.

Histolojik analiz için, kalvaryal defektin piksellerini ölçmek amacıyla sihirli değnek özelliğini kullanın. Defektin iyileşme yüzdesini sonraki BT taramalarıyla belirleyin. Kalvaryal defekt alanını ölçüp piksel sayısını belirledikten sonra, bu değeri orijinal defektin piksel sayısına bölün; osteo formasyonu belirtmek için anilin mavisi ve pen aro gibi histolojik boyalar kullanarak defekt boyunca birden fazla kesiti boyayın.

Kalıvarial defekt dışında kalan tüm alanları kırpmak için Adobe Photoshop kullanın ve defekt alanındaki de novo kemik oluşumunun piksel sayılarını belirlemek için sihirli değnek aracını kullanın; ardından bunu kontrollerle veya diğer değişkenlerle karşılaştırın. Burada, yağdan türetilmiş stromal hücrelerin izolasyonundan, bunların genişletilmesi, diferansiyasyonu ve in vitro ile in vivo kullanımlarına kadar lipoaspiratın toplanması ve uygulanmasına genel bir bakış sunulmuştur. Alt satırda, hidroksiapatit iskele aracılığıyla ASC'lerin uygulanmasıyla kritik boyutlu kalvarial defektin in vivo iyileşmesini gösteren bir mikro CT görüntüsü yer almaktadır.

Üst sırada görülen kontroller, iskele uygulanmayan ve defektli grupları içermektedir. Orta sıra, hücre içermeyen iskelenin yerleştirildiği defektli grubu göstermektedir. Burada gösterilen LS, mikro BT'den elde edilen kemik iyileşmesinin nicelleştirmesidir ve ASC grubunda anlamlı derecede artmış bir iyileşme olduğunu göstermektedir.

Bu, andal aracılığıyla A SC grubunun artan kemik oluşumunu gösteren histolojik bir görüntüdür. Mavi renkte, al için AROM boyaması yapılmıştır. Mavi renkte, pen arom için osteoid koyu maviye boyanmıştır.

Burada sarı renkli boyanan osteoidler, bir iskele üzerine ekilen ve iki hafta sonra sakrifiye edilen GFP ile işaretlenmiş insan ASC'leridir. Defekt bölgesindeki rejenerasyona katkıda bulunan insan hücrelerini göstermek için GFP işaretli bir antikor ile boyama yapılmıştır. Burada, iki haftada defekt bölgesindeki insan hücrelerinin yaygınlığını gösteren insan nükleer antijen immünokimyası sunulmaktadır.

Uzmanlaşıldığında, adipoz doku işlemleri dört saat içinde tamamlanabilir ve cerrahi prosedür fare başına yaklaşık 10 dakika sürebilir. Parietal kemiğin yuvarlak, matkabın ise düz olduğu unutulmamalıdır; bu nedenle dört milimetrelik defektin tüm çevresinin açılmasına dikkat edilmelidir. Beyindeki dura mater'e zarar vermemek için yavaş ilerlemeyi unutmayın.

Bu videoyu izledikten sonra, progenitor hücrelerin adipoz dokudan nasıl izole edileceğine dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu hücreleri bir iskale ekmeli ve fareye yerleştirmelisiniz.