Name: Lipoaspirate itibaren hasat Yağ kaynaklı stromal hücreler kullanarak Kritik ölçekli Kalvaryum Defekt Model tamiri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T10:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Öğrenin yağ dokusundan çok potansiyelli stromal hücre izolasyonu ve kritik boyutlu kafatası defekt modelinde osteojenik farklılaşma değerlendirmesi. Bu yöntem iskelet rejenerasyonu için umut vadeden bir doku mühendisliği yaklaşımı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz araştırma verdikleri destek ve işbirliği için Dr George Avam ve Dr Dean Vistnes teşekkür etmek istiyorum. Saint Joseph Mercy Hastane GME tarafından desteklenen bu çalışma Diş ve Kraniofasial Araştırma hibeleri 1 R21 DE019274-01, R01EB009689 ve RC2 DE020771-02, MTL Dr Hyun Pediatrik Rejeneratif Tıp Oak Vakfı ve Hagey Laboratuvarı Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmektedir .

1. Hücre İzolasyonu &amp; Genişletme <ol><li> Tüm hastanın rızası ve deneysel protokolleri Stanford Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (Protokol # 2188 ve # 9999) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. </li><li> Genel / lokal anestezi altında elektif lipoaspiration prosedürlerden İnsan subkutanöz adipoz dokusu elde edilir. </li><li> Lipoaspirate iki kat (Şekil 1A) olacaktır. Süpernatant işlenmiş hücresel malzemenin büyük bir çoğunluğu içerir. Alt tabaka daha çok tabaka ya da stromal hücreler hasat edilebilir Yağ-türetilmiştir. Salin enjekte, ancak verimi üstte yüzen madde gelen çok daha büyük olmasıdır. </li><li> Stromal vasküler fraksiyonu (SVF) izole etmek için, 1X eşit hacimlerde salin (PBS) betadin olmadan 1X PBS (x1) eşit hacmi ardından% 2.5 betadin (x2) içeren fosfat tamponlu ile yoğun lipoaspirate yıkayın. Çökelti için yıkama izin verin. </li><li> Steril te korumak için dikkatli olunişlenmiş insan dokusu ile karışması süreci boyunca chnique olabilir. </li><li> Alt tabaka aspire ve her yıkamadan sonra atın. </li><li> Tablet 50 ml BD Falcon konik tüpler içine adipoz doku 15 ml. </li><li> 37 Hank Dengeli Tuz Çözeltisi içinde süzülmüş% 0.075 Tip II kollajenaz eşit bir hacmi (15 ml) bir (HBSS) ° C su banyosu içinde 60 dakika boyunca sürekli karıştırma altında (yaklaşık 180 / dak titreşim) ile adipoz doku sindirmek - Her bir tüp her 15 dk havalandırın. </li><li> 15 ml PBS ° C olan yüksek yoğunluklu bir SVF pelet elde etmek için 4, 5 dakika için 1000 rpm&#39;de% 10 (Fetal Bovine Serum) FCS, ve santrifüj ile birlikte ihtiva eden enzim aktivitesini nötralize eder. Pelet adipoz-kaynaklı stromal hücreler ve eritrositler bir karışımı olacaktır. </li><li> Pelet aksatmadan Süpernatantı atın. </li><li> Geleneksel büyüme ortamı, 10 ml (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı [DMEM] /% 10 FBS /% 1 penisilin-streptomisin solüsyonu) pellet yeniden süspanse edin. </li><li> Filtre Asma<html> hücresel enkaz kaldırmak için 100 mikron naylon hücre süzgecinden sion. </li><li> Temiz bir 50 ml konik tüpler içine 3 birleştirin. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 1000 rpm&#39;de santrifüje </li><li> Pelet aksatmadan Süpernatantı atın. </li><li> Geleneksel büyüme ortam 5 ml pelet yeniden süspanse edin </li><li> Biri 10 cm tabak veya bir adet 15 cm tabak için beş 50 ml conicals başına iki 50 ml conicals birleştirin. </li><li> 37 ° C/21% O 2,% 5 CO 2 gecede primer kültürlerinde oluşturulması. </li><li> Gecelik inkübasyon sonrasında rezidüel yapışmaz kırmızı kan hücreleri çıkarmak için PBS ile yoğun tabakları yıkamak. Ortaya çıkan hücre popülasyonlarının adipoz-kaynaklı stromal hücrelerdir. </li><li> 37 ° C/21% O 2,% 5 CO büyüme ortamı içinde 2 spontan farklılaşma önlemek için alt-konfluent düzeyde hücreleri koruyun. Hücreler genellikle% 50 izdiham kaplama yaparken düzenli büyüme ortamı her üç dört gün ayırmak gerekir. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. İskele Hazırlık <ol><li> Diş Hekimliği Fakültesi - İskelelerin California Üniversitesi&#39;nden Dr Min Lee, Los Angeles tarafından yapılmıştır. </li><li> PLGA iskeleleri çözücü ve bir döküm parçacık süzme işlemi ile 85/15 poli (laktik-ko-glikolik asit) (doğal viskozite = 0,61 dl / g arasında, Birmingham Polimerler) imal edilmiştir. </li><li> PLGA / kloroform çözümleri% 92 gözeneklilik (hacim fraksiyonu) ve teflon kalıp içinde ince tabakalar halinde sıkıştırılmış elde etmek için 200-300 mikron çaplı sukroz ile karıştırılmıştır. </li><li> Gecede dondurularak kurutulduktan sonra, iskelelerinin sakaroz çözmek için çift distile (dd) H 2 O üç değişiklik dalmış edildi ve nazikçe ince uçlu spatula ile teflon plaka kaldırıldı. </li><li> Parçacık süzme sonra, tüm iskeleleri GKD 2 O. üç kez durulama ile takip 30 dakika her biri için en az% 50,% 60 ve% 70 etanol içinde daldırma ile dezenfekte edildi </li><li> Tüm iskeleleri bir laminer akış kaputu altında kurutuldu. </li><li> Sonra iskele imalat, scaffolds apatit ile kaplanmıştır. <ol class="ualpha"><li> SBF (yapay vücut sıvısı) solüsyonu insan kan plazması 5 zamanlardı iyon konsantrasyonları ile hazırlanmıştır. Tüm çözümler bir 0.22 mikron PES membran (Nalgene) süzüldü steril edildi. Hemen kaplama işlemi öncesinde, PLGA iskeleleri ıslatma ve kaplama bütünlüğü geliştirmek için kızdırma deşarj, argon plazma aşındırması (Harrick Bilimsel) tabi tutuldu kurutulur. </li><li> Kabartma PLGA iskeleleri daha sonra 37 SBF inkübe edildi ° Mg 2, ardından 12 saat boyunca bir su ceketli kuluçka makinesi içinde C, + ve HCO 3-37 az 12 saat boyunca serbest SBF 2 ° C&#39;de hafif karıştırma altında. </li><li> Kaplamalı PLGA iskelelerinin bir laminer akış kaputu kurutulur ve% 70 etanol ile dezenfekte aşırı sodyum klorür çözeltisi yıkayacak steril GKD 2 O ile nazikçe yıkandı. </li><li> Apatit kaplama bütünlüğü taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile analiz edildi. Apatit kaplı scaffolds SEM saplamaları (Ted Pella) üzerine monte edilen ve iletkenliğini artırmak için karbon ile kaplanmıştır. Ikincil elektron modu SEM (FEI / Phillips XL-30) gözlem sırasında uygulandı. Enerji dağılım X-ışını spektrumu apatit yapıları elementel bileşimi onaylamak için elde edilmiştir. </li></ol></li></ol> 3. Hücre Seeding <ol><li> Alt-izdiham düzeyleri ulaşan üzerine, PBS (x2) ile hücrelerin yıkayın ve Trypsinize. </li><li> Tohumlama için ölçmek hücreleri hesaplama </li><li> 1,5 x 10 5 hücre ile pre-cut 4.0 mm çaplı iskeleleri üzerine Tohum. <ol class="ualpha"><li> 96-kuyulu plakanın bir kuyu içine yerleştirin bireysel yapı iskelesi </li><li> Ortam 20 ul başına yaklaşık 1.5 x 10 5 hücrelerinin bir konsantrasyon ile normal büyüme ortamı içinde yeniden askıya hücrelerin </li><li> 30 dakika süreyle hücre kültürü inkübatör içine Pipet 20 doğrudan iskele üzerine ul ve yer. </li><li> 30 dakika sonra, ortam 200 ul ekle ve hücreler inkübe edincerrahi iskele bir gecede önce </li><li> Bu hücrelerin yeterli sayıda tohumlu olarak iskele üzerine hücre yapışma çoğunluğu iskele üzerine takmak sağlayacaktır sağlamak için gerekli değildir. Bu biyolüminesans ve histolojik analizi ile in vivo laboratuarımızda onaylanmıştır. </li></ol></li></ol> 4. Kalvaryum Hataları ve Vivo Ekiminde oluşturulması <ol><li> Uyutmak yetişkin (60 günlük yaşta) anestezik kokteyl ile CD-1 çıplak farelerin. (Ketamin / xylazine / Acepromazine)% 50 konsantrasyonda (% 0.9 NaCl ile 1:1 seyreltme) veya kurum protokolleri başına önerilen anestezik rejime başına. HASCs bir immun reaksiyona neden olmayacak şekilde bu fareler atimik vardır. <ol class="lalpha"><li> Dozaj: Ketamin hidroklorid (80 mg / kg), bir Xylazine (2.5 mg / kg) Acepromazine (2.5 mg / kg) </li><li> Etki süresi: yaklaşık 30 dakika </li></ol></li><li> Cerrahi hayvan asmak ve cerrahi sterilizebetadin ve alkol (x3) ile site ve önceki sağ parietal kemiğin açığa hayvanın derisi bir orta hat sagital insizyon yapma merhem ile fare gözlerinizi kapayın. Künt kazıma (Şekil 1B) ile sağ parietal kemik pericranium çıkarın. </li><li> Steril bir elmaslı trepan matkap ucu kullanarak doğru olmayan sütür ilişkili paryetal kemikte tek taraflı 4 mm tam kat defekt oluşturun. Extreme dikkatli fare kalvaryal kalınlığı gibi altta yatan duramater (Şekil 1B) rahatsız etmemek için dikkat edilmelidir &lt;.3 mm. </li><li> Takılmadan önce, orta-türevi büyüme faktörü transferini önlemek için steril PBS ile iskelelerinin yıkayın. </li><li> Defekt içine iskele yerleştirin. </li><li> Son olarak, cilt kapatıldı sütür ve kurulan postoperatif protokoller başına hayvan izlemek. </li><li> Post-operatif-örneğin gerektiği gibi hayvan bakım protokolleri yönettiği olarak kurulmuştur analjezi kullanın. Buprenorfin 0.1 mg / kg. </li></ol> 5. Osteoid Oluşumu Kantitasyonu <ol><li> MikroBT fare yapıldıktan sonra, üç-boyutlu bir görüntü daha önce tarif edildiği gibi 1 MicroView yazılımı kullanılarak yeniden inşa edildi. </li><li> Adobe Photoshop kullanarak, görüntülerin standart bir yüksekliğe büyüklükte. </li><li> Sihirli Değnek özelliğini kullanarak, piksel kalvaryal kusuru ölçüldü. </li><li> Kusur yüzdesi şifa sonraki CT taramaları kalvaryal defekt alan ölçme ve piksel sayısının belirlenmesi ve orijinal defekt en piksel sayısına bölünmesiyle tespit edildi </li><li> MikroBT kullanılamaz Sonuç olarak, eğer bir alternatif Adobe Photoshop kullanarak ve histoloji için belirlenen zaman noktalarında kalvaryal hasat edilir. </li><li> Osteoid oluşumu ifade Anilin Mavisi ve pentakrom gibi histolojik boyalar kullanarak, defekt açıklığı boyunca birden çok bölüm lekeli olmalıdır </li><li> Adobe Photoshop, olmayan tüm alanları kırpma kullanmakalvaryal defekt </li><li> Sihirli değnek özelliğini kullanın ve defekt alanındaki de novo kemik formasyonu piksel numaraları belirlemek ve denetimleri veya diğer değişkenlere karşılaştırın. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Yağ dokusu klinik uygulama için progenitör hücrelerin üretimi hayati bir rol hizmet etmek için bir potansiyele sahiptir. Yağ dokusu minimal morbidite ve mortalite içeren nispeten basit bir prosedür içinde hasat edilebilir bir hazır kaynağı olduğunu benzersiz bir avantaja sahiptir. Dokusu hasat edilir ve toplanır başladığında, protokol Şekil 2 &#39;de belirtilmiştir. Yağ-kaynaklı stromal hücreler bir çamaşır adım serisi, kollajenaz sindirim ve santrifüj yoluyla izole edilmiştir. Hücre kültürü içinde kaplanır sonra, bunlar, genişletilmiş, in vitro çeşitli protokoller farklılaşma içine yerleştirilmiş, ya da in vivo doğrudan yerleştirilebilir. C4 mm kritik boyutlu kalvaryal defekt reation bizim adipoz-kaynaklı stromal hücrelerin osteojenik farklılaşma yeteneğini test etmek vivo modelde bir kolay erişilebilir ve tekrarlanabilir sağlar. MikroBT kullanımı sayesinde, biz in vivo iskelet doku oluşumunu takip ve müdahalelerin ilerleme (Şekil 3) takip edebiliyoruz. Kritik boyutu kalvaryal kusur hayvanın yaşam süresi içinde iyileşme olmaz ve defekt kabaca 90% 8 hafta civarında patent kalır bakın. Iskele kendisi (tartışmaya bakınız) osteojenik indüktif özellikleri vardır ve bazı kemik rejenerasyonu teşvik etmek yeteneğini göstermiştir. Hücre içermeyen iskele yerleştirme tipik sonuçlar kusur yaklaşık üçte biri 8 hafta de novo kemik formasyonuna sahip olacağını göstermektedir. Iflkenlerin olsa adipoz-kaynaklı stromal hücrelerin güçlendirme ile tam kusur üçte iki veya daha fazla 8 hafta civarında kemik rejenerasyonu gösterecektirHer hayvan ve cerrahi arasındaki ility. İskelet doku oluşumu histoloji yoluyla ölçülebilir ve tipik sonuçları Anilin Mavisi ve pentakrom boyanma (Şekil 3C) yoluyla TSK ile örneklerinde artmış osteoid oluşumu göstermek olabilir. Buna ek olarak, (Şekil 3D), implante edilmiş insan hücre kalvaryal kusur olarak de novo kemik oluşumu alan yakın 2 hafta sonra in vivo olarak boyanması göstermek GFP-etiketli hASCs kullanımı ile alt de novo kemik oluşumuna katkıda bulunduğunu göstermektedir . Buna ek olarak, hatanın alan (Şekil 3E) insan hücre hayatta kalma ve katkı göstermek için insan spesifik antikor ile immünohistokimyasal kullanır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig1.jpg" /> Şekil 1 A -. Lipoaspirate iki katmandan oluşmaktadır. Üst tabaka adipositler ve pr çoğunluğu içeriralt tabaka lipoaspiration işlem sırasında kullanılan salin içeren süre hücresel malzeme ocesses. B - yatan duramater kesinti olmadan sağ parietal kemik, bir 4 mm kritik büyüklükte kalvaryal defekt sonraki yaratılması izole pericranium üzerinde orta hat insizyonla kalvaryal defekt oluşturulması. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4221/4221fig2.jpg" /> Şekil 2. Kendi genişleme, farklılaşma ve in vitro ve in vivo kullanıma adipoz-kaynaklı stromal hücrelerin izolasyonu gelen lipoaspirate ve hasat ve uygulama genel bakış. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig3.jpg" /> Şekil 3,. Bir hyd yoluyla TSK uygulaması ile önemli boyut kalvaryal kusur in vivo iyileşme gösteren bir-mikroBTroxyapatitie iskelesi (Alt Satır). ASC grubunda anlamlı bir artış iyileşme gösteren mikroBT gelen kemik iyileşmesiyle Kantitasyonu - Kontroller hücreleri (Orta Sıra) Yatak olmadan iskele yerleştirme ile hiçbir iskele ve defekt (Üst satır) ve kusur vardır. C - Histoloji Anilin Mavisi ve pentakrom boyama yoluyla ASC grubu (alt satır) artmış osteoid oluşumu gösteren. Anilin Mavi için, osteoid lekeler koyu mavi ve pentakrom, osteoid lekeler sarı için. D - GFP etiketli hASCS bir iskele üzerine tohumlandıklarında ve yerleştirilen bir kalvaryal defekt içine ve 2 hafta sakrifiye edildi. Boyama kusur alanında yenilenme katkı insan hücrelerini gösteren bir GFP etiketlenmiş antikor ile yapıldı. E -. 2 hafta defekt alanında insan hücreleri yaygınlık gösteren İnsan nükleer antijen immünhistokimya <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4221/4221fig3large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol><li>Levi, B., James, A. W., Nelson, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose-derived+stromal+cells+heal+critical+size+mouse+calvarial+defect%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human adipose-derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defect.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Zuk, P. A., Zhu, M., Ashjia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).</li>
<li>Keefe, M. S., Keefe, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+the+effectiveness+of+different+techniques+for+intraoperative+antibiotics+into+alloplastic+implants+for+use+in+facial+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Facial+Plastic+Surg%22%5BJournal%5D)">An evaluation of the effectiveness of different techniques for intraoperative antibiotics into alloplastic implants for use in facial reconstruction.</a> Arch Facial Plastic Surg. 11, 246-251 (2009).</li>
<li>Mitchell, J. B., McIntosh, K., Zvonic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotype+of+human+adipose-derived+cells%3A+Temporal+changes+in+stromal-associated+and+stem+cell-associated+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immunophenotype of human adipose-derived cells: Temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers.</a> Stem Cells. 24, 376-385 (2006).</li>
<li>Dominici, M., Blanc, K. L. e, Mueller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stroma+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stroma cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).</li>
<li>Cowan, C. M., Shi, Y. Y., Aalami, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+calvarial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size calvarial defects.</a> Nat Biotechnol. 22, 560-567 (2004).</li>
<li>Levi, B., Nelson, E. R., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dura+mater+stimulates+human+adipose-derived+stromal+cells+to+undergo+bone+formation+in+mouse+calvarial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects.</a> Stem Cells. 29, 1241-1255 (2011).</li>
<li>Phipps, M. C., Clem, W. C., Catledge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+responses+to+bone-mimetic+electrospun+matrices+composed+of+polycaprolactone%2C+collagen+I+and+nanoparticulate+hydroxyapatite%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells responses to bone-mimetic electrospun matrices composed of polycaprolactone, collagen I and nanoparticulate hydroxyapatite.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Yuan, H., Zang, Z., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoinduction+by+calcium+phosphate+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci.+Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Osteoinduction by calcium phosphate biomaterials.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 9, 723-726 (1998).</li>
<li>Wei, G., Jun, Q., Giannobile, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enchancement+of+osteogenesis+by+nano-fibrous+scaffolds+incorporating+rhBMP-7+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The enchancement of osteogenesis by nano-fibrous scaffolds incorporating rhBMP-7 nanospheres.</a> Biomaterials. 28, 2087-2096 (2007).</li>
<li>Li, C., Verpari, C., Jin, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+silk-BMP-2+scaffolds+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 27, 3115-3124 (2006).</li>
<li>Zhang, Y., Fan, W., Nothdurft, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+evaluation+of+adenovirus+combined+silk+fibroin+scaffolds+for+bone+morphogenetic+protein-7+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo evaluation of adenovirus combined silk fibroin scaffolds for bone morphogenetic protein-7 gene delivery.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17, 789-797 (2011).</li>
<li>Levi, B., Hyun, J. S., Nelson, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-integrating+knockdown+and+customized+scaffold+design+enhances+human-adipose-derived+stem+cells+in+skeletal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Non-integrating knockdown and customized scaffold design enhances human-adipose-derived stem cells in skeletal repair.</a> Stem Cells. 29, 21028-21029 (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Ve izolasyonu yağ olarak türetilmiş lipoaspirate dan stromal hücreleri 2, bu hücrelerin hücre soylarının çeşitli ayrışmıştır edilmiştir. Yağ dokusu mezodermal kökenlerden gelen ve bu nedenle, multipotent adipoz-kaynaklı stromal hücrelerin büyük olasılıkla bir mezodermal soy doğru uygulama ile en etkili olacaktır. İskelet doku oluşturmak için yeteneği verici bir otogreft için siteleri ve enfeksiyon, rejeksiyon ve zaman üzerinde 3 arızaları dahil sentetik malzemenin doğal sınırlamaları sıkıntısı veri...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı: </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Hasat Lipoaspirate </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010-023 </td><td></td></tr><tr><td> Hank Dengeli Tuz Çözeltisi </td><td> Cellgro </td><td> 21-023-CV </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz </td><td> Sigma </td><td> C6885-500MG </td><td></td></tr><tr><td> Hücre Süzgeç 100 mikron </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td><td></td></tr><tr><td> Steri-500 ml .22 mikron filtre </td><td> Millipore </td><td> SCGPT05RE </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Kalvaryum Kusur </td></tr><tr><td> Z500 Fırçasız MicromotorsUM50C </td><td> NSK </td><td> NSKZ500 </td><td></td></tr><tr><td> Dairesel Bıçak 4,0 mm </td><td> Xemax Cerrahi </td><td> CK40 </td><td></td></tr></tbody></table>

lipoaspirate itibaren hasat yağ kaynaklı stromal hücreler kullanarak kritik ölçekli kalvaryum defekt model tamiri

Repair of a Critical-sized Calvarial Defect Model Using Adipose-derived Stromal Cells Harvested from Lipoaspirate

Kraniyofasiyal iskelet onarımı ve yenilenmesi kök hücreleri kullanan bir hücre-temelli bir yaklaşım ile de novo doku oluşumu vaadi sunar. Yağ-kaynaklı stromal hücreler (TSK) osteojenik, kondrojenik adipojenik ve miyojenik farklılaşma geçiren yeteneğine multipotent kök hücrelerin bol bir kaynağı olduğu kanıtlanmıştır. Pek çok çalışma hücresel teslim için çeşitli yapı iskelesi biyomalzemelerin kullanımı ile in vivo olarak bu hücrelerin osteojenik potansiyel araştırdılar. Bu gibi olduğu gösterildi bir osteokondüktif, hidroksiapatit-kaplı poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA-HA) TSK ile iskele tohumlu, bir kritik boyutlu kalvaryal kusur, kendiliğinden geçmesi için kendi yetersizlik ile tanımlanan bir bozukluk kullanılarak , hayvanın ömrü boyunca şifa etkili sağlam kemik rejenerasyon göstermek olabilir. Bu in vivo modelde kemik dokusu yenilenmesine yönelik translasyonel yaklaşım esas göstermektedir - hücreselbileşeni ve biyolojik matrisi. Bu yöntem, bir doku spesifik kusurun tamir yönelik bir projenitör hücre nihai klinik uygulama için bir model olarak hizmet vermektedir.

Bu protokol izolasyonu açıklar adipoz-türetilmiş lipoaspirate ve iskelet rejenerasyon değerlendirmek için 4 mm kritik ölçüdeki kalvaryal defekt oluşturmadan stromal hücreler.

Lipoaspirate itibaren hasat Yağ kaynaklı stromal hücreler kullanarak Kritik ölçekli Kalvaryum Defekt Model tamiri

Kraniofasiyal iskelet onarımı ve rejenerasyonu, kök hücrelerin kullanıldığı hücre tabanlı bir yaklaşım aracılığıyla de novo doku oluşumu vaadi sunmaktadır. ...

Bu prosedürün genel amacı, bir farede in vivo kalvaryal defekt modeli kullanarak osteojenik diferansiyasyon amacıyla adipöz dokudan multipotent stromal hücreleri toplamaktır. Bu işlem, öncelikle liposuction prosedürü sonrası elde edilebilen adipöz dokunun stromal vasküler tabakasından progenitör hücrelerin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, üç boyutlu bir iskelet hazırlamak ve ardından hücreleri bu iskale ekmektir.Son adım, iskele ve hücrelerin yerleştirileceği bir sıçan modelinde kritik boyutlu bir kalvarial defekt oluşturulmasıdır. Nihayetinde sonuçlar, adipoz dokudan izole edilen multipotent stromal hücrelerin in vivo iskelet rejenerasyonu potansiyeline sahip olduğunu göstermektedir. İskelet rejenerasyonu için mevcut doku yetersizliği nedeniyle, bu tekniğin uygulamaları geniş bir klinik uygulama spektrumuna sahiptir.Otojen kemik greftleri altın standart olsa da, donör bölge eksikliği ve donör bölge morbiditesi bu seçeneği sınırlamaktadır. Allogreftler ve yabancı materyaller kullanılabilmektedir ancak bunlar maliyet, zayıf entegrasyon ve potansiyel enfeksiyon riskleri nedeniyle sınırlıdır.Skeletal doku mühendisliği için progenitor hücrelerin izolasyonunda adipoz veya yağ dokusunun olası kullanımı heyecan vericidir. Prosedürü, long anchor laboratuvarından ben ve Michael Chungle göstereceğiz. İlk olarak, elektif lipo aspirasyon işlemlerinden insan subkutan adipoz dokusu elde edin.Lipoaspirattaki iki tabakayı fark edin. Üst faz, hücresel materyalin büyük çoğunluğunu içerir. Alt tabaka ise çoğunlukla enjekte edilen salindir.Adipoz kaynaklı stromal hücreler her iki katmandan da toplanabilir, ancak verim süpernatanttan çok daha yüksektir. Stromal vasküler fraksiyonu veya SVF'yi izole etmek için, lipo aspiratı önce eşit hacimlerde bir x fosfat tamponlu salin veya %2,5 Betadine içeren PBS ile kapsamlı bir şekilde yıkayın, ardından Betadine içermeyen bir x PBS ile eşit hacimde aspiratla tekrar yıkayın. Yıkama işleminin çökelmesine izin verin.İşlenmiş insan dokusu ile kontaminasyonu önlemek için işlem boyunca steril tekniği koruduğunuzdan emin olun. Ardından, her yıkamadan sonra alt tabakayı aspire edin ve atın, sonra 15 mililitre adipoz dokuyu 50 mililitrelik Falcon konik tüplere aktarın. Daha sonra adipoz dokuyu 15 mililitre filtrelenmiş %0,075'lik filtre ile digeste edin.Tip iki kollajenazı, Hank dengeli tuz çözeltisi veya HBSS içinde, 37 °C sıcaklıktaki bir su banyosunda, sabit ajitasyon altında 60 dakika boyunca inkübe edin; tüpleri her 15 dakikada bir havalandırmayı unutmayın. Ardından, enzim aktivitesini %10 fetal bovin serum veya FBS içeren 15 mL PBS ile nötralize edin ve santrifüjleyin. Yüksek yoğunluklu bir SVF peleti elde etmek için; pelet, adipoz kaynaklı kök hücreler ve eritrositlerin bir karışımı olacaktır.Önce üstteki yağ tabakasını, ardından pellet'i bozmadan üstteki sıvı tabakasını uzaklaştırın. Pellet'i 10 mililitre geleneksel büyüme medyumunda yeniden süspande edin. Daha sonra üç tüpü, 100 mikronluk bir filtre aracılığıyla tek bir temiz 50 mililitrelik konik tüpte birleştirin ve santrifüjleyin.Çökelti yerinden oynamadan süpernatantı uzaklaştırın ve ardından çökeltiyi yeniden süspande edin. Beş mililitrelik geleneksel büyüme ortamında, her bir 10 santimetrelik plaka için iki adet 50 mililitrelik konik tüp veya bir adet 15 santimetrelik plaka için beş adet beş mililitrelik konik tüp birleştirin. Birincil kültürleri 37 °C'de, %21 oksijen ve %5 karbondioksit altında gece boyunca oluşturun.Gece boyu inkübasyondan sonra, yapışmamış kalıntı eritrositleri uzaklaştırmak için plakaları PBS ile yıkayın. Ortaya çıkan hücre popülasyonları adipoz kaynaklı stromal hücrelerdir. Spontan diferansiyasyonu önlemek için hücreleri sub-konflüen seviyelerde tutun.37 °C, %21 oksijen ve %5 karbondioksit koşullarında. Büyüme ortamında, hücrelerin genellikle her üç ila dört günde bir standart büyüme ortamında pasajlanması gerekir. %50 konfluens düzeyinde ekildiklerinde, iskeleyi ekteki makalede açıklandığı şekilde hazırlayın.Hücreler sub-konflüans seviyelerine ulaştığında, hücreleri iki kez PBS ile yıkayın ve tripsinize edin. Hücre miktarını belirlemek için sayım yapın. Ekim işlemi için, önceden kesilmiş 4 mm çapındaki iskelelere 1,5 x 10⁵ hücre ekmeye hazırlanın.96 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna tek bir iskela yerleştirin, ardından hücreleri, 20 µL besiyeri başına yaklaşık 1,5 × 10⁵ hücre konsantrasyonunda standart büyüme besiyeri ile yeniden süspande edin. 20 µL çözeltiyi doğrudan iskelanın içine pipetleyerek ekim yapın ve bunu 30 dakika boyunca hücre kültürü inkübatöründe bekletin.30 dakika sonra, 200 µL medya ekleyin ve hücrelerin iskele üzerinde gece boyunca inkübe edilmesine izin verin. Cerrahi işlem öncesinde, ekim aşamasındaki gibi hücrelerin iskeleye yapıştığından emin olmaya gerek yoktur. Yeterli sayıda hücre, çoğunluğunun iskeleye tutunmasını sağlayacaktır.60 günlük yetişkin bir CD one nude fare anestezi edildikten sonra, cerrahi bölgeyi üç kez Betadine ve alkol ile sterilize edin ve farelerin gözlerine kayganlaştırıcı sürün. Ardından, sağ paryetal kemiği açığa çıkarmak için farenin kafa derisinde orta hat boyunca sagittal bir insizyon yapın. Periostu, sağ paryetal kemikten künt sıyırma yöntemiyle temizleyin.Ardından, sağ non-sütür ilişkili parietal kemikte tek taraflı dört milimetrelik tam kat bir defekt oluşturun. Fare kalvaryum kalınlığı implantasyon öncesinde 0,3 mm'den az olduğu için, elmas kaplı dişli matkap ucu kullanırken alttaki dura mater'e zarar vermemeye son derece dikkat edin. Besiyeri kaynaklı büyüme faktörlerinin transferini önlemek için iskeleleri steril PBS ile durulayın.İskele yapısını defekt bölgesine yerleştirin. Son olarak, cildi sütürle kapatın ve hayvanı belirlenmiş postoperatif protokollere göre izleyin. Fareye mikro CT uygulayın ve microview yazılımını kullanarak 3D yeniden yapılandırılmış bir görüntü elde edin.Görüntüleri standart bir yüksekliğe getirmek için Adobe Photoshop kullanın. Genellikle, kafa tası rejenerasyonu için her iki haftada bir ölçüm yaparız. Fareler, uzun süreli takip için tarama sırasında anestezi altına alınır ve nihayetinde itlaf edilirler.Histolojik analiz için, kalvaryum defektinin piksellerini ölçmek amacıyla sihirli değnek özelliğini kullanın. Defektin iyileşme yüzdesini sonraki BT taramaları ile belirleyin. Kalvaryum defekt alanını ölçüp piksel sayısını belirleyin ve bu sayıyı orijinal defektin piksel sayısına bölün; osteo oluşumu belirtmek için annal in blue ve pen aro gibi histolojik boyalar kullanarak defekt boyunca birden fazla kesiti boyayın.Kafatası defekti dışında kalan tüm alanları kırpmak için Adobe Photoshop'u kullanın ve defekt alanındaki de novo kemik oluşumunun piksel sayılarını belirlemek için sihirli değnek aracını kullanın; ardından bunu kontrollerle veya diğer değişkenlerle karşılaştırın. Burada, adipoz türevli stromal hücrelerin izolasyonundan, genişletilmelerine, farklılaşmalarına ve in vitro ve in vivo kullanımlarına kadar lipo aspiratın hasadı ve uygulamasının genel bir özeti verilmiştir. Alt sırada görülen, hidroksiapatit iskele aracılığıyla ASC uygulaması ile kritik boyutlu kafatası defektinin in vivo iyileşmesini gösteren bir mikro CT görüntüsü yer almaktadır.Üst satırda görülen kontroller, iskelesiz ve defekt durumlarını içermektedir. Orta satır, hücre içermeyen iskelenin yerleştirildiği defek durumunu göstermektedir. Burada gösterilen LS, mikro BT'den elde edilen kemik iyileşmesinin nicelendirilmesidir ve A SC grubunda iyileşmenin anlamlı derecede arttığını göstermektedir.Bu, andal aracılığıyla A SC grubunda artmış kemik oluşumunu gösteren histolojik bir görüntüdür. Mavi renkte ve pen AROM boyaması al için yapılmıştır. Mavi renkte, osteoid pen arom için koyu mavi boyanmıştır.Burada gösterilen sarı renkli osteoid boyamaları, bir iskele üzerine ekilen ve iki hafta sonra sakrifiye edilen, GFP ile markalanmış insan ASC'leridir. Defekt bölgesindeki rejenerasyona katkıda bulunan insan hücrelerini göstermek için GFP markalı bir antikor ile boyama yapılmıştır. Burada, iki haftada defekt bölgesindeki insan hücrelerinin yaygınlığını gösteren insan nükleer antijen immünokimyası sunulmaktadır.Uzmanlaşıldığında, adipoz doku işlemleri dört saat içinde tamamlanabilir ve cerrahi prosedür fare başına yaklaşık 10 dakika sürebilir. Parietal kemiğin yuvarlak, matkap ucunun ise düz olduğunu, bu nedenle dört milimetrelik defektin tüm çevresini delmek için dikkatli olunması gerektiğini unutmamak önemlidir. Beyindeki dura mater'e zarar vermemek için yavaş ilerlemeyi unutmayın.Bu videoyu izledikten sonra, progenitör hücrelerin adipöz dokudan nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Bu hücreleri bir iskeleye ekmeyi ve fareye yerleştirmeyi öğrenin.

repair-critical-sized-calvarial-defect-model-using-adipose-derived

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

İnsan perivasküler kök hücreler (PSC'ler) mezenkimal kök hücreler (MKH) benzer iskelet doku yenilenmesine yönelik yeni bir kök hücre sınıfı vardır. PSC'ler standart bir yağ emme prosedürleri sırasında temin adipoz dokusu FACS (floresans aktive hücre ayırma) yoluyla izole edilebilir, ardından kemik oluşumunu sağlamak için bir osteoendüktif iskelesi ile...

Kemik Rejenerasyon için İnsan perivasküler Kök Hücre kullanın

2001 yılında, UCLA araştırmacılar erişkin kök hücrelerin bir nüfus izolasyon, adipoz dokudan, Yağ elde edilen kök hücreler veya TSK adlandırılan nitelendirdi. Bu makale kolajenazı kullanarak manuel, enzimatik sindirim protokolü kullanılarak lipoaspirates gelen TSK izolasyonunu özetliyor.

İnsan Lipoaspirates den Yağ-türetilen Kök Hücre Manuel İzolasyon

İnsan adipoz kaynaklı stromal hücrelerindeki transkripsiyonel heterojenlik, hücre yüzeyi belirteçleri ve osteojenik genler kullanılarak tek hücre düzeyinde tanımlanabilir.  Bu çalışmada, kraniyofasiyal iskelet rekonstrüksiyonunu arttırmak için kullanılabilecek artmış osteojenik potansiyele sahip hücre alt popülasyonlarının izolasyonu için akış sitometrisi kullanan bir protokol tanımlanmıştır.

İzolasyon ve İnsan zenginleştirilmesi Gelişmiş Osteogenezi için Stromal Hücreleri adipoz-türevi

Yağ kaynaklı kök hücreler (ASCs) kolayca izole ve normal sıçanlar FAT'tan hasat. ASC yaprak hücre sayfalık mühendislik kullanılarak oluşturulabilir ve tam-kalınlık sergilenmesi diyabetik yağlı sıçanlar kusurları maruz kemik ile deri ve suni deri bilayer ile kaplı Zucker içine nakledilmektedir.

Oluşturma ve diyabetik yara iyileşmesi manken bir yağ elde edilen kök hücre (ASC) Sheet nakli

Adipoz kaynaklı stromal hücreler, bir hastanın kendi hücrelerinden yeni doku mühendisliği için yararlı olabilir. Artmış osteojenik potansiyele sahip insan adipoz kaynaklı stromal hücrelerin (ASC'ler) bir alt popülasyonunun izolasyonu için bir protokol sunuyoruz, ardından hücrelerin in vivo kalvarial iyileşme testinde uygulanması izleyeceğiz.

BMPR-IB + hızlı İzolasyon Kalvaryum Hata Şifa Modeli Kullanılan Stromal Hücreleri yağ kaynaklı

Burada, damar oluşumu içinde vivo görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut ve gerçek zamanlı olarak 3D İskele tarafından multiphoton mikroskobu. Genetiği değiştirilmiş iskele anjiogenez bir fare grefti kritik Kemik defekti modelinde incelenmiştir. Daha fazla yeni kan damarları tedavi grubunda denetimlerde tespit edildi.

Angiogenez Multiphoton mikroskobu In Vivo genetiği değiştirilmiş 3D-PLGA/nHAp İskele tarafından grefti kritik Kemik defekti tamir için görselleştirme

Roman Biyomalzeme büyük kemik lezyonlar onarmak için tasarlanmış sayısı sürekli olarak kemik iyileşmesi geliştirmek ve kemik nakli ile ilgili komplikasyonlar aşmak amacı ile genişletiyor. Burada, önceden klinik biyouyumluluk Biyomalzeme kemik onarımı için test edilmesi için çok disiplinli bir strateji mevcut.

Biyolojik uyumluluğu Biyomalzeme kemik rejenerasyon için profil sayfası

Burada, bir Yağ dokusundan elde edilen stromal vasküler fraksiyonu ve osteoartrit olan insan hastalarda kıkırdak benzeri doku Yenileyici tarafından diz işlevlerini geliştirmek için uygulama üretmek için bir protokol mevcut.

Yağ dokusundan elde edilen Stromal vasküler kesir için potansiyel kıkırdak rejenerasyon üreten klinik protokol

Burada, stromal vasküler kesir emülsifikasyon ve birden çok centrifugations kapsayan mekanik işlemler bir dizi Yağ dokusundan elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Lipoaspirates mekanik mikronize rejeneratif Terapisi için

Sıçanlarda kalvarial sütür-kemik kompozit defektlerinin ayrıntılı cerrahi prosedürlerini ve modelin kısa ve uzun vadeli prognozlarını araştırıyoruz. Sütür rejeneratif tedaviler geliştirmek için standart bir model oluşturmayı amaçlıyoruz.

Sıçanlarda Kalvarial Sütür-Kemik Kompozit Defektlerinin Saptanması: Sütür-Rejeneratif Tedavi İncelemesi İçin Standart Bir Model

Öğrenin yağ dokusundan çok potansiyelli stromal hücre izolasyonu ve kritik boyutlu kafatası defekt modelinde osteojenik farklılaşma değerlendirmesi. Bu yöntem iskelet rejenerasyonu için umut vadeden bir doku mühendisliği yaklaşımı sunar.

Lipoaspirate itibaren hasat Yağ kaynaklı stromal hücreler kullanarak Kritik ölçekli Kalvaryum Defekt Model tamiri

Daha fazla video keşfet